SPERIMENTAZIONE PRECLINICA

La ricerca di un nuovo farmaco nasce dall’ESIGENZA MEDICA, che, a sua volta, deriva da:

- INSODDISFAZIONE TERAPEUTICA (ad es.: un trattamento non efficace);

- BISOGNO TERAPEUTICO (ad es.: trovare nuovi farmaci per l’AIDS).

Tappe principali:

1. Caratterizzare la patologia in esame;

2. Capire quali sono i recettori implicati nella sua patogenesi;
3. Capire il ruolo della loro attivazione/inibizione dell’evoluzione della patologia;
4. Caratterizzare il recettore;
5. Costruire molecole adatte ad interagire con il recettore, che potranno attivare quest’ultimo
(agonisti) oppure interagire con esso senza produrre attività (antagonisti);
6. Si sintetizzano i nuovi composti;
7. Si fanno test in vitro, test di teratogenicità (sugli animali da laboratorio), test di mutagenicità e test
di cancerogenicità;
8. Formulazione e sintesi su larga scala, per testare la sicurezza della molecola nell’animale;
9. Si sottopongono i dati all’AIFA;
10. (se c’è approvazione) sperimentazione sull’uomo (studi clinici).

Gli studi CLINICI si articolano in 5 fasi:

 FASE 0: su 10-15 volontari sani, con dosi bassissime di farmaco. Serve ad ottenere dati
 preliminari circa la farmacocinetica.
 FASE I: su volontari sani (20-80 soggetti). Serve a valutare sicurezza e tollerabilità del farmaco.

 FASE II (IIa e IIb): su 200-800 pazienti. Si valuta l’efficacia del farmaco e lo si confronta con il
placebo. Si cerca di stabilire la dose efficace. (E’ la fase in cui la maggior parte degli studi vengono
bloccati!!!)

 FASE III (IIIa e IIIb): si reclutano circa 3000 pz. Sono studi MULTICENTRICI e spesso
MULTINAZIONALI, così da tener conto anche delle differenze genetiche tra i vari individui, il che
è importante per poter vedere se il farmaco ha degli effetti collaterali.
 
 (in teoria) il farmaco viene COMMERCIALIZZATO.
 FASE IV (FARMACOVIGILANZA o FARMACOSORVEGLIANZA): importantissima in quanto consente di
evidenziare effetti collaterali che non erano emersi durante le fasi precedenti. Laddove dovessero
emergere effetti collaterali di un certo peso, il farmaco può anche essere ritirato dal commercio.

L’intero iter ha una durata di circa 14,9 anni, e i costi sono molto elevati.

STUDI FARMACOLOGICI DI I LIVELLO

Scopo: VALUTARE L’ATTIVITA’ DELLA NEM (nuova entità molecolare) IN MODELLI SPERIMENTALI CHE
RIPRODUCANO LA PATOLOGIA IN ESAME.

I modelli sperimentali per definire il profilo farmacologico di un composto possono essere valutati a 3
livelli:

1. MOLECOLARE: si valutano il LEGAME RECETTORIALE e le ATTIVITA’ ENZIMATICHE;

2. CELLULARE: con COLTURE CELLULAARI e su TESSUTI ISOLATI (ed es.: cuore, polmone,
utero, etc.);
3. MODELLI ANIMALI: con ANIMALI NORMALI (ratto, topo, cane, gatto, coniglio, cavia, maiale)
ed ANIMALI CHE RIPRODUCONO LA MALATTIA (animali geneticamente modificati).

A cura di Mariachiara Ferrandino

  MODELLI CELLULARI:

a. CELLULE UMANE NEOPLASTICHE: sono facili da usare perché crescono
rapidamente ed è difficile ucciderle “in blocco”, pertanto sono il primo
modello utilizzato, dopo di che si passa a quelli più complessi;
b. COLTURE CELLULARI PRIMARIE: cellule derivanti da tessuti animali (epatociti,
neuroni, cardiomiociti, etc.);
c. CELLULE TRANSFETTATE CON PROTEINE “BERSAGLIO” DEL FARMACO OGGETTO
DI STUDIO: tali cellule fungono da “contenitori” in cui viene inserita
questa molecola verso cui è attivo il farmaco.

Su devono usare animali diversi a seconda dello studio che si sta conducendo e della
risposta che si vuole ottenere (ad es.: per studi sul SNC si usano i topi e i ratti,
mentre per studi sul sistema cardiovascolare si usano i beagle).

 MODELLI ANIMALI:

a. ANIMALI TRANSGENICI: ovvero animali in cui è stato aggiunto un gene
ESOGENO normale o mutato e lo si è fatto esprimere in uno specifico tessuto;
b. ANIMALI KNOK-OUT: ovvero animali in cui specifici geni sono stati mutati
o completamente inattivati.

STUDI FARMACOLOGICI DI II LIVELLO

Scopo: iniziale esplorazione della TOSSICITA’ D’ORGANO, determinare le PROPRIETA’

FARMACOCINETICHE della NEM, studiare PERMEABILITA’ e INTERAZIONI con i citocromi e con altri
farmaci/proteine plasmatiche/altri enzimi.

Gli studi possono essere condotti in vivo, in vitro e in silico (bioinformatica), e servono a valutare l’ADME.

Ad ogni modo, gli studi più importanti sono quelli relativi alla tossicità della NEM, e, in particolare,
si valutano:

  TOSSICITA’ ACUTA;
  TOSSICITA’ SUBACUTA;
  TOSSICITA’ CRONICA;
  AZIONI SULLA FERTILITA’;
  MUTAGENESI e CANCEROGENESI;
 TERATOGENICITA’.

LA SCELTA DEL MODELLO DIPENDE DAL TIPO DI PATOLOGIA DA TRATTARE.

Obiettivi degli studi tossicologici: definire la DOSE MASSIMA CHE NON INDUCE ALCUN EFFETTO TOSSICO
diretto o indiretto su organi e sistemi, definire la DOSE MINIMA CHE INDUCE EFFETTI TOSSICI e il TIPO di
alterazioni indotte, definire la RELAZIONE TRA DOSE TERAPEUTICA E DOSE TOSSICA, individuare il
BERSAGLIO dell’effetto tossico del composto e dei suoi metaboliti, e definire SE GLI EFFETTI SONO O
MENO REVERSIBILI.

INDICI DI SICUREZZA:

 NOAEL (NO OBSEVABLE ADVERSE EFFETC LEVEL): DOSE MASSIMA DI FARMACO CHE,

SOMMINISTRATA RIPETUTAMENTE NELL’ANIMALE, NON GENERA EFFETTI AVVERSI. Una volta
identificato questo valore, si useranno dosi ancora più basse per ridurre ulteriormente i rischi.

A cura di Mariachiara Ferrandino

  HED (HUMAN EQUIVALENCE DOSE): DOSE BIOEQUIVALENTE NELL’UOMO. Si estrapola dal NOAEL e
viene calcolato nella specie animale più sensibile. Serve a stabilire la dose da usare nell’uomo negli
studi clinici.

PROVE DI TOSSICITA’ ACUTA

Obiettivo: caratterizzare gli EFFETTI di SINGOLE DOSI di farmaco di entità crescente, fino ad osservare la
MORTALITA’ DEGLI ANIMALI.

Gli animali vengono divisi in gruppi, ognuno dei quali riceve una dose diversa di farmaco, fino a quando
non si osserva la mortalità del 50% di un gruppo (ergo, si stabilisce la LD50, cioè la Dose Letale 50, definita
come la SINGOLA DOSE DI FARMACO CHE DETERMINA LA MORTALITA’ DEL 50% DEL GRUPPO).

La LD50 viene ricavata statisticamente.

Variabili da tenere in considerazione: età, sesso, specie, condizioni di stabulazione, via di somministrazione.

Per quanto riguarda le dosi da usare si procede per tentativi.

Si vanno a determinare:

- Segni clinici di tossicità (incuse le variazioni dei parametri biochimici);

- Mortalità a determinati livelli;
- Esame autoptico degli animali deceduti;
- Esami istopatologici degli animali sacrificati.

N.B.: usiamo la LD50 per calcolare l’IT (INDICE TERAPEUTICO) del farmaco (IT = LD50/ED50), che esprime la
maneggevolezza di un farmaco.

PROVE DI TOSSICITA’ SUBACUTA

Obiettivi: valutare gli EFFETTI di DOSI RIPETUTE che simulano un uso prolungato nell’uomo, ed
identificare l’ORGANO PIU’ SENSIBILE alla tossicità della NEM.

Si usano sempre gli stessi animali, ma stavolta le somm. sono ripetute.

L’ideale sarebbe somministrare TRE DOSI:

- BASSA: dose con tossicità pari a zero;

- INTERMEDIA: dose con tossicità lieve;
- ELEVATA: dose con il 10% di mortalità.

Si vanno a determinare:

- Peso corporeo dell’animale;

- Consumo di cibo;
- Comportamento e stato di salute dell’animale;
- Parametri ematologici, biochimici ed urinari;
- Valutazioni istopatologiche.

N.B.: la DURATA delle osservazioni non deve essere superiore al 10% della durata media della vita
dell’animale (ad es.: 3 mesi per i roditori, 1 anno per cani e scimmie).

A cura di Mariachiara Ferrandino

PROVE DI TOSSICITA’ CRONICA

Obiettivi: valutare gli EFFETTI di DOSI RIPETUTE che simulano un uso prolungato nell’uomo e determinare
la TOSSICITA’ D’ORGANO per esposizioni al farmaco di durata compresa tra 6 mesi e 2 anni.

La principale differenza con le prove di tossicità subacuta è la durata delle somministrazioni, infatti
in questo caso la durata è standard (3-12 mesi).

Si utilizzano dosi sempre maggiori per valutare la tossicità:

- DOSE MAGGIORE: dose che produce segni di tossicità;

- DOSE MINORE: è da 2 a 10 volte superiore a quella giornaliera prevista per l’uso terapeutico e
ben tollerata;
- DOSE INTERMEDIA: dose minima capace di indurre il primo chiaro effetto tossico.

Si cerca di utilizzare dosi PIU’ ALTE di quelle che si sanno essere tossiche, per esplorare al meglio la
tossicità della molecola.

Il RISCHIO TOSSICOLOGICO si valuta con l’indice MRDS (MAXIMUM RECOMMENDED SAFE DOSE), cioè la
MASSIMA DOSE TOLLERATA E CONSIDERATA SICURA (si calcola dividendo la HED per un fattore di sicurezza.
Minore è il valore ottenuto, più la molecola è tossica).

AZIONI SULLA FERTILITA’

Obiettivo: evidenziare MODIFICHE DELLA FERTILITA’ o una PROCREAZIONE ANOMALA PER ALTERAZIONE DEI
GAMETI, INTERFERENZE CON IMPIANTO E SVILUPPO DEL FETO, EFFETTI TOSSICI SU EMBRIONE E FETO.

Si usano ratti e conigli.

Si somministrano dosi della NEM ad animali maschi e femmine per lunghi periodi prima
dell’accoppiamento, per poi valutarne l’INDICE DI FERTILITA’ (se risulterà ridotto, lo studio
viene bloccato!!!).

Si usano 4 gruppi di animali:

1. Maschi e femmine ricevono il farmaco;

2. Solo i maschi ricevono il farmaco;
3. Solo le femmine ricevono il farmaco;
4. Maschi e femmine ricevono il placebo.

MUTAGENESI

I test di mutagenesi consistono in:

- TEST DI MUTAZIONE GENICA SU BATTERI (TEST DI AMES);

- TEST DI MUTAZIONE GENICA IN UN SISTEMA EUCARIOTICO IN PRESENZA O MENO DI
INDUTTORI DEL METABOLISMO;
- TEST DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA IN COLTURE DI CELLULE DI MAMMIFERO;
- TEST IN VIVO DI DANNO GENETICO.

Test di Ames: si usano colture che non sopravvivrebbero in assenza di un substrato (ad es.: si usano le
Salmonelle, che non sopravvivono senza Triptofano esogeno) e si aggiunge la NEM. Se la coltura
sopravvive anche in queste condizioni, significa che la NEM ha indotto delle mutazioni, per cui non può
essere usata nell’uomo.

A cura di Mariachiara Ferrandino

LIMITE del test: è condotto su BATTERI, per cui non riproduce fedelmente quello che potrebbe accadere
in una cellula eucariotica.

TEST DI CANCEROGENICITA’

Obiettivo: registrare l’INCIDENZA DI TUMORI, soprattutto maligni, e registrare il PERIODO DI

LATENZA (tempo intercorso tra la somministrazione del farmaco e la comparsa del tumore).

Durata: 18-24 mesi, a seconda della specie considerata (18 mesi per il topo e 24 per il ratto).

Si scelgono animali di ALMENO 2 SPECIE, generalmente si usano 100 animali divisi in 2 gruppi.

Si somministrano dosi giornaliere di farmaco, con la stessa via di somm. che si vuole usare nell’uomo, e
si deve documentare l’assorbimento del farmaco.

Dosi scelte:

- DOSE MASSIMA: dose che esplica ALMENO 1 EFFETTO TOSSICO oppure mostra una
TOSSICITA’ MINIMA A LIVELLO DI UN ORGANO BERSAGLIO (si cerca di usare dosi che già si
sanno essere tossiche, per capire se dosi ancora maggiori possono dare cancerogenesi);
- DOSE MINIMA: deve essere pari ALMENO AL DOPPIO O AL TRIPLO DELLA DOSE MASSIMA PER
L’UOMO O DELLA DOSE CHE PRODUCE UN EFFETTO FARMACOLOGICO NELL’ANIMALE;
- DOSE INTERMEDIA: media geometrica delle due precedenti.

STUDI DI TERATOGENICITA’

Il farmaco viene somministrato prima dell’accoppiamento o nel corso della gravidanza ai topi XX.

Il farmaco viene somministrato nelle diverse fasi della gravidanza, che nel topo dura circa 28 giorni, al
fine di mimare l’esposizione al farmaco nei 3 trimestri di gravidanza nella donna, dopo di che si valutano
gli effetti sul feto in termini di NUMERO DI IMPIANTI e di SALUTE DEL FETO.

Si deve tenere presente che L’ESTRAPOLAZIONE DEI DATI OTTENUTI DAGLI STUDI SUGLI ANIMALI NON
E’ MAI COMPLETAMENTE ATTENDIBILE, per cui un farmaco che risulta sicuro durante la sperimentazione
preclinica, non per forza si rivelerà essere tale anche negli studi clinici.

Una volta completati gli studi preclinici, si redige l’IND (INVESTIGATIONAL NEW DRUG APPLICATION),
ovvero la richiesta di autorizzazione alla sperimentazione clinica, che viene sottoposta all’AIFA e all’Istituto
Superiore di Sanità.

L’IND deve comprendere:

- Informazioni sulla composizione e sull’origine del farmaco;

- Informazioni sulla fabbricazione:
- Dati relativi alla sperimentazione sugli animali;
- Disegni e protocolli scientifici;
- Nomi e credenziali scientifiche dei medici che condurranno la sperimentazione.

A cura di Mariachiara Ferrandino