BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 BAHAN PENELITIAN

3.1.1 Alat-alat yang digunakan

Alat-alat yang diperlukan dalam melakukan penelitian ini terdiri dari

kolom HPLC (250mm × 4,6mm, 5𝜇m; Vydac 218 MS C18, Chicago, IL

USA), filtration unit for HPLC (Whatman, Maidstone, England), kertas

membran 0,2𝜇m (Whatman, Maidstone, England), pH meter (Schott CG

842, Mainz, Germany), mikropipet 0,5 – 5mL, mikropipet 100 – 1000𝜇L

(Socorex Acura manual 825, Swiss), Timbangan analitik (Shimadzu),

Termometer, Alcohol swab dan alat-alat gelas seperti, Beaker glass; Labu

ukur; Pipet volume; Pipet tetes; Corong kaca; Pengaduk kaca

3.1.2 Bahan-bahan yang digunakan

Sediaan Ceftriaxone sodium 1g sebanyak 3 vial yang digunakan di

Rumah Sakit yang kemudian akan direkonstitusi dalam sodium chloride

0,9%. Adapula asetonitrile P, tetraheptylammonium bromide P, phosphate

buffer (dapar pH 7,0 dan dapar pH 5,0) dan aquadem yang digunakan

sebagai fase gerak dalam penelitian ini

3.2 VARIABEL PENELITIAN

3.2.1 Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah waktu

3.2.2 Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah konsentrasi

ceftriaxone sodium yang diamati berdasarkan luas puncak (peek areas)

3.2.3 Variabel terkendali

Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah bahan-bahan

penelitian diantaranya, ceftriaxone sodium, fase gerak

(tetraheptylammonium bromide P, acetonitile P, dapar pH 7,0 dan dapar pH

5,0), fase diam (kolom HPLC 250mm × 4,6mm, 5𝜇m), temperatur ruangan

dan volume pelarut

3.3 METODE KERJA

3.3.1 Pemilihan Sampel

Pada penelitian ini sampel yang digunakan adalah sediaan

ceftriaxone untuk injeksi

3.3.2 Penentuan 𝝀 Maksimum Ceftriaxone Sodium

Diukur serapan maksimum ceftriaxone sodium dengan pelarut

aquadem. Pengukuran panjang gelombang (𝜆) dalam rentang scanning 200

- 400nm.
3.3.3 Pembuatan Kondisi Optimum HPLC

Kondisi optimum yang digunakan untuk menganalisa sediaan

ceftriaxone untuk injeksi sebagai berikut.

Fase gerak : 3.2g tetraheptylammonium bromide P dalam 400mL

acetonitile P, ditambahkan 44mL dapar pH 7,0 dan

4mL dapar pH 5,0 ditambahkan aquadem hingga

1000mL

Fase diam : Kolom HPLC (250mm × 4,6mm, 5𝜇m; Vydac 218 MS

C18)

Laju alir : 2mL/menit

Volume injeksi : 20𝜇L

𝜆max : 270nm

a. Pembuatan Phosphate Buffer

Dapar pH 7,0. Dilarutkan 13,6g kalium fosfat dibasa P dan 4,0g

kalium fosfat monobasa P dalam aquadem hingga 1000mL, kemudian

pH dikontrol dengan penambahan asam fosfat P atau kalium hidroksida

10N hingga 7,0±0,1.

Dapar pH 5,0. Dilarutkan 25,8g natrium sitrat P dalam 500mL

aquadem, pH dikontrol dengan penambahan asam sitrat P (1 dalam 5)

hingga 5,0±0,1 kemudian diencerkan dengan aquadem hingga 1000mL.

b. Pembuatan Larutan Baku Induk

Ditimbang saksama 50mg ceftriaxone sodium untuk baku induk,

dilarutkan dalam fase gerak sebanyak 100,0mL hingga diperoleh

konsentrasi 500𝜇g/mL. Larutan baku yang telah dibuat harus digunakan

dengan segera.

c. Pembuatan baku kerja

Baku kerja ceftriaxone sodium dibuat dari baku induk dengan

kisaran konsentrasi 50 hingga 300𝜇g/mL (digunakan 6 konsentrasi yang

berbeda). Persamaan kurva standar yang harus diperoleh berdasarkan

rasio luas puncak ceftriaxone sodium adalah r = 0,999.

d. Preparasi Sediaan

Sediaan ceftriaxone sodium yang telah direkonstitusi akan dibagi

menjadi tujuh titik sampel uji selama 24 jam yaitu 0 jam, 1 jam, 2 jam, 3

jam, 6 jam, 12 jam dan 24 jam dan pengujian dilakukan secara triplo.

e. Preparasi Pengukuran Sediaan

Dilakukan rekontitusi 250mg ceftriaxone sodium untuk injeksi

dengan 2,4mL sterile water for injection (100mg/mL), kemudian

diencerkan dengan 25mL sodium chloride 0,9% untuk konsentrasi

10mg/mL atau 100mL sodium chloride 0,9% untuk konsentrasi

40mg/mL.
3.3.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi

Dibuat seri konsentrasi larutan sampel ceftriaxone sodium

disuntikkan ke dalam kolom pada kondisi terpilih. Luas puncak yang

diperoleh dicatat dan dibuat kurva kalibrasi antara luas puncak dengan

konsentrasi larutan.

3.3.5 Uji Kesesuaian Sistem

3.3.6 Pengamatan Kualitatif

Uji stabilitas merupakan bagian penting dalam program uji bahan

obat karena ketidakstabilan produk ditentukan oleh tiga syarat utama yaitu

kualitas, efikasi dan keamanan. Salah satu uji stabilitas dengan pengamatan

kualitatif. Pengamatan kualitatif dilakukan dengan cara melihat perubahan

organoleptis sediaan. Hal ini dapan mewakilkan pengujian stabilitas dari

segi kualitas zat aktif. Perubahan organoleptis ini dilihat dari perubahan

warna pada larutan injeksi, adanya kekeruhan atau terbentuknya kristal

selama waktu pengujian (Talogo, 2014).

3.3.7 Analisa Degradasi Kadar Ceftriaxone Sodium Injeksi

Sediaan ceftriaxone sodium injeksi yang telah dibuka dan

direkonstitusi kemudian disimpan pada temperatur lemari pendingin (4℃

sampai 8℃) selama 24 jam, diuji degradasi kadar ceftriaxone sodium injeksi
yang telah dibuka dan direkonstitusi dengan menggunakan KCKT, dilihat

dari perubahan luas area puncak per sampel (Talogo, 2014).