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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
1
Cultivo de Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. y
evaluación de su aplicación a la biorremediación.
Resumen
2
Cultivation of Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. and
evaluation of its application to bioremediation.
Summary
Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst is a white rot fungus and therefore is able to
degrade the lignin of wood and other substrates on which it grows. The ability to
produce the ligninolytic enzymes laccase, lignin peroxidase and manganese
peroxidase were assessed. It was found that only laccase occurs with appreciable
activity. Induction with heavy metals and phenolic compounds was evaluated and it
was found that among the tested substances, copper and ferulic acid are the best
inductors of laccase. Carbon and nitrogen sources were evaluated and an optimal
medium consisting of glucose, peptone, yeast extract, ferulic acid and copper was
proposed for production of this enzyme. Optimized concentrations were obtained
through a factorial design. It was also found that the two types of inductors
(phenolic and metallic) produce different electrophoretical patterns of laccase
activity. Production of fruit bodies in media based on poplar pine sawdust with and
without wood chips of those species were optimized. We concluded that the most
efficient bioconversion (dry weight of fruit bodies / dry weight of substrate) is
achieved on poplar sawdust with wood chips. Chemical composition of fresh and
wasted substrates as well as of fruit bodies were analyzed to characterize the
bioconversion. Hydrolytic and ligninolytic enzyme activities were quantified.
Degradation of industrial dyes for liquid and solid media were studied and the
effect of redox mediators HBT and ABTS was evaluated. It was found that the
vanilloid phenolic compounds exert a protective effect on the mycelium against
various xenobiotics by pathways which are different from that of enzyme induction
and it was concluded that the mechanism involves the alteration of the extracellular
matrix of mycelium by increasing its ability to retain toxic substances.
3
Dedicada a mi mamá, por enseñarme a leer todo.
4
Agradecimientos
A los todos colegas del cuarto piso y personas que me ayudaron con mi trabajo
como docente.
A mi familia, por comprender los tiempos y las ausencias que implican trabajar
lejos de ellos y por la libertad para elegir la vocación.
A Pablo y a mis amigos: por darme siempre paz y ganas de seguir cuando no
tengo voluntad.
5
índice
pág.
Capítulo 1: producción de lacasa en medio líquido 9
1.1 Introducción 9
1.1.1 La lacasa 9
1.1.2 Las peroxidasas 13
1.1.3 Las enzimas modificadoras de la lignina de Ganoderma
lucidum. 13
1.2 Materiales y Métodos 14
1.2.1 Las cepas 14
1.2.2 Medios de cultivo 14
1.2.3 Determinacionas analíticas 16
1.2.4 actividades enzimáticas 17
1.2.5 Separación electroforética 18
1.2.6 Ensayos de termoestabilidad 21
1.2.7 Procesamiento de los datos 21
1.3 Resultados: 22
1.3.1 Peroxidasas 22
1.3.2 Lacasa 22
1.3.2.1 Ensayos de inducción en medio agarizado 22
1.3.2.2 Crecimiento en medio líquido e inducción 24
1.3.2.3 Efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno 28
1.3.2.4 Separación electroforética de las isoenzimas. 30
1.3.2.5 Optimización de la producción de lacasa 33
1.3.2.6 Termoestabilidad 44
1.3.2.7 Actividad lacasa frente a distintos sustratos 46
1.3.2.8 Dinámica de Michaelis – Menten aparente 48
1.4 Discusión 49
Referencias 51
6
Capítulo 2: fructificación 54
2.1 Introducción 54
2.2 Materiales y métodos 56
2.2.1 Inóculo inicial 57
2.2.2 Semilla (inóculo) 56
2.2.3 Medio (sustrato) sólido 56
2.2.4 Inoculación 57
2.2.5 Mantenimiento de los cultivos 57
2.2.6 Cosecha y conservación de las fructificaciones 58
2.2.7 Determinación de composición y extractivos 58
2.2.8 Ensayos de enzimas 59
2.2.9 Análisis estadístico 61
2.3 Resultados 62
2.3.1 El inóculo 62
2.3.2 Los cultivos 62
2.3.3 Caracterización de la bioconversión. 68
2.3.4 Caracterización del crecimiento en medio sólido 69
2.3.5 producción de enzimas hidrolíticas 71
2.3.6 Cultivos en presencia de cobre 73
2.3 Discusión 78
Referencias 80
Capítulo 3: Degradación de colorantes industriales 82
3.1 Introducción 82
3.2 Materiales y Métodos 86
3.3 Resultados 88
3.3.1 Ensayos en medio agarizado 88
3.3.2 Ensayos con sobrenadante de cultivo en medio líquido. 92
3.3.3 Ensayos con cultivos en medio sólido 97
3.3.4 Ensayo de detoxificación 105
7
3.4 discusión 107
Referencias 109
Capítulo 4: Efecto de los Vainilloides en la resistencia a
estrés químico. 112
4.1 Introducción. 112
4.2. Materiales y métodos 114
4.2.1. Cepas de hongos y condiciones de cultivo 114
4.2.2. Screening de compuestos aromáticos en placas de
agar. 114
4.2.3 Ensayos de toxicidad en las placas 115
4.2.4 Ensayos en medio líquido 115
4.2.5 Ensayos de adsorción 116
4.2.6 Estudios cinéticos 116
4.2.7 Determinación de cadmio 117
2.2.8 Los análisis estadísticos 117
4.3 Resultados 118
4.3.1 Ensayos de crecimiento en placa 118
4.3.2 Crecimiento en medio líquido 122
4.3.3 Efecto de la dosis de ácido vainíllico 124
4.3.4 Screening de compuestos aromáticos protectores 126
4.3.5 Ensayos de adsorción 127
4.3.6 Capacidad de adsorción de ECMM 128
4.3.7 Adsorción de cadmio 131
4.3.8 Estructura de los compuestos protectores 132
4.4 Discusión 134
Referencias 138
8
Capítulo 1: producción de lacasa en medio líquido
1.1 Introducción
1.1.1 La lacasa
9
el centro catalítico y generalmente se las conoce como oxidasas
multicobre. Cataliza oxidaciones que involucran 4 electrones del sustrato reductor
esta reacción está acoplada a la reducción del O2 para llevarlo a H2O. La Lacasa
puede catalizar directamente la oxidación de o-difenoles, p-difenoles,
aminofenoles, polifenoles, poliaminas y arildiaminas Es difícil definir lacasa por su
sustrato debido a la diversidad, y el solapamiento con otras fenol oxidasas,
aunque suele considerarse a la siringaldazina como sustrato característico (2)
siempre y cuando el peróxido de hidrógeno se excluya de la reacción. La lacasa
es, pues, una oxidasa que oxida un amplio rango de sustratos y una variedad de
otros compuestos, así como también sobre el heteropolímero de la lignina, pero no
tiene actividad oxidasa sobre la tirosina como lo hacen las tirosinasas. Debido a
que también puede estar involucrada en reacciones de polimerización
promoviendo el acoplamiento oxidativo de monolignoles, una familia de fenoles de
origen natural, es más correcto referirse a ella como enzima modificadora de la
lignina que como ligninasa. Se demostró además que las lacasas de los hongos
tienen una gran diversidad de funciones, entre ellas la morfogénesis, la interacción
planta patógeno, las respuestas a diversos tipos de estrés y la degradación de la
lignina (3).
La actividad lacasa se ha verificado en muchas especies de hongos y la enzima ya
ha sido purificada a partir de decenas de ellos. Sin embargo, esta producción está
limitada a determinados grupos ecológicos y nunca se ha demostrado
fehacientemente, por ejemplo, en los hongos inferiores.
En casi todas las especies de hongos de podredumbre blanca se informó la
producción de lacasa en diversos grados (4). En el caso
de Pycnoporus cinnabarinus, la lacasa fue descrita como la única enzima
producida por esta especie capaz de degradar la lignina (5). La presencia y el
papel de las lacasas en hongos de pudrición castaña todavía no están claros, pero
parece ser poco común dado que su estrategia ecológica consiste en la
degradación de la celulosa. No hay en ellos degradación (mineralización o al
menos solubilización) de lignina sino una notable modificación llevada a cabo por
mecanismos no enzimáticos como por ejemplo la reacción Fenton.
10
La mayoría de los hongos de pudrición blanca exhiben al menos dos isoenzimas
de la lacasa (1), y en algunos casos más, tal como P. ostreatus que produce al
menos ocho isoenzimas lacasa diferentes, seis de los cuales se han aislado y
caracterizado (6-10). La producción de las isoenzimas de lacasa
en P. ostreatus está regulada por la presencia de cobre y las dos isoenzimas
diméricos sólo se han detectado en la presencia de cobre (9-11)
La base molecular para la producción de distintas isoenzimas es la presencia de
múltiples genes de lacasa en hongos, ver por ejemplo, Chen et al. (12-14).
Las lacasas pertenecen al grupo de las oxidasas multicobre azules (BMCO) que
catalizan una oxidación de un electrón de forma concomitante con la reducción de
cuatro electrones de oxígeno molecular a agua (15-17). La catálisis realizada por
todos los miembros de esta familia depende de la presencia de centros de cobre
diferentes en la molécula de la enzima, en las lacasas siempre son 3. Estos
centros pueden ser identificados sobre la base de sus propiedades
espectroscópicas. El cobre T1 se caracteriza por una fuerte absorción alrededor
de 600 nm, debido a su intenso color azul, mientras que el cobre T2 exhibe una
absorción débil en la región visible. El sitio T2 emite resonancia paramagnética
electrónica (EPR-activo), mientras que los dos iones de cobre del sitio T3 son
EPR-silencioso debido a un acoplamiento puente del tipo antiferromagnético. Los
sustratos son oxidados por el cobre T1 y los electrones extraídos se transfieren,
probablemente a través de un motif muy conservado His-Cys-His, al sitio T2/T3,
donde se reduce el oxígeno molecular dando lugar a agua (18). Algunas enzimas
carecen del cobre T1 y algunos autores no las consideran verdaderas
lacasas. Otros utilizan el término “lacasas amarillas”, porque estas variantes no
tienen la banda de absorción característica en torno a 600 nm (19, 20).
A pesar de la cantidad de información sobre estas enzimas, ni la vía precisa de
transferencia de electrones ni los detalles de la reducción de dioxígeno se
entienden completamente (9, 21). Por lo que la relación entre la estructura del sitio
catalítico y la preferencia de sustrato sigue siendo dudosa.
Una gama muy amplia de sustratos se ha demostrado que se oxida por las
lacasas fúngicas, pero las constantes catalíticas se ha informado sobre todo para
11
un pequeño grupo de sustratos - por ejemplo, los no naturales como el ácido 2,2'-
azino-bis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) (ABTS) y los compuestos fenólicos 2,6 -
dimetoxifenol (DMP), guayacol y siringaldazina. Los valores de Km oscilan entre
10 mM para siringaldazina y ABTS a 100 mM para DMP y guayacol.
Los valores de pH óptimos para la actividad de las lacasas fúngicas se ubican
típicamente en rangos ácidos. Por ejemplo el pH óptimo para la oxidación de
ABTS es generalmente inferior a 4,0, los compuestos fenólicos como el DMP,
guayacol y siringaldazina presentan valores más altos de entre 4,0 y 7,0. pH
óptimos de las enzimas de diferentes hongos para la hidroquinona y catecol son
3,6–4,0 y 3,5–6,2, respectivamente (22).
La estabilidad de las lacasas fúngicas es generalmente más alta a pH ácido (23),
aunque existen excepciones (24). La estabilidad en función de la temperatura
varía considerablemente. La vida media a 50ºC varía desde minutos en B.
cinnerea, a más de 2–3 h en L. edodes y A. bisporus, a un máximo de 50–70 h en
Trametes sp. (25). Mientras que la enzima de G. lucidum se inactivó
inmediatamente a 60°C según reporta Baldrian (1), la lacasa termoestable de M.
albomyces exhibe una vida media de más de 5 h y por lo tanto un potencial muy
alto para determinadas aplicaciones biotecnológicas (26).
Se propuso también que las lacasas cumplirían un papel en la protección contra
los metales pesados, basado en el hecho de que diferentes metales pesados
inducen su actividad y a su vez está conectado con la producción de melaninas a
través de la polimerización de compuestos fenólicos (27-30).
El desarrollo actual en la investigación de la catálisis llevada a cabo por la lacasa y
el relevamiento y estudio de mediadores junto con la investigación sobre la
expresión heteróloga de esta enzima abre un amplio espectro de posibles
aplicaciones en el futuro próximo. Por otra parte, las lacasas también pueden
ofrecer una alternativa más simple y conveniente que las peroxidasas (las cuales
además requieren H2O2), ya que las lacasas se pueden producir en una escala
económicamente factible.
12
1.1.2 Las peroxidasas
13
Trametes trogii (38). Hasta el momento no hay reportes publicados sobre la
inducción de la actividad lacasa en Ganoderma lucidum.
14
* Micronutrientes:
** Vitaminas:
GG agarizado: agar: 20 g
15
peptona (como fuente de nitrógeno) que se detallan en la tabla 1 para cada punto
del diseño factorial de Doehlert.
La curva patrón se construyó con una solución patrón de BSA 1mg/ml de agua,
agregando a los 2,5 ml de reactivo 10, 20, 30, hasta 60 ó 70 µl de solución de
BSA, y se leyeron las absorbancias. El factor es la inversa de la pendiente de esa
curva patrón.
16
abs factor = µg de proteínas en los µl usados
17
4.5 + 20 µl/tubo del sustrato (conc. final 32 µM) + alícuota de sobrenadante (100 –
200 µl).
Se inició la reacción con el agregado de H2O2 0,1 mM (preparada en el momento
de usar: 28 µl de H2O2 30% en 20 ml de H2O. De esta solución se agregaron 20
µl/tubo). Se incubó por 10 min leyendo disminución de absorbancia a 650 nm.
La manganeso peroxidasa (MnP) se midió utilizando rojo fenol como sustrato (10
mg) (41) en 100 ml buffer succinato, pH 4,5, SO4Mn·4H20, 22,3 mg. La reaccón
se llevó a cabo en tubos con 2,5 ml de sustrato + muestra (50-100 µl de
sobrenadante en este caso). Luego incubó 5-10’ en baño a 30°C y se inició la
reacción con H2O2 0,2 mM (Prepado en el momento de usar: 28 µl de H2O2 (30%
en 10 ml de H2O. De esta solución se agregan 20 µl/tubo)). Se incubó a 30°C 10
min. Alcalinizando finalmente con 40 µl HONa 5N para detener la reacción. Luego
de centrifugar se leyó a 610 nm.
La actividad de la enzima lacasa se midió utilizando DMP como sustrato 5 mM en
buffer acetato de Na, 0,1 M pH 3,6 (77,1 mg ABTS/ 100 ml buffer Ac-Na, pH 3,6).
La reacción se llevó a cabo en tubos conteniendo 2,5 ml de solución de sustrato
5–10 min en baño a 30°C. Agregando la enzima (5–50 µl). Se incubó
cronometrando y registrando la absorbancia del producto (cerulignona) a 469 nm.
Como blanco se utilizó el reactivo solo.
Gel de separación:
18
agua destilada 5,55 ml
solución B 3,25 ml
solución D (x) 0,13 ml
solución A 4,00 ml
TEMED 6,5 µl
Persulfato 10% 65 µl
19
Solución C (Tris HCl 0,5 M, pH 6,8):
Tris base ....................................6,1 g
H2O hasta. ...............................100ml
Se ajustó el pH a 6.8 con HCl 1 N y se llevó a 100 ml.
Muestras y corrida
Detección de lacasa
20
Se fijó el gel de acrilamida en una mezcla de metanol:acético:agua (1:1:1) durante
5 minutos y se sumergió a continuación en una solución de DMP en buffer
acetato, pH 3,5, 30 mg/100 ml. Se incubó a temperatura ambiente (25ºC) hasta la
aparición de bandas de actividad.
21
1.3 Resultados
1.3.1 Peroxidasas
1.3.2 Lacasa
22
1.5 1.5
1.0 1.0
UE/g
UE/g
0.5 0.5
0.0 0.0
d
n
n
l
l
r
r
ro
ro
C
C
M
M
C
C
nt
nt
co
co
figura 1: actividad lacasa en discos extraídos de cultivos medio agarizado de 20 días de crecimiento con
metales (0,25 mM) como inductores. A la derecha se muestra la cepa E47 y a la izquierda la cepa S.
Sobre cada barra se representó el desvío estándar .
1.5 1.5
1.0 1.0
UE/g
UE/g
0.5 0.5
0.0 0.0
a.
a.
n.
n.
.
l
r.
r.
á. .
n.
á. .
n.
l
l
m
m
no
no
ro
ro
m
fe
fe
gu
gu
va
va
va
va
cu
cu
cu
cu
nt
nt
fe
fe
á.
á.
co
co
á.
á.
figura 2: actividad lacasa en discos extraídos de cultivos medio agarizado de 20 días de crecimiento con
compuestos aromáticos 0,5 (mM) como inductores. A la derecha se muestra la cepa S y a la izquierda la
cepa E47. Sobre cada barra se representó el desvío estándar.
23
Los demás compuestos aromáticos mostraron inducción variable y a la
concentración ensayada en este medio, no se notaron efectos de toxicidad
apreciables por el crecimiento.
200 200
control control
Cu van
150
peso seco (mg)
150
peso seco (mg)
Mn fer
100 100
50 50
0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
tiempo (días) tiempo (días)
figura 3: Curvas de crecimiento de la cepa E47 en medio líquido AG adicionado con los inductores. A
izquierda se muestran las curvas en presencia de metales (0,1 mM) y a la derecha en presencia de acido
vainíllico (van) y ácido ferúlico (fer; 0,5 mM). Las barras representan el desvío estándar.
24
En todos los casos las curvas muestran una dinámica logística de crecimiento que
comienza con una fase “lag” que representa la adaptación metabólica del inóculo
al sustrato y que concluye alrededor del quinto día (la resolución de esta
experiencia no permite estimarlo con mayor exactitud). Luego se acelera el
crecimiento describiendo lo que se conoce como etapa “exponencial” con gran
aumento de biomasa entre el quinto y el décimo día, haciéndose más lento a partir
de ese momento para finalmente entrar en idiofase alrededor del día 20.
200 200
control control
Cu van
150 150
peso seco (mg)
100 100
50 50
0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
tiempo (días) tiempo (días)
figura 4: Curvas de crecimiento de la cepa S en medio líquido AG adicionado con los inductores. A
izquierda se muestran las curvas en presencia de metales (0,1 mM) y a la derecha en presencia de ácido
vainíllico (van) y ácido ferúlico (fer; 0,5 mM). Las barras representan el desvío estándar.
25
Los gráficos de crecimiento se complementan con las curvas de azúcares
reductores que indican la fuente carbonada remanente en el medio. En la figura 5
se observan estas curvas en las dos cepas y con todos los inductores ensayados.
No se encuentran grandes diferencias y el agotamiento de la fuente carbonada se
produce en todas alrededor del día 20, lo cual confirma la entrada en el “plateau”
de las curvas de peso seco.
Cepa S Cepa E 47
12 12
MN MN
azúcares reductores (g/l)
12 12
MN MN
azúcares reductores (g/l)
11 11
10 Cu 10 Cu
9 9
8 Control 8 Control
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
día día
figura 5: Azúcares reductores en los cultivos de las cepas S y E47 adicionados con los inductores. Las
barras representan el desvío estándar.
26
Cepa S Cepa E 47
130 175
120 fer fer
110 150
van van
100
90 Control 125 Control
80
100
µg/ml
µg/ml
70
60 75
50
40 50
30
20 25
10
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
día día
140 125
130 Mn Mn
120
110 Cu 100 Cu
100 Control Control
90
80 75
µg/ml
µg/ml
70
60
50 50
40
30 25
20
10
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
día día
figura 6: curvas de proteínas en los cultivos de las cepas S y E47 adicionados con los inductores. Las
barras representan el desvío estándar.
Se observa que la proteína total es un poco más alta en los cultivos con Cu y
ácido ferúlico.
27
2.0 3
E47 + Mn E47 + Cu
S + Mn S + Cu
1.5
E47 control 2 E 47 control
S contol S contol
UE
UE
1.0
1
0.5
0.0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
tiempo (días) tiempo (días)
figura 7: Producción de lacasa en las cepas E47 y S en medio GG líquido adicionado con los inductores
metálicos Cu y Mn. Las barras representan el desvío estándar.
1.5 1.5
E47 + F E47 + V
S+F S+V
E47 control 1.0 E47 control
1.0
S control S control
UE
UE
0.5 0.5
0.0 0.0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
tiempo (días) tiempo (días)
figura 8: Producción de lacasa en ambas cepas en las cepas E 47 y S en medio GG adicionado con los
inductores fenólicos ácido ferúlico y ácido vainíllico. Las barras representan el desvío estándar.
28
6 6
5 5
4 4
mUE/ml
mUE/ml
3 3
2 2
1 1
0 0
a
n
.
a
a
.
a
a
m
m
os
os
in
on
ó
in
e.
ta
id
ag
ic
l
uc
pt
lu
u
m
gl
r
gl
pe
ce
gl
al
pa
á.
as
figura 9: Dependencia de la producción de lacasa respecto a las fuentes de carbono y nitrógeno
ensayadas en la cepa S. Se utilizó el medio GG indicado en materiales y métodos, sustituyendo
respectivamente la fuente de estos elementos. e.m.: extracto de malta. Los desvíos estándar están
representados sobre cada barra.
Las figuras 9 y 10 muestran los resultados de este ensayo en las cepas S y E47
respectivamente. La sustitución de la glucosa como fuente de carbono no tiene un
impacto positivo en la producción de lacasa, pero sí lo tiene el cambio de la fuente
de nitrógeno, siendo la peptona de carne la que más altas actividades lacasa
mostró.
29
3.5
6
3.0
5
2.5
4
mUE/ml
mUE/ml
2.0
1.5 3
1.0 2
0.5 1
0.0 0
a
.
ón
na
na
.
m
am
os
os
in
e.
gi
id
ic
uc
t
pt
lu
ra
lu
m
gl
pe
gl
ce
g
al
pa
á.
as
figura 10: Dependencia de la producción de lacasa de las fuentes de carbono y nitrógeno ensayadas en
la cepa E 47. Se utilizó el medio GG indicado en materiales y métodos, sustituyendo respectivamente la
fuente de estos elementos.
30
figura 11: SDS-PAGE de los sobrenadantes de medio líquido con inductores. pm: marcador de peso
molecular; f: ácido ferúlico; v: ácido vainíllico; c: control; Cu: cobre; 47: cepa E47; S: cepa S.
31
figura 12: SDS-PAGE de los sobrenadantes de medio líquido con inductores: pm: marcador de peso
molecular; f: ácido ferúlico; van: ácido vainíllico; c: control; Cu: cobre; mn: manganeso; 47: cepa E47;
S: cepa S.
32
En cuanto a la inducción con fenólicos se observa del mismo modo la proporción
aumentada de la banda más liviana (S=89 kDa y E47=86 kDa), y además aparece
una banda más liviana aún tanto en el caso del ácido ferúlico como del ácido
vainillico, aunque la presencia de la banda en este último inductor es más variable.
Esto ocurre en ambas cepas: banda más liviana tiene un peso relativo de 122 kDa
en la cepa E47 y de 118 kDa en la cepa S.
33
45 5 45 4.5 45 4
40 40 4.0 40
35 4 35 3.5 35 3
30 30 3.0 30
3
25 25 2.5 25
2
20 20 2.0 20
2
15 15 1.5 15
10 10 1.0 10 1
1
5 5 0.5 5
0 0 0 0.0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 12 g/l - Cu 1 mM - Fer 1 mM Pep 12 g/l - Cu 2 mM - Fer 1 mM Pep 24 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1 mM
45 5 45 0.3 45 4
40 40 40
35 4 35 35 3
30 30 0.2 30
3
25 25 25
2
20 20 20
2
15 15 0.1 15
10 10 10 1
1
5 5 5
0 0 0 0.0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 16 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1.9 mM Pep 12 g/l - Cu 0 mM - Fer 1 mM Pep 0 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1 mM
45 3.5 45 4.5 45 3
40 3.0 40 4.0 40
35 35 3.5 35
2.5
30 30 3.0 30 2
25 2.0 25 2.5 25
20 1.5 20 2.0 20
15 15 1.5 15 1
1.0
10 10 1.0 10
5 0.5 5 0.5 5
0 0.0 0 0.0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 24 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1 mM Pep 0 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1 mM Pep 8 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 0.1 mM
45 7.5 45 2.5 45 5
40 40 40
35 35 2.0 35 4
30 5.0 30 30
1.5 3
25 25 25
20 20 20
1.0 2
15 2.5 15 15
10 10 0.5 10 1
5 5 5
0 0.0 0 0.0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 16 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1.9 mM Pep 8 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 0.1 mM Pep 4 g/l - Cu 1 mM - Fer 1.9 mM
45 1.4
1.3
40 1.2
35 1.1
1.0
30 0.9
25 0.8
0.7
20 0.6
15 0.5
0.4
10 0.3
5 0.2
0.1
0 0.0
0 10 20 30 40
Pep 20 g/l - Cu 1 mM - Fer 0.1 mM
figura 13: curvas de consumo de azúcares reductores y producción de lacasa en cultivos de la cepa E 47
en medio líquido con 40 g/l de glucosa y 10 g/l de extracto de levadura. el resto de los componentes se
detallan bajo cada figura. El eje de ordenadas de la izquierda indica los gramos por litro de azúcares
reductores y el de la derecha las unidades enzimáticas de lacasa por ml.
34
45 4.5 45 4.5 45 3.5
40 4.0 40 4.0 40 3.0
35 3.5 35 3.5 35
2.5
30 3.0 30 3.0 30
25 2.5 25 2.5 25 2.0
20 2.0 20 2.0 20 1.5
15 1.5 15 1.5 15
1.0
10 1.0 10 1.0 10
5 0.5
5 0.5 5 0.5
0 0.0 0 0.0 0 0.0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 12 g/l - Cu 1 mM - Fer 1 mM Pep 12 g/l - Cu 2 mM - Fer 1 mM Pep 24 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1 mM
45 3 45 1.00 45 1.2
40 40 1.1
40 1.0
35 35 35 0.9
0.75
30 2 30 30 0.8
25 25 0.7
25
0.50 0.6
20 20 20 0.5
15 1 15 15 0.4
10 10 0.25 10 0.3
0.2
5 5 5 0.1
0 0 0 0.00 0 0.0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 16 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1.9 mM Pep 12 g/l - Cu 0 mM - Fer 1 mM Pep 0 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1 mM
45 4.5 45 3 45 1.75
40 4.0 40 40 1.50
35 3.5 35 35
30 3.0 30 2 1.25
30
25 2.5 25 25 1.00
20 2.0 20 20 0.75
15 1.5 15 1 15
0.50
10 1.0 10 10
5 0.5 5 5 0.25
0 0.0 0 0 0 0.00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 24 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1 mM Pep 0 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 1 mM Pep 8 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 0.1 mM
45 5 45 1.75 45 4.5
40 40 40 4.0
4 1.50
35 35 35 3.5
30 1.25 30 3.0
30
3
25 25 1.00 25 2.5
20 20 0.75 20 2.0
2
15 15 15 1.5
0.50
10 1 10 10 1.0
5 5 0.25 5 0.5
0 0 0 0.00 0 0.0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Pep 16 g/l - Cu 0.5 mM - Fer 1.9 mM Pep 8 g/l - Cu 1.5 mM - Fer 0.1 mM Pep 4 g/l - Cu 1 mM - Fer 1.9 mM
45 1.75
40 1.50
35
1.25
30
25 1.00
20 0.75
15
0.50
10
5 0.25
0 0.00
0 10 20 30 40
Pep 20 g/l - Cu 1 mM - Fer 0.1 mM
Figura 14: curvas de consumo de azúcares reductores y producción de lacasa en cultivos de la cepa E
47 en medio líquido con 40 g/l de glucosa y 10 g/l de extracto de levadura. El resto de los componentes
se detallan bajo cada figura. El eje de ordenadas de la izquierda indica los gramos por litro de azúcares
reductores y el de la derecha las unidades enzimáticas de lacasa por ml.
35
Se observa en general que la actividad lacasa comienza a incrementarse cuando
el contenido de azúcares reductores es inferior a 5 g/l. Se observa en todos los
casos una dependencia de la producción de lacasa con la concentración de ácido
ferúlico, pero también se observa la inexistencia de actividad lacasa en la cepa S
en ausencia total de cobre y la producción tardía en esas condiciones en la cepa
E47.
Coeficiente Factor
487 Cte.
8,6605 pep
38 Cu2+
287,9867 fer
-116,5071 pep2
-278,5 (Cu2+)2
9,6676 fer2
150,1155 pep Cu2+
230,759 pep fer
-227,186 Cu2+ fer
Tabla 2: valores de los coeficientes obtenidos para cepa E47 la ecuación de optimización de actividad
lacasa al día 40 de cultivo. El R2 es de 85,088 %.
36
Coeficiente Factor
325 Cte.
85,9555 pep
89,87 Cu2+
77,78 fer
-116,84 pep2
-162,5 (Cu2+)2
-102,99 fer2
-159,93 pep Cu2+
-125,26 pep fer
-95,32 Cu2+ fer
Tabla 3: : valores de los coeficientes obtenidos para cepa E47 la ecuación de optimización de actividad
lacasa al día 40 de cultivo. El R2 es de 87.103 %.
37
Figura 15: Actividad lacasa de la cepa E 47 al día cuarenta de cultivo calculada a partir de los
parámetros obtenidos con el método factorial incompleto de Doehlert y graficado en función de las
concentraciones de cobre y ácido ferúlico.
38
Figura 16: Actividad lacasa de la cepa E 47 al día cuarenta de cultivo calculada a partir de los
parámetros obtenidos con el método factorial incompleto de Doehlert y graficado en función de las
concentraciones de cobre y ácido ferúlico.
39
1.3.2.6 Termoestabilidad
cepa S
10,000
8,000
6,000
UE
4,000
60
2,000 50
0,000 40
40
0,00
0,08
50
0,17
0,25
0,33
temperatura (C)
0,67
60
1,50
12,00
24,00
tiempo (h)
figura 17: Estabilidad térmica de la lacasa producida por la cepa E47 a 40, 50 y 60ºC expresado como
porcentaje de retención de la actividad inicial.
40
cepa E47
100
80
% de la act. inicial
60
40 60
20 50
40
0
40
0
0,08 50
0,17
0,25
0,33 temperatura (C)
0,67 60
1,50
tiempo (h) 12
24
figura 18: Estabilidad térmica de la lacasa producida por la cepa E47 a 40, 50 y 60ºC expresado como
porcentaje de retención de la actividad inicial.
41
Se estudió la termoestabilidad en función del pH en sobrenadantes con buffer
citrato 0,5 mM al 50% a los pH’s 3, 4, 5 y 6 obteniéndose los resultados
mostrados en las figuras 19 y 20 para ambas cepas.
100
3
50
4
0 5
5
0 0,17 6
0,5 1 3
6 12 24
figura 19: Estabilidad térmica a 70ºC de la lacasa producida por la cepa S a pH 3, 4, 5 y 6 expresado
como porcentaje de retención de la actividad inicial. El tiempo se expresó en horas.
42
La estabilidad fue menor en medios con buffer que en los sobrenadantes puros y
se observa que a pH’s altos las lacasas de estas cepas son mucho más estables
que a pH’s ácidos.
100
3
50
4
0 5
5
0 0,17 6
0,5 1 3
6 12 24
figura 20: Estabilidad térmica a 70ºC de la lacasa producida por la cepa E47 a pH 3, 4, 5 y 6 expresado
como porcentaje de retención de la actividad inicial. El tiempo se expresa en horas.
43
No hubo un buen ajuste a modelos de estabilidad térmica, probablemente debido
a la presencia de isoenzimas de distinta vida media, como lo evidencian las
separaciones electroforéticas a continuación. La vida media fue interpolada
calculada empíricamente con mediciones repetidas e interpolando gráficamente el
valor en minutos que se indica en la figura 21.
60
S
E47
40
min
20
0
3 4 5 6
pH
figura 21: Termoestabilidad a 70 C en minutos a distintos pH de las lacasas producidas por ambas
cepas de G. lucidum.
figura 22: Separación electroforética de las bandas de lacasa en cultivos de la cepa S utilizando cobre
como inductor y exponiendo el sobrenadante a tratamiento térmico a 60ºC durante el tiempo expresado
en cada calle.
44
figura 23: Separación electroforética de las bandas de lacasa en cultivos de la cepa E 47 utilizando
cobre como inductor y exponiendo el sobrenadante a tratamiento térmico a 60ºC durante el tiempo
expresado en cada calle.
figura 24: Separación electroforética de las bandas de lacasa en cultivos de las cepas E47 y S utilizando
acido ferúlico como inductor y exponiendo el sobrenadante a tratamiento térmico a 60ºC durante el
tiempo expresado en cada calle.
45
1.3.2.7 Actividad lacasa frente a distintos sustratos
La actividad lacasa fue testeada a distintos pH’s sobre los sustratos clásicos de la
enzima lacasa, ABTS, DMP, guayacol y siringaldazina.
Cepa E 47
3,5
3
μM ml-1 min-1
2,5
2 Siringaldazina
1,5 guayacol
DMP
1
ABTS ABTS
0,5 DMP
0 guayacol sustrato
3 Siringaldazina
4
5
6
pH
figura 25: Actividad de la enzima lacasa en diferentes sustratos a distintos pHs en la cepa E47
46
las figuras 25 y 26 muestran los resultados de esta experiencia. Si bien los pH’s
óptimos para la lacasa se sitúan en el rango de 3-4, existen notables diferencias
frente a distintos sustratos, es notable por ejemplo la mayor dependencia del
ABTS del pH con respecto a los demás sustratos clásicos de esta enzima. Las
bajas actividades mostradas por el guayacol coinciden con el hecho de que no
pudo revelarse actividad en geles electroforético con este sustrato.
Cepa S
2,5
2
μM ml-1 min-1
1,5 Siringaldazina
guayacol
1 DMP
ABTS
0,5 ABTS
DMP
0
guayacol
3 sustrato
4 Siringaldazina
5
pH 6
figura 26: Actividad de la enzima lacasa en diferentes sustratos a distintos pHs en la cepa S
47
1.3.2.8 Dinámica de Michaelis – Menten aparente
DMP ABTS
0.08 0.10
pH 5.6
veloc. ( mol min-1 ml -1)
0.08 pH 4.6
0.06
pH 3.6
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00 0.00
0 500 1000 0 20 40 60
[S] (M) [S] (M)
figura 27: curvas de velocidad de la enzima lacasa a distintos pHs para la cepa E47 con respecto a los
sustratos DMP y ABTS.
DMP ABTS
pH 5,6 17,6 6,844
pH 4,6 40,51 1,727
pH 3,6 75,75 1,414
Tabla 4: Km en μM de la enzima lacasa a distintos pHs para la cepa E47 con respecto a los sustratos
DMP y ABTS.
48
1.4 Discusión
49
donde se indica una mayor estabilidad a pH’s bajos, pero también se reseñan
excepciones a esta regla (24) en las cuales encuadrarían nuestros resultados.
50
Referencias
12. S. Chen, D. Ma, W. Ge, J. A. Buswell, FEMS Microbiol. Lett. 218, 143
(2003).
14. S. Chen, W. Ge, J. A. Buswell, FEMS Microbiol. Lett. 230, 171 (2004).
51
22. S. V. Shleev et al., Biochimie 86, 693 (2004).
33. A. J. Matos, R. M. Bezerra, A. A. Dias, Lett. Appl. Microbiol. 45, 270 (2007).
36. P. Li, H. Wang, G. Liu, X. Li, J. Yao, Enzyme Microb. Technol. 48, 1 (2011).
52
43. G. Songulashvili, V. Elisashvili, S. Wasser, E. Nevo, Y. Hadar, Biotechnol.
Lett. 28, 1425 (2006).
47. B. Schilling, R. M. Linden, U. Kupper, K. Lerch, Curr. Genet. 22, 197 (1992).
50. A. Leonowicz, J. Trojanowski, B. Orlicz, Acta Biochim. Pol. 25, 369 (1978).
53
Capítulo 2: Producción de fructificaciones en medio
sólido
2.1 Introducción
54
Para la puesta a punto de una técnica de cultivo es necesario conocer los
parámetros de crecimiento en el medio en cuestión. Esta estimación se ha llevado
a cabo tradicionalmente midiendo la pérdida de peso seco del sustrato como
medida de la respiración total del hongo y reflejo de su actividad metabólica ligada
al crecimiento. La cuantificación de quitina (5) ofrece la posibilidad de evaluar el
crecimiento de una manera más directa debido a que refleja la cantidad de micelio
presente en la muestra y por eso se la ha utilizado desde hace más de dos
décadas (5-8)
55
2.2 Materiales y métodos
Se preparó con granos enteros de avena previamente hervidos durante una hora
en exceso de agua, se los esterilizó en frascos Erlenmeyer de 1 litro cerrados con
tapón de algodón durante una hora a 120 C en autoclave. Una vez enfriado, se
inoculó con un taco de los cultivos en agar-malta y se agitó tapado. La agitación se
repitió todos los días a fines de evitar la formación de una masa sólida. El inóculo
se mantuvo a 24 C en oscuridad hasta la completa invasión del hongo y luego se
lo mantuvo en heladera a 4 C hasta el momento del uso.
Se utilizó aserrín de pino (Pinus radiata D. Don) y álamo (Populus nigra L.)
Se hidrató hasta el 80% sin previo hervor en frascos Erlenmeyer de dos litros y se
esterilizó durante dos horas en autoclave a 120 C cerrados con tapón de algodón.
El enriquecimiento con cobre se realizó reemplazando el agua con una solución 10
mM de CuSO4 antes del autoclavado.
56
durante una hora en exceso de agua y luego de escurrirlos se los autoclavó en
bolsas de polipropileno durante una hora a 120 C en autoclave. La mezcla con el
aserrín se realizó en el momento de la inoculación.
2.2.4 Inoculación
57
Riego: Todos los cultivos se mantuvieron en una cámara húmeda desde la
apertura de la bolsa. La provisión de humedad extra se evaluó con riego por
aspersión manual hasta el chorreado de las bolsas y por inmersión constante de
las bolsas (cortadas también en la parte inferior) en agua hasta 5 – 6 cm de su
altura. Se mantuvieron como control bolsas sin más agregado de humedad que el
contenido inicial del medio. En todos los casos se vaporizó periódicamente la
cámara para mantener la humedad del aire.
Aireado: Durante la colonización del sustrato, las bolsas no tuvieron más aireación
que la del tapón de algodón, además del oxígeno que difunde por el polipropileno.
Luego de abrirse, la cámara húmeda se mantuvo descubierta durante las horas de
iluminación, y luego cubierta con un plástico oscuro con agujeros que permitieran
el paso de oxígeno.
58
las fracciones, incluido el precipitado final insoluble resuspendido se cuantificó por
el método del fenol sulfúrico:
Se leyó absorbancia a 530 nm. Como curva patrón se utilizó una solución de
glucosamina 1 mg/ml haciendo la reacción con 10 a 80 μl de solución patrón. El
factor es la inversa de la pendiente abs vs μg de glucosamina.
59
(1 en 5) y agitando en vortex durante 10 min. Luego se los centrifugó a 15000
RPM durante 10 min y se conservaron los sobrenadantes.
La curva patrón se hizo con el azúcar que fuera liberado por la reacción (glucosa,
xilosa, ácido galacturónico).
60
2.2.9 Análisis estadístico
61
2.3 Resultados
2.3.1 El inóculo
La semilla (inoculo final) quedó siempre completamente invadida en diez días (24
C). Los frascos tuvieron que ser golpeado diariamente para evitar que se formara
una masa compacta que dificultaba la inoculación. La frecuencia de contaminación
en la semilla fue muy alta cuando el tiempo de autoclavado no superaba la hora,
pero por encima de este tiempo, no hubo frascos contaminados. De acuerdo a los
porcentajes de semilla utilizados (3% y 10%), se observaron diferencias respecto a
los eventos de contaminación, dado que hubo mayor porcentaje de contaminación
en el primer caso (70 % de bolsas con contaminación evidente ) que en el
segundo (8% de bolsas con contaminación evidente).
62
comparados con aquellos realizados sobre aserrín solo (utilizando también pino y
álamo), como lo muestra la figura 1. La frecuencia de contaminación del aserrín y
de la mezcla con chips fue casi nula a partir de las dos horas de autoclavado en
frascos de dos litros con 80 % de humedad, tiempos menores de autoclavado no
fueron efectivos. Se ensayó la esterilización del aserrín con peróxido de hidrógeno
al 2%, pero esto no evitó la contaminación (dados no se muestran).
- Humedad
63
sumergidas hasta 6 cm (aprox.) durante todo el cultivo. Con este sistema se
alcanzó el mayor rendimiento, sin que se detuviera el crecimiento en ninguna
etapa, con el único inconveniente de la mayor incidencia de contaminación por
diseminación de esporas a través del agua.
- Efecto de la Luz
La forma de los cuerpos fructíferos se vio afectada por la iluminación (ver figura 2).
Luego de tres días de haberse abierto las bolsas, aparecían los primeros
primordios consistentes en masas globosas cubiertas por himenio poroide. En los
cultivos mantenidos en la oscuridad, no hubo mayor diferenciación, sino un
crecimiento en superficie a modo de
64
figura 29: cultivos en bolsa. (a) Primordios comenzando su expansión en luz fluorescente y (b) en luz
incandescente. (c y d) Cuerpos fructíferos desarrollados completamente bajo luz fluorescente. (e)
sombrero desarrollado bajo luz incandescente desde el comienzo de su expansión. obsérvense las áreas
opacas que corresponden a la acumulación de esporas . (c) Fructificación ramificada. Ver explicación
en el texto.
basidiomas resupinados. En los expuestos a luz de baja intensidad Baja (50 µM·m -
2
·s-1) durante ocho horas diarias, los primordios sufrieron una elongación,
cubriéndose de laca rojiza en toda la superficie menos en el extremo de
crecimiento activo. Entre los días 7 y 12 el elongamiento se detuvo y comenzó la
65
expansión de un sombrero anómalo, grueso y con el himenio expuesto hacia
arriba y sin ramificaciones aún en cultivos envejecidos. Se cambió la iluminación
por luz de mayor intensidad (350 µM·m-2·s-1) durante el mismo tiempo y se
observó la proliferación de micelio blanco por sobre el himenio desde los
márgenes, el crecimiento lateral aplanado y, luego de cuatro días, el desarrollo de
himenio en posición normal. Se probó la efectividad de incrementar la intensidad
de luz desde la aparición de los primordios, pero produjo en todos los casos el
laqueado de toda la superficie y el cese del crecimiento. Se produjeron cuerpos
fructíferos normales en los cultivos que se transfirieron a luz de baja intensidad al
abrirse la bolsa, y a luz de alta intensidad al detenerse la elongación de los
primordios.
66
SE
R
PI
LA
G
A
C
PI
H
LE
U
M
O
IM
C
LE
N
PR
IF
LO
O
A
D
EN
I
O
C
ES
IM
A
A
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N
A
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R
R
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D
C
M
M
A
N
TE
LS
IO
IÓ
D
ES
A
E
S
N
L
A
A
L
OSC. + - - - - - - - -
HUMED.
A INICIAL B.I. + - - - - - - - -
S A.I. + + - - - - - - -
E OSC. + + - + + - - +
R RIEGO B.I. + + + + + + - - +
R + + + + + - - - +
Á
A.I.
Í
OSC. + + + + + - - - +
N
L INMERS. B.I. + + + + + + - - +
+ + + + + - + + +
A A.I.
OSC. + - - + - - - - -
M HUMED.
INICIAL B.I. + - - + - - - - -
M + + - + - - - - -
O E
A.I.
OSC. + + + + + + - - +
Z
C
RIEGO B.I. + + + + + + - - +
L A.I. + + + + + - - - +
A OSC. + + + + + - - - +
INMERS. B.I. + + + + + + - - +
A.I. + + + + + - + + +
OSC. + - - + - - - - -
HUMED.
A INICIAL B.I. + + - + - - - - -
S A.I. + + - + - - - - -
E OSC. + + - + + - - +
R RIEGO B.I. + + + + + + - - +
R A.I. + + + + + - - - +
Í
P N
OSC. + + + + + - - - +
INMERS. B.I. + + + + + + - - +
I A.I. + + + + + - + + +
N HUMED.
OSC. + - - + - - - - -
INICIAL B.I. + + - + - - - - -
O M A.I. + + - + - - - - -
E
OSC. + + + + + - - +
Z
C
RIEGO B.I. + + + + + + - - +
L A.I. + + + + + - - - +
A OSC. + + + + + - - - +
INMERS. B.I. + + + + + + - - +
A.I. + + + + + - + + +
Tabla 5: resumen de los resultados de los cultivos en bolsa en distintas condiciones. Osc: oscuridad,
A.I.: alta intensidad de luz B.I.: baja intensidad de luz. Ver explicación en el texto.
67
2.3.3 Caracterización de la bioconversión
figura 3: componentes d medio nuevo y gastado y del basidioma en los cultivos en madera de pino
(izquierda) y álamo (derecha) separados según su solubilidad. Ver explicación en el texto.
68
2.3.4 Caracterización del crecimiento en medio sólido
20
15
pérdida de peso seco (%)
10
0
0 5 10 15 20 25 30
tiempo (días)
figura 4: pérdida de peso seco de los cultivos en aserrín de álamo y aproximación a la dinámica logística
de crecimiento. Cada punto corresponde a un cultivo indepenciente. R2=0,8719
69
La figura 9 muestra la dinámica de la pérdida de peso seco aproximada a una
ecuación logística con una explicación R2=0,8719. Se observa el punto de
inflección entre los días 11 y 12 y al día 20 se estabiliza la pérdida de peso seco
alrededor del 17%.
350
300
contenido de quitina (g g-1)
250
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30
tiempo (días)
70
El contenido porcentual de lignina del medio también se analizó y el resultado se
muestra en la figura 6.
21
20
19
18
lignina (%)
17
16
15
14
13
12
11
10
0 5 10 15 20 25 30
tiempo (días)
figura 6: contenido de lignina de cultivos independientes en aserrín de álamo medido según el protocolo
indicado en las normas TAPPI.
71
como indicadoras de la actividad hidrolítica general en los cultivos y
adicionalmente la lacasa (figura 7d) en relación con el proceso de ligninólisis.
72
1.2
1.1 pino
1.0 álamo
sa
sa
a
sa
sa
na
na
na
na
na
ro
a
ci
ca
la
uc
pe
xi
tu
lu
gl
ac
og
do
al
ex
en
ilg
et
lim
po
figura 8: enzimas hidrolíticas extraídas de sustrato gastado de cultivo de la cepa E47 luego de la
cosecha de cuerpos fructíferos
Se hicieron cultivos en aserrín más chips hidratados con una solución de CuSO 4
10 mM como inductor de la ligninólisis tal como se indica en materiales y métodos.
La invasión fue mucho más lenta que en los controles (apreciación visual), el
73
micelio menos denso, y los primordios de fructificación nunca pasaron a la etapa
de elongación, siendo además de menor tamaño.
74
En la figura 9 se observan los resultados de estos ensayos. Tal como se mostró
en la figura 8, las actividades hidrolíticas son mayores en sustrato de álamo que
en pino (b y d) siendo los halos de degradación en pino difíciles de observar por su
pequeño diámetro. Los cultivos con cobre no mostraron ningún halo de
degradación, indicando la baja actividad de enzimas hidrolíticas. Esta baja
producción probablemente se daba al crecimiento disminuido del micelio por la
presencia de cobre.
figura 12: actividad lacasa y pérdida de peso seco en madera de pino y álamo luego de 30 días de
cultivo.
75
figura 10: degradación de la madera de pino (chips) por parte de la cepa E47 de Ganoderma lucidum: a-
c madera sin tratar; d-f madera luego de un mes de crecimiento miceliar; g-i madera luego de un mes
de crecimiento miceliar en presencia de cobre 10 mM.
76
figura 30: degradación de la madera de álamo (chips) por parte de la cepa E47 de Ganoderma lucidum:
a-c madera sin tratar; d-f madera luego de un mes de crecimiento miceliar; g-i madera luego de un mes
de crecimiento micleiar en presencia de cobre 10 mM.
77
2.3 Discusión
Las condiciones de cultivo indicadas por Stamets (1993) son adecuadas para el
crecimiento de la cepa E47 en maderas de pino y álamo, pero la humedad
requerida a lo largo de todo el proceso no es suficiente para lograr fructificaciones
normales ni un buen rendimiento por lo que es recomendable la inmersión
permanente de las bolsas como método de humidificación, además del
mantenimiento de la humedad del aire elevada. Asimismo no se reporta en la
literatura la formación invertida del himenio (hacia arriba) en condiciones de baja
luminosidad. Este fenómeno no afectaría la producción de biomasa de cuerpos
fructíferos para extractos, polvos u otra forma de fraccionamiento, pero sí a la
comercialización de la fructificación entera, cuya forma armónica es una de las
características más valoradas por las culturas orientales y el mercado.
78
etapa duración estímulo iluminación humedad aireado
colonización del sustrato 10 a 12 días ninguno ninguna interna bolsa cerrada
formación de primordios 2 a 3 días exposición al ai ninguna inmersión bolsa abierta
elongación 7 a 12 días luz tenue inmersión bolsa abierta
expansión 18 a 23 días luz intensa inmersión bolsa abierta
Tabla 6: resumen de las condiciones de cultivo en las que se obtuvo los mejores rendimientos.
79
Referencias
3. P. Stamets, (1983).
80
20. S. Chen, D. Ma, W. Ge, J. A. Buswell, FEMS Microbiol. Lett. 218, 143
(2003).
81
Capítulo 3: Degradación de colorantes industriales
3.1 Introducción
83
mezclas complejas de contaminantes incluso incluyendo tintes. Dado que estas
enzimas son extracelulares, la limitación de la difusión del sustrato enla célula que
se encuentran en las bacterias, no se observa en los hongos.
Las enzimas ligninolíticas fúngicas dependen de factores del entorno tales como la
temperatura y el pH, a pesar de ser activan en un amplio rango de condiciones. En
especial muestran una actividad máxima a pH bajo por lo tanto, la decoloración del
colorante es eficiente También se observa en medios ácidos. Se ha reportado que
el pH óptimo crecimiento de Coriolus versicolor sería de 4,5. La más alta eficiencia
de decoloración (99%) también se obtuvo a pH 4,5 que disminuyó a 50% a pH 6 y
7 (26). Este y muchos otros trabajos (27-30) permiten concluir que para la
mayoría de los hongos el pH óptimo para la degradación de colorantes se
encuentra en el intervalo ácido. Sin embargo, un pH tan bajo no siempre es
adecuado para el tratamiento de aguas residuales y, por tanto, la cepa fúngica
84
adecuada para aplicaciones industriales debe mostrar un rango de actividad
relativamente amplio.
85
3.2 Materiales y Métodos
Las cepas y los medios de cultivo son los reseñados en la sección de Materiales y
Métodos del capítulo 1.
86
sobrenadante de cultivos de 25 días o extracto de medio sólido gastado de 30 días
de cultivo.
La decoloración con medio sólido gastado se ensayó con medio aserrín de pino y
álamo con y sin CuSO4 10 mM. La diferencia entre degradación y adsorción se
evaluó como diferencia entre las decoloraciones en presencia y ausencia de azida
sódica (0.05%) para inhibir la decoloración asociada a metabolismo enzimático.
87
3.3 Resultados
88
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
control verde de malaquita
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
violeta de genciana RBBR
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
xilidina azure B
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
índigo carmín rojo congo
figura 31: curvas de crecimiento y decoloración de la cepa E47 en medio agarizado con los colorantes
indicados en cada figura. Se grafica el diámetro de la colonia (círculos) y el diámetro del halo de
decoloración (cuadrados).
89
No se perciben en medio agarizado mayores diferencias entre las cepas
ensayadas. Algunos de los colorantes no degradados eficientemente durante el
período de tiempo graficado en las figuras 1 y 2 comentaron a ser degradados
posteriormente.
90
100 80
80
60
diam (mm)
diam (mm)
60
40
40
20
20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
control verde de malaquita
80 100
80
60
diam (mm)
diam (mm)
60
40
40
20
20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
violeta de genciana RBBR
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
xilidina azure B
100 100
80 80
diam (mm)
diam (mm)
60 60
40 40
20 20
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
índigo carmín rojo congo
figura 32: : curvas de crecimiento y decoloración de la cepa S en medio agarizado con los colorantes
indicados en cada figura. Se grafica el diámetro de la colonia (círculos) y el diámetro del halo de
decoloración (cuadrados).
91
La figura 3 muestra los resultados del screening de colorantes en medio GG
agarizados a los siete días de cultivo y al mes debido que en capítulo 1 se
demostró la ausencia de actividad lacasa en cultivos jóvenes. Consideramos
resultados positivos que muestran una decoloración apreciable en la primera
semana, a pesar de que la mayoría de los colorantes fueron degradados luego de
un mes.
80 80 decoloración en 7 días
decoloración en un mes
60 60
40 40
20 20
0 0
R
VG
o
a
VM
B
VG
o
VM
in
in
ng
ng
B
B
go
e
e
o
lid
lid
B
ur
ur
g
co
co
R
di
R
di
az
az
xi
xi
ín
ín
jo
jo
ro
ro
figura 33: decoloración en medio agarizado GG de ambas cepas a los siete días y al mes de cultivo.
92
IC RBBR VM VG AB AM FB ABF
Control + + - - - - - -
Mn + + + - - - + +
Cu + + + + + - + +
Ferúlico + + + + - - + +
Vainíllico + + - - - - - +
Vainillina + + - - - - - +
Cumarina + + - - - - - -
93
IC RBBR VM VG AB AM FB ABF
Control + + - - - - - -
Mn + + + - - - + +
Cu + + + + + + + +
Ferúlico + + + + - - + +
Vainíllico + + - - - - + +
Vainillina + - - - - - - +
Cumarina + + - - - - - -
94
100 100 100
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
RBBR azul de metileno azure B
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
índigo carmín violeta de genciana fast blue
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
xilidina verde de malaquita azul de bromofenol
figura 34: decoloración por sobrenadantes de cultivos de 25 días inducidos por cobre para la cepa S en
presencia y ausencia de los mediadores HBT y ABTS. En el eje de abscisas se informa el tiempo en
horas y en las ordenadas el porcentaje de decoloración al que se le restó el control de mediador. Los
cuadrados indican la decoloración sin mediadores, los triángulos con vértice hacia arriba representan
al HBT y los invertidos el ABTS.
Se observa un efecto mediador notable en ambas cepas con respecto a todos los
colorantes e incluso la capacidad de degradar algunos que en ausencia de
mediadores permanecen inalterados tales como el violeta de genciana o el Azure
B.
95
100 100 100
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
RBBR azul de metileno azure B
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
índigo carmín xilidina fast blue
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
violeta de genciana azul de bromofenol verde de malaquita
figura 35: decoloración por sobrenadantes de cultivos de 25 días inducidos por cobre para la cepa E47
en presencia y ausencia de los mediadores HBT y ABTS. En el eje de abscisas se informa el tiempo en
horas y en las ordenadas el porcentaje de decoloración al que se le restó el control de mediador. Los
cuadrados indican la decoloración sin mediadores, los triángulos con vértice hacia arriba representan
al HBT y los invertidos el ABTS.
96
3.3.3 Ensayos con cultivos en medio sólido
80 80
60 60
decoloración %
decoloración %
40 40
20 20
0 0
no
u
no
am
C
am
pi
pi
+
+
ál
ál
no
o
no
am
am
pi
pi
ál
ál
figura 36: decoloración de una solución de colorante verde de malquita 50 µM por el residuo del cultivo
sólido (aserrín) de 30 días. La proporción sólido/solución es 1/10 y el tiempo de incubación fue de 5 hs a
22 C. en todos los casos se restó el colorante retenido que se recuperó por elusión en etanol.
97
decoloración. Las figuras 7 a 10 muestran la decoloración total en el tiempo por
una masa de un gramo de sustrato sólido gastado en 10 ml de solución buffer
acetato a ph 3.6 con los colorantes indicados en una concentración inicial de 50
µM. La parte inferior del área es la que indica la decoloración en presencia de
azida sódica 0.5% en la mezcla a decolorar, a fines de inhibir la actividad
enzimática (46) y cuantificar solamente la adsorción del colorante tanto al micelio
como a al sustrato lignocelulósico. El trazo superior es el correspondiente a la
decoloración total y la diferencia indicada en otro color equivale a la degradación
enzimática. En todos los casos es mayor la adsorción que la degradación a la
concentración ensayada. En la figura 7 se muestra la decoloración del colorante
índigo carmín, pudiendo observarse una diferencia en favor de la degradación
para pH’s altos.
pH 3 pH 4
80 60
decoloración (%)
decoloración (%)
70
50
60
40
50
40 30
30
20
20
10
10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
pH 5 pH 6
100 80
decoloración (%)
decoloración (%)
90 70
80
60
70
60 50
50 40
40 30
30
20
20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
figura 37: decoloración del colorante índigo carmín por medio sólido gastado (aserrín + Cu 10mM) de
30 días de cultivo. El área púrpura indical a decoloración por degradación mientras que el area violeta
inferior representa la adsorción.
98
De todos modos, se trata de un colorante natural (actualemente producido
sintéticamente) fácilmente degradable (21, 47) incluso por bacterias (48), por lo
que cabe la posibilidad de que haya degradación por algún sistema oxidativo
resistente a la azida.
pH 3 pH 4
90 90
decoloración (%)
decoloración (%)
80 80
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
pH 5 pH 6
80 70
decoloración (%)
decoloración (%)
70 60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
figura 38: decoloración del colorante RBBR por medio sólido gastado (aserrín + Cu 10mM) de 30 días
de cultivo. El área púrpura indical a decoloración por degradación mientras que el area violeta inferior
representa la adsorción.
99
pH 3 pH 4
decoloración (%)
90 90
80 80
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
pH 5 pH 6
90 80
decoloración (%)
decoloración (%)
80 70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
figura 39: decoloración del colorante verde de malaquita por medio sólido gastado (aserrín + Cu
10mM) de 30 días de cultivo. El área púrpura indical a decoloración por degradación mientras que el
area violeta inferior representa la adsorción.
100
pH 3 pH 4
decoloración (%)
80 90
70 80
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20 20
10 10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
pH 5 pH 6
80 60
decoloración (%)
decoloración (%)
70
50
60
40
50
40 30
30
20
20
10
10
0 0
0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24 0 0, 25 0, 5 1 2 6 12 24
figura 40: decoloración del colorante violeta de genciana por medio sólido gastado (aserrín + Cu
10mM) de 30 días de cultivo. El área púrpura indical a decoloración por degradación mientras que el
area violeta inferior representa la adsorción.
101
figura 41: efecto de los mediadores redox de la lacasa en las curvas de decoloración en los colorantes
índigo carmín, RBBR, azure B, azul de metileno y xilidina. en el eje de las abcisas se representa el
tiempo en horas y en las ordenadas el porcentaje de decoloración. Los rombos corresponden al control,
los cuadrados al ABTS y los triángulos al HBT.
Se observa en general una decoloración mayor que en los medios líquidos cuando
no se
102
Este efecto es notable en particular en colorantes de degradación más difícil como
el violeta de genciana o el azure B.
figura 42: efecto de los mediadores redox de la lacasa en las curvas de decoloración en los colorantes
fast blue, azul de bromofenol, verde de malaquita y violeta de genciana. en el eje de las abcisas se
representa el tiempo en horas y en las ordenadas el porcentaje de decoloración.
103
90
80
70
60
decoloración 50
(%) 40
30
3
20
10
0 4
5 pH
violeta de genciana
indigo carmín
6
verde de malaquita
RBBR
colorante
figura 43: Dependencia de la deoloración por adsorción con respecto al pH de cuatro colorantes por
parte del medio gastado (pino + Cu 10 mM) de 30 días de cultivo.
104
50
45
40
35
30
decoloración
25
(%)
20
15
6 10
5
5
0
pH 4
violeta de genciana
indigo carmín
3
verde de malaquita
RBBR
colorante
figura 44: Dependencia de la decoloración por degradación con respecto al pH de cuatro colorantes por
parte del medio gastado (pino + Cu 10 mM) de 30 días de cultivo.
Dado que se obtuvo una buena degradación del colorante verde de malaquita, cuya
toxicidad es reconocida, se procedió a testear la toxicidad remanente de la solución
105
decolorado en un bioensayo con el hongo Phanerochaete chrysosporium, altamente
sensible a este colorante.
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
do
do
M
l
M
ol
ro
ad
ad
m
m
ta
ta
nt
nt
at
at
4
1
co
co
0.
0.
0.
0.
tr
tr
tr
tr
4
1
0.
0.
0.
0.
figura 45: crecimiento del hongo Phanerochaete chrysosporium como indicador de detoxificación de
soluciones de 0.1 y 0.4 mM de verde de malaquita tratado con sobrenadante de cultivo de ambas cepas
de G. lucidum. El tiempo de cultivo fue de 5 días en medio GG con 5% de la solución decolorada.
106
3.4 discusión
108
Referencias
109
21. M. Ramya, B. Anusha, S. Kalavathy, Biodegradation. 19, 283 (2008).
110
39. K. Perumal, K. Murugesan, P. T. Kalaichelvan, Indian J. Exp. Biol. 38, 385
(2000).
44. D. K. Bakshi, P. Sharma, J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 22, 101 (2003).
48. E. A. Cho, J. Seo, D. W. Lee, J. G. Pan, Enzyme Microb. Technol. 49, 100
(2011).
111
Capítulo 4: Efecto de los vainilloides en la resistencia a
estrés químico.
4.1 Introducción.
Uno de los fenómenos más estudiados a este respecto es la biosorción, esto es; la
capacidad de los organismos vivos para retirar xenobióticos del ambiente o de
determinados fluidos sin que ello implique la degradación de los mismos (4, 5) .
En particular los hongos han sido objeto de atención debido a su capacidad de
producir biomasa capaz de adsorber contaminantes (6-8) tales como metales
112
pesados (6, 7, 9-11) o hasta nucléidos radioactivos (12-15) para su depsición final
o su recuperación y reutilización.
113
4.2. Materiales y métodos
114
mM). Placas sin GV se usaron como control. Crecimiento radial se midió en dos
direcciones perpendiculares desde el borde del inóculo al margen de avance de la
colonia.
115
4.2.5 Ensayos de adsorción
116
máxima de absorción de adsorbato y b la afinidad de adsorción constante. Para
representar gráficamente las isotermas qe versus Ceq, el tiempo de contacto y
valores de pH fueron seleccionados sobre la base del experimento anterior.
Debido al hecho de que las intensidades de color de GV dependen del pH, la
concentración de fungicida en el medio acuoso se calculó a partir de curvas de
calibración a diferentes valores de pH. Puntos de datos experimentales se obtiene
manteniendo constante la masa de micelio en 1 g y variando la concentración del
fungicida 0 a 130 mM g-1. La capacidad de adsoción de GV cse calculó a partir de
la concentración inicial en el medio acuoso. Las constantes fueron calculadas por
regresión no lineal utilizando STATISTICA 5,1 (StatSoft, Tulsa, OK).
117
4.3 Resultados
118
figura 46: G. lucidum cepa E47 luego de diez días de crecimiento en medio GA; (a) control, (b) con
ácido vainíllico 1mM, (c) con violeta de genciana 50 uM, (d) con ácido vainíllico 1mM y violeta de
genciana 50 uM. Ver explicación en el texto.
119
9
8
control
7 violeta de genciana
ácido vainillico
diám. (cm)
6
5 violeta de genciana
+ ácido vainíllico
4
3
2
1
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
tiempo (días)
figura 47: crecimiento en diámetro de colonia en control de GA, en medio GG adicionado con ácido
vaníllico 1 mM, con violeta de genciana 20 μM, y con ambos.
120
7
ác. vainíllico -
6
ác. vainíllico+
5
diám. (cm)
4
3
2
1
0
ol
ta
io
co
in
az
dm
ui
ni
at
aq
rim
sé
st
ca
al
ar
ni
ot
m
cl
de
e
rd
ve
figura 48: crecimiento en diámetro de colonia en medio GG con distintos inhibidiores del crecimiento
(verde de malaquita50 μM, clotrimazol 25 mg/ml, nistatina 3 mg/ml , arsénico 2.5 mM y cadmio 2.5
mM) en presencia y ausencia de ácido vainíllico 1mM.
121
Se realizaron cultivos en placa de petri en medio GG con distintas dosis de
clotrimazol para determinar la dependencia entre la concentración del tóxico y la
protección del ácido vainíllico. Las curvas de crecimiento resultantes se observan
en la figura 4. Todas las concentraciones de clotrimazol ensayadas inhibieron por
completo el crecimiento del hongo, por lo que en la figura se muestran las curvas
correspondientes a los cultivos en presencia de ácido vainíllico. A la concentración
de 5 ug ml-1 de antimicótico la toxicidad se revierte por completo. En
concentraciones superiores se obtuvo crecimiento, pero siempre inferior al control.
A fines de verificar el efecto usando un estimador del crecimiento más directo que
el diámetro de colonia, se realizaron cultivos en medio GG líquido con y sin ácido
vainíllico 0.1 mM en presencia y ausencia de clotrimazol 0.25 ug ml-1 Dado que el
GV exhibió una alta toxicidad ya que la inhibición total del crecimiento micelial se
122
observó en todo el rango (1-50 mM) de las concentraciones probadas. Se pesó el
micelio seco como se indica en materiales y métodos. Las curvas de crecimiento
resultantes se muestran en la figura 5. Se observa que el crecimiento se restituye
completamente en presencia de ácido vainíllico. Además de verificar el efecto
utilizando el peso seco, esta experiencia permite extender los resultados a un
medio de cultivo líquido.
clotrimazol
250
225 ác. vainíllico
200 ác. vainíllico
peso seco (mg)
175 + clotrimazol
150
125
100
75
50
25
0
0 5 10 15 20 25 30
tiempo (días)
figura 50: curvas de crecimiento en medio GG líquido en presencia de ácido vainíllico 0.1 mM y
clotrimazol 25 ug/ml y los dos compuestos juntos. El clotrimazol solo no permite el crecimiento del
hongo.
123
4.3.3 Efecto de la dosis de ácido vainíllico
124
diám. al sexto día (cm) 6 ác. vainíllico
5 violeta de genciana
ác. vainíllico
4
+ violeta de genciana
3
0
0. 01
0. 05
0. 10
0. 50
0. 00
0. 00
0. 00
1. 00
5. 00
10 000
0
00
00
00
00
00
01
05
10
50
00
0
.0
0.
figura 51: crecimiento en diámetro de la colonia al sexto día en medio conteniendo distintas
concentraciones de ácido vainíllico en presencia y ausencia de violeta de genciana en alta concentración
(50uM). No se observa crecimiento en violeta de genciana sin ácido vainíllico y el diámetro
representado en las columnas correspondientes indica el inóculo.
125
4.3.4 Screening de compuestos aromáticos protectores
9
diám. al sexto día (cm)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
va tim o
m l
fe ol
is an co
A a
fe y a
cu nill l
nt l
m ina
l
hi l
re H B
rc T
la o
i o
co no
de o
ro
in
di ua rin
d
so B
H
ni ac
in
al is
i
úl
a
er
.f
g
ác
an
figura 52: efecto en el crecimiento en diámetro de la colonia de seis días en medio AG – violeta de
genciana 20 uM adicionado con los siguientes compuestos: resorcinol (1 mM), guayacol (1 mM), ácido
ferúlico (1 mM), ácido vainíllico (1 mM), vainillina (0.5 mM), cumarina (0.5 mM), difenilamina (0.1
mM), anisaldehído (1 mM), anisol (1 mM), timol (1 mM), AHB(1 mM), HBT (1 mM) y fenol (1 mM).
126
títulos medidos en explantos de agar de las placas con y sin VA. Además, lacasa
(0,4 U g-1) y MnP (50 mU g-1) se detectó sólo después de 20 d, cuando micelio
cubierto completamente el medio de las placas.
12
11 ácido vainíllico -
concentración (uM)
10 ácido vainíllico +
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1 30 45 60 120 180 320 540 1440
tiempo (min)
figura 53: remoción del colorante violeta de genciana en medio acuoso por parte del ECMM de cultivos
en medio líquido de 20 días en presencia y ausencia de ácido vainíllico.
127
Se compararon los pH’s iniciales y finales de cultivos a 20 días en medio líquido GG antes
y después del cultivo y no se encontraron diferencias que expliquen la adsorción
diferencial de los distintos micelios. Estos resultados se consignan en la figura 9.
7
6
5
4
pH
3
2
1
0
n o o
GA + va ltiv ltiv
A u u
G stc stc
po po
A an
G +v
G A
figura 54: cambio de pH de los medios de cultivo líquidos durante el cultivo de la cepa E47.
ECMM fue aislado de G. lucidum micelios que se producen con y sin VA y utilizado
para probar la adsorción de GV. Diferencias obvias se pudo observar al comparar
los dos tipos de ECMM, ensayos utilizando ECMM obtenido a partir de cultivos con
VA exhibió una fuerte coloración violeta. El GV sólo pudo ser desorbido en 1:1
etanol: agua, el GV desorbido en agua fue indetectable. La cinética de adsorción
de GV sobre ECMM se realizó a pH 6, utilizando ECMM aislado a partir de
micelios de cultivos con 1 mM VA (ECMM +) y sin VA (ECMM-) (figura 10).
128
Aunque los equilibrios en ECMM se alcanzaron simultáneamente (después de 5 h
de tiempo de contacto), la captación GV aumentó de menos de 10 mg/g en la
ECMM- a más de 127 mg/g en la ECMM+. En términos de eliminación de color, se
observó que la reducción en la absorbancia fue de 20% y 86% usando ECMM-y
ECMM+, respectivamente.
figura 55: ECMM separada de cultivos en medio líquido con ácido vainíllico (izquierda) y sin el mismo
(derecha) teñidos con VG durante 24 hs, centrifugados y resuspendidos en agua.
129
figura 56: algunas de las curvas de adsorción de GV (mg/g) en función de la concentración de GV (mM)
obtenidas a fines de calcular los parámetros de Freundlich.
130
que usan micelios que cultivados con y sin GV a diferentes pH se representan en
la Tabla 1 ambos se estimados por regresión no lineal. Los altos valores de R2
proporcionan una fuerte evidencia de que el modelo refleja con precisión el
proceso. Los valores R2 fueron ≥ 0,95, lo que significa que más del 95% de la
variabilidad observada en la adsorción GV puede ser explicada por el modelo
(excepto a pH 4 sin VA). A partir de estos resultados, es evidente que la adsorción
máxima de colorante se alcanzó a intervalo de pH 6-7 en los tratamientos con
presencia de VA. La cantidad de colorante eliminado de la fase líquida fue de más
del 90% con 0,1 mM de GV.
C
pH4 pH5 pH6 pH7 pH4 pH5 pH6 pH7
132
figura 57: (a-d) estructura química de los compuestos que ejercen protección frente al violeta de
genciana a, vainillina; b, ácido vainíllico; c, guayacol; d, ácido ferúlico; (d-e) compuestos similares que
no producen protección frente al violeta de genciana. e, fenol; f , anisaldehído; g, resorcinol; h, anisol.
ver explicación en el texto.
133
4.4 Discusión
El efecto protector fue ejercido por todos los compuestos derivados de guayacol
(ácido ferúlico, ácido vinílico, vainillina y guayacol). Por lo tanto, la conclusión de
que el efecto protector se relaciona con la estructura “vainilloide” es apoyada
fuertemente por este trabajo. Los experimentos en placas mostraron que todos los
vainilloides testeados tuvieron un efecto protector en el crecimiento de los hongos,
mientras que otros derivados aromáticos eran incapaces de proteger contra la
toxicidad GV.
135
demás referidas al ámbito de la fisiología animal (37-42) pero no hay ninguna
referencia en la literatura a efecto de estos compuestos sobre la estructura de
matrices extracelulares de ningún tipo. Sin embargo, las diferencias en la
composición de la pared celular fúngica ejercida por los nutrientes se han
reportado ser la EPS (el componente principal de la ECMM) los componentes más
afectados en presencia por ejemplo de selenio (43). El significado biológico de
este efecto es aún desconocido. Muchos compuestos de esta familia son también
resultado de la degradación oxidativa de la lignina, y por lo tanto ubicuo en el
ambiente natural de los hongos de pudrición blanca. Con respecto a la falta de
dependencia de la dosis y el efecto protector, que muestran que la vainilloide no
se consume por el micelio como sustrato para una reacción en lugar de ello
parece actuar como inductor de un ECMM particular. El efecto positivo sobre el
crecimiento micelial podría ser el resultado de la inmovilización de los compuestos
tóxicos por la matriz ECMM. Probablemente, la ECMM producido en presencia de
vainilloides debería actuar como una barrera a través de la adsorción y la
inmovilización de la GV así el fungicida es incapaz de llegar a la pared de la célula
para ser translocado. Estudios adicionales en esta dirección puede aclarar el
mecanismo de la resistencia adquirida por el hongo como respuesta a vainilloides.
Este efecto ha sido observado en las bacterias y algunos hongos (44) en
presencia de metales pesados en solución. La Biorremediación mediante
adsorción micelial ha sido ampliamente ensayada, especialmente para la
contaminación por metales pesados, ya que no pueden ser degradados. El
objetivo de la exposición a la masa del micelio es secuestrar el contaminante
desde el agua y concentrarlo para deposición o reutilización. Además de la
biosorción por hongos muertos ha habido un creciente interés en cepas tolerantes
con la capacidad de degradar los contaminantes. Por lo tanto, la posibilidad de
aumentar la capacidad de adsorción a través de la adición de pequeñas
cantidades de vainilloides daría lugar a una mejora del proceso de
biorremediación.
136
pudrición de hongos G. lucidum y de tal modo que permite que el hongo crezca en
concentraciones de xenobióticos que de otro modo serían un limitante.
137
Referencias
10. R. Pan, L. Cao, H. Huang, R. Zhang, Y. Mo, Appl. Microbiol. Biotechnol. 88,
997 (2010).
11. Q. Yang, J. L. Wang, Z. Xing, Biomed. Environ. Sci. 18, 141 (2005).
138
21. S. Kajita et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 194 (2004).
35. Y. G. Suh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 4389 (2003).
40. G. Appendino et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17, 132 (2007).
139
42. T. Biro et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 56, 89 (1998).
45. E. Fourest, C. Canal, J. C. Roux, FEMS Microbiol. Rev. 14, 325 (1994).
140