y RFLP
y O polimorfismo de comprimento de fragmentos de
DNA (RFLP), obtido pelo tratamento do DNA com
enzima de restrição, consiste na digestão do produto
amplificado com uma ou mais endonucleases,
seguido de eletroforese para separação dos
fragmentos de acordo com o seu comprimento.
y O número de fragmentos obtidos corresponde ao
número de sítios de restrição reconhecidos pela(s)
enzima(s).
Bioline Consultoria
Tecnicas para genotipagem ABO
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Tecnicas para genotipagem ABO
y APLICAÇÕES CLÍNICAS
y Identificação de feto em risco de doença hemolitica
perinatal (DHPN)
y Determinação da presença ou ausência de alelos de
grupos sanguíneos em pacientes recentemente
transfundidos
y Determinação da presença ou ausência de alelos de
grupos sanguíneos em pacientes com doença
falciforme
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Tecnicas para genotipagem ABO
y APLICAÇÕES CLÍNICAS
y Determinação de alelos de grupos sanguíneos em
pacientes com hemácias recobertas por
imunoglobulinas
y Resolução de discrepâncias de A,B e D
y Triagem de doadores de sangue antígeno-negativo
(Ag de alta freqüência)
y Situações em que genótipo e fenótipo são
discordantes
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DISCREPÂNCIAS NA FENOTIPAGEM ABO
No Art. 176.
㼲 3º A tipagem ABO será realizada testando-se as hemácias com
reagentes anti-A, anti-B e anti-AB.
㼲 4º Na hipótese do 㼲 3º, caso sejam usados antissoros monoclonais, a
utilização do soro anti-AB não é obrigatória.
㼲 5º A tipagem reversa sempre será realizada, testando-se o soro
ou plasma com suspensão de hemácias conhecidas A1 e B e,
opcionalmente, A2 e O.
㼲 6º Nenhum resultado de tipagem ABO será concluído até a
resolução das discrepâncias entre a tipagem direta e reversa.
Por onde começar?
2TXHVmR³GLVFUHSkQFLDV´"
79
79
Resultados discrepantes
escrita)
y Erros técnicos
y Erros da técnica
Causas gerais dos erros
81
y Rever registros
y Transcrição de resultados
y Qualidade da amostra:
{ Hemolisada, lipêmica, aglutinação espontânea.
{ Data da coleta!
O que são discrepâncias ABO?
83
y ³7RGDGLVFUHSkQFLD$%2GHYHVHU5(62/9,'$
DQWHVGDOLEHUDomRGRVUHVXOWDGRV´
Discrepâncias ABO
84
y Discrepâncias verdadeiras:
y Checar diagnóstico
y Transfusões anteriores
y Imunossupressão
y Doença de base
{ Roleaux (Não interfere em
gel)
Discrepância ABO
Técnicas complementares
9 Métodos mais sensíveis
9 Microplacas, tubo, gel-teste
9 Modificação da técnica
9 dobrar quantidade de soro/plasma
9 usar enzimas proteolíticas
9 Adsorção e eluição
9 Estudo da saliva :
9 pesquisar estado secretor=Le(b+)
9 Análise do DNA
9 Dificílimaaaaaaa!!!!
Adsorção
Anti-A ou ²B
Mono+policlonal Incubação
a TA ou
4oC
ABO
?
+
88
Eluição
Eluato ácido
Eluato a quente
Eluato Clorofórmio / Éter
Id. Do ac do Eluato =
Ácido Anti-A e/ou-B
89
Caso 1: FHB, 25/11/2014
Caso 1: Paciente, 35 anos, mieloma multiplo.
O que fazer?
Caso 1: Testes adicionais não resolveram,mas paciente ja foi
doador e a tipagem era ARh(D)-.
O que fazer agora?
Caso 2: Doador, 33 anos
Caso 2: Doador, 33 anos, PAI negativo em Liss
Coombs. O que fazer agora?
Caso 2: Doador, 33 anos, PAI positivo a frio
SUBGRUPO A?
ANTI-A1?
Outro ac?
Caso 3: ?????????
Caso 3: Doador de repetição, com 2 tipagens
anteriores discrepantes (A e O)
y Metodologia + sensível
y Incubação a 4oC
y Enzima proteolítica
y Adsorção-eluição
y TUDO NEGATIVO!
Caso 3: Doador de repetição, com 2 tipagens
anteriores discrepantes (A e O)
y Metodologia + sensível
y Incubação a 4oC
y Enzima proteolítica
y Adsorção-eluição
y TUDO NEGATIVO!
{ E agora?