Espectrofotometría

Principios, Componentes,
Cuidados, Control de
Calidad y Mantenimiento
Espectrofotometría
Término que se refiere al uso de la
Radicación Electromagnética (REM) para
medir las concentraciones de una
sustancia.

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Un poco de historia
• Antes de 1940 la mayoría de las determinaciones en
química clínica eran del tipo volumétricas y
gravimétricas. Por lo que la mayor parte de los
resultados fueron semicuantitativos.
• En la década de 1950 se comienza a utilizar el
espectrofotómetro (EE.UU.). Éste eliminó el
comparador de color, logrando así que los análisis
fuesen más cuantitativos, confiables, reproducibles e
incrementando la precisión y la exactitud.
• El espectrofotómetro es un instrumento útil, por las
ventajas tales como rapidez, sencillez, especificidad y
sensibilidad.

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Antecedentes teóricos
• Todo átomo y molécula es capaz de absorber
energía (bajo ciertas limitaciones).
• La energía puede proporcionarse en forma de
REM, “luz”.
• El tipo y la cantidad de REM absorbida por una
molécula esta relacionada con su estructura.
• Así mismo la cantidad de REM absorbida está
relacionada con el número de moléculas que
interaccionan con ella.

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Antecedentes teóricos
• De la REM sólo se trabaja para la espectrofotometría
en química clínica con la ultravioleta y la visible.

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Antecedentes teóricos
λ máxima Color Color
absorción (nm) absorbido observado

400-450 Violeta Amarillo-verde

450-480 Azul Amarillo
440-470 Verde-azul Naranja
470-500 Azul-verde Rojo
500-560 Verde Púrpura
560-575 Amarillo-verde Violeta
575-590 Amarillo Azul
590-625 Naranja Verde-azul
625-750 Rojo Azul-verde
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Antecedentes teóricos
• La radicación
electromagnética tiene un
comportamiento dual, es
decir, como onda y como
partícula.
• Como onda se sabe que Radiación electromagnética, de
luz polarizada en un plano y que
presenta la propiedades se propaga a lo largo del eje de
de reflexión, refracción y las x
difracción, esta última
explica la descomposición
de la luz en los diferentes Espectro de luz visible
colores.
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Antecedentes teóricos
• La REM se desplaza describiendo una onda, mientras más
pequeña es la longitud de onda (λ) mayor energía posee y
viceversa.
• La longitud de onda (λ) es la distancia lineal desde cualquier
punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda
adyacente y se mide comúnmente en nm .
• La frecuencia (ν) es el número de ondas que pasan por un
punto dado en una unidad de tiempo, es decir, en s-1 = hertz
(Hz). Longitud de
onda grande
Baja
Frecuencia

Alta
frecuencia

Longitud de
onda pequeña
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Antecedentes teóricos
c
• La ecuación ν  describe esa relación.
λ
• La velocidad de la luz (c) una constante universal de
valor = 2,997 924 58 X 108 m/s.
• La potencia (P) de un haz de radiación es la energía
del haz que llega a un área dada por segundo.
• La intensidad (I) es la potencia por ángulo sólido
unitaria.

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Antecedentes teóricos
• Como partícula (fotón) permite explicar el proceso
energético de la REM.
• E = hν donde E = energía y h = constante de Planck
(= 6,626 0755 X 10-34 Js).
c
• Sustituyendo ν de ν  , en E = h ν.
λ
hc
• Nos queda que E  o E  hcν , ν  1 que recibe el
λ
nombre de número de onda. 

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Antecedentes teóricos
• Todas las moléculas poseen energía la cual es debida
a:
a) La translación.
b) La vibración de sus constituyentes (átomos).
c) Rotación y.
d) Su configuración electrónica.
• Dando como resultado que la energía total sea igual a
la suma de cada una de las anteriores.
• Por lo que la mecánica cuántica nos índica que la
molécula sólo puede adoptar ciertos valores de
energía y que ésta se encuentra cuantizada y es
diferente para cada compuesto.
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Antecedentes teóricos
• La absorción de la REM por alguna especie M se
considera en dos etapas y como un proceso
irreversible.
• M + hν M*, donde M* es la partícula en estado
excitado, debido a la absorción de un fotón la vida de
M* es del orden de 10-8 - 10-9 s.
• La molécula regresa a su estado basal mediante la
liberación de la energía antes adsorbida, es decir,
M* M + calor.

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Fundamento
• Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia
del haz disminuye (P ≤ P0) donde P0 es la que
sale del monocromador.
• La ley que explica la relación entre la absorción y
la concentración de una sustancia es conocida
comúnmente como ley de Beer o Lambert-Beer.
• Si T es la transmitancia, es decir la radiación que
pasa altraves del cuerpo entonces T=P/P0 por lo
que T solo puede tener valores que van desde
cero hasta uno.

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Fundamento
• Como normalmente se trabaja con %T entonces
tenemos que %T  P  100 lo que nos da como resultado
P0 100
la ecuación más conocida para la relación de la
absorbancia, esta es:
A  2  log%T
• Cuando no se absorbe luz P=P0 A = 0.
• Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se
transmite, es decir, P=1/P0 dando un valor de A = 1.
• Al absorberse el 99% de la luz, es decir, se transite
el 1% A = 2.

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Fundamento
• La importancia de la absorbancia [A] (Densidad Óptica
[D.O.] Densidad [D] o Extinción [E]) estiba en que es
directamente proporcional a la concentración de la
especie absorbente en la muestra, y la expresión
matemática que la representa es.
A = εbc que es la ley de Lambert-Beer
 Donde A es la absorbancia de la muestra, ε (a) es el
coeficiente de extinción molar, b es la longitud de la
trayectoria óptica y c la concentración de la solución
problema.
• La relación lineal entre A y b a una concentración fija
de sustancia absorbente es una generalización para la
que no se conoce excepción.

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Limitaciones a la ley de Lambert-Beer
• La relación directa entre A y c si presenta desviaciones
a la linealidad medidas a una misma longitud de
trayectoria del haz.
• Por lo que la ley sólo se cumple con disoluciones
verdaderas y a concentraciones ≤ 0.01M o F. Puesto
que en toda solución concentrada las moléculas del
soluto interaccionan entre sí por su proximidad: Lo
cual hace probablemente que cambien las propiedades
eléctricas de las moléculas, causando también una
modificación en las propiedades ópticas de éstas.

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 Limitaciones a la ley de Lambert-Beer
(continuación)

• Desviaciones químicas. Debidas a la asociación,

disociación o reacción de las sustancia problema con
el disolvente. V. g. soluciones mal amortiguadas, lo
cual cambia la concentración y la desviación es más
aparente que real, por modificación de los equilibrios
químicos.

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Instrumento, sus partes

Rendija Rendija

Monocromador Lámpara
Escala de lectura Muestra Selección de una
en una cubeta longitud de onda de
T= % transmitancia luz: 500 nm
A = -log (T/100)

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Sus partes
a. Lámpara:
La tungsteno es una magnifica fuente de radiación en el
intervalo de los 380 - 780 nm y opera a T de 2 870 K.
Las más empleadas en química clínica son las de yoduro de
tungsteno que tiene una vida útil de 2 a 3 000 h.
por debajo de los 360 nm es conveniente utilizar una lámpara
de arco de deuterio la cual emite una radiación en el intervalo
de 180 - 400 nm.
Menos frecuentes son las lámparas de hidrogeno con intervalos
de 150 – 350 siendo parecidos a los de deuterio.
Las de mercurio presentan el inconveniente de proporcionar
sólo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 “y” 546 nm.

a b c d e f g 19
Sus partes
• b, c y d son los componentes
del monocromador.
b c d
b. La rendija de entrada reduce
al máximo la luz difusa y evita
que la luz dispersa penetre al
dispersor, éste solo lo puede
hacer con un mínimo de luz
directa.
c. Dispersor de luz (selector de
longitud de onda, o
monocromador propiamente
dicho). Pueden ser prismas o
rejillas de difracción.

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c Prismas y rejillas de difracción

• En caso de los prismas. Para la luz

visible un prisma de vidrio es
bueno, sin embargo, este material
no es conveniente para las
mediciones en la región del
ultravioleta, pues el vidrio absorbe
la radicación a estas λ. b c d
La dispersión producida por un
prisma ni es lineal, y se hace
mucho menor cuando λ >550 nm.

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Prismas y rejillas de difracción (continuación)

• Las rejillas de difracción, estas se preparan a partir de una rejilla

patrón la en la cual se graban surcos –las que se emplean para
las regiones visible-uv poseen 2 325 surcos por cm2- sobre una
superficie metálica.
La dispersión de la luz en las rejillas de difracción es lineal. Como
los surcos están muy próximos entre sí cuando la luz es reflejada
por la rejilla, cada estría se comporta como una fuente de
radiación. Si los rayos de luz adyacentes están en fase, se
refuerzan unos a otros. Cuando no lo están, se cancelan parcial o
totalmente.

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d Ranura o rendija de salida
• Ésta determina el ancho del espectro de
dispersión que sale del sistema monocromador.
Puede enfocarse una línea particular sobre
dicha ranura haciendo girar la rejilla. Si las
ranuras de entrada y salida son del mismo
tamaño, la imagen de rendija de entrada b c d
teóricamente encajará exactamente en la
abertura de la ranura de salida cuando al
montaje del monocromador corresponde a la
longitud de onda de la radicación. Moviendo el
montaje del monocromador en una u otra
dirección produce una continua disminución de
la intensidad emitida, llegado a cero cuando la
imagen de la ranura de entrada ha sido
desplazada en todo su ancho.

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Ancho de banda

• Como la luz obtenida que sale del sistema

monocromador no es verdaderamente de una sola λ,
sino que comprende un intervalo de λ. El grado de
monocromaticidad se define como el Ancho de
Banda. Es el intervalo de λ que pasan a través de la
rendija de salida.

Lo que se observa en una rendija

de salida cuando se explora con
el monocromador son longitudes
de onda que van desde λ1 – δλ
hasta λ2 + δλ

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e Celdas o portamuestras
• Existen de todos tamaños
y formas. Las más
comunes para medir e f g
espectros visibles y de
ultravioleta son de
cuarzo, tienen un espesor
de 1,00 cm (o trayectoria
óptica).
• Las más fáciles de
conseguir son las
redondas (tipo tubo de
ensayo) las mejores son
las cúbicas.
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f Detectores, fotomultiplicadores y fototubos
• Poseen la capacidad de producir una señal eléctrica
cuando son bombardeados por fotones.
• Se basan en el efecto fotoeléctrico.
• El más sensible es el fotomultiplicador. En éste los
electrones emitidos por una superficie fotosensible
inciden en una segunda superficie, llamada dínodo, la
cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible.

f g

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Fotomultipicadores

27
g Registrador

• De aguja o digital.
• Incorporado a un sistema de impresión.
• Conectado a una computadora.

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Errores en espectrofotometría
Para el análisis cuantitativo se debe tomar en cuenta:
1. La absorbancia no debe ser demasiado grande.
2. La absorbancia debe medirse en un pico o en una meseta
donde dA/dλ sea pequeña.
3. El ancho de banda del monocromador debe ser lo más grande
posible, mas pequeña comparada con la banda que va a
medirse.
Los errores instrumentales
• Las mediciones más exactas suelen hacerse cuando la
absorbancia se encuentra entre 0,4 y 0,9.
• Para mayor precisión, las muestras deben estar libres de
polvo, las celdas de huellas digitales, o cualquier otra
contaminación o daño físico que modifique o altere la óptica
en general.
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Control de calidad

Es necesario realizar periódicamente

pruebas para verificar que el instrumento esta
trabajando adecuadamente: exactitud de
longitud de onda, linealidad de la respuesta del
detector, radiación errática, y exactitud
fotométrica.

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Disco de Newton

800 400

620 Rojo Violeta 430

Naranja Azul

580 Verde
490

560
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 Colores complementarios para leer en el
espectrofotómetro
Intervalo de longitud Color de la luz Color complementario
de onda (nm) absorbida trasmitido
400 – 435 Violeta Amarillo verdoso
435 – 480 Azul Amarillo
480 – 490 Azul verdoso Anaranjado
490 – 500 Verde azulado Rojo
500 – 560 Verde Púrpura
560 – 580 Amarillo verdoso Violeta
580 – 595 Amarillo Azul
595 – 650 Anaranjado Azul verdoso
650 – 750 Rojo Verde azulado

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Exactitud de longitud de onda
Se han sugerido varios estándares para verificarla en las
regiones visible y uv.
 Las lámparas de mercurio producen como ya se ha
mencionado líneas de emisión.
 Las líneas de emisión del hidrógeno (o deuterio) con líneas
de emisión útiles a 486 y 656 nm.
 El espectro de absorción del óxido de holmio como vidrio o
en solución posee fuertes líneas de absorción a
aproximadamente 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y
636 nm.
 El didimio tiene bandas de absorción mucho más amplias
573, 586, 685, 741 y 803.
 Espectro de absorción del benceno.
 Solución alcalina de cromato de potasio.
 Puntos isosbésticos.
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Puntos isosbésticos
Cuando una sustancia presenta varias formas (como los colorantes
ácido-base), éstas pueden presentar un mismo punto donde se
cruzan los espectros de absorbancia, éstos son fijos por lo que
permiten verificar la exactitud de la longitud de onda.
La limitación que este procedimiento tiene es que se debe hacer el
barrido espectrofotométrico para cada una de las formas de dicha
sustancia (v. g. rojo de metilo) y realizar la gráfica tal como lo
muestra la figura siguiente.

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Linealidad
Un espectrofotómetro que trabaje adecuadamente debe mostrar
una relación lineal entre la cantidad de energía radiante
absorbida y la lectura del indicador.
Ésta es un requisito para la exactitud tanto instrumental como
analítica.
 Filtros de vidrio pueden emplearse.
 El empleo de soluciones a distintas concentraciones de un
compuesto que siga la ley de Lambert-Beer por ejemplo:
 La oxihemoglobina a 415 nm.
p-nitrofenol a 405 nm.
Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm.
Sulfato de cobre a 650 nm.

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Mantenimiento
• Preventivo. Éste se realiza tomando en cuenta los datos
vertidos en la bitácora.
– Registrar el tiempo que permanece encendida la lámpara
– Verificar el la vida útil de la lámpara y solicitar a compras
un repuesto con tiempo suficiente para su cambio.
– Anotar fecha, hora, y personal que realizó el cambio de
lámpara.
– Anotar fecha, hora y operador que hizo la verificación de
linealidad, y exactitud de λ.
– Anotar hora y día que se realizó la limpieza, engrasado y
revisión de partes del instrumento.
– Anotar el último mantenimiento correctivo que se le
realizó al instrumento.

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