Anda di halaman 1dari 28

ISOLASI DAN KARAKTERISASI MIKROORGANISME

PENGHASIL ENZIM PEKTINASE DARI Ipomoea sp DAN


APLIKASINYA DALAM INDUSTRI

MAKALAH
Tugas ini untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Teknologi Enzim

Oleh
Nama : Siska Sri Wahyuni
NIM : 161810301064

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2019
BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang


Ubi jalar (Ipomoea batatas L) adalah salah satu umbi yang berperan
penting diberbagai belahan dunia dengan produksi hampir 133 juta ton yang
dikonsumsi oleh berjuta-juta manusia. Sentra produksi ubi jalar di Indonesia
terletak di Provinsi Jawa Barat tepatnya di Kuningan Sumedang, Jawa Tengah,
Jawa Timur, Irian Jaya, dan Sumatra Utara (BPS, 2011). Ubi jalar banyak
digunakan untuk sumber pangan, pakan ternak dan bahan baku industri (Chen,
dkk., 2003). Ubi jalar termasuk kedalam tumbuhan penting dimana merupakan
sumber karbohidrat setelah singkong, beras, kentang, jagung, dan gandum
(Warambol, dkk., 2011). Selain sumber karbohidrat, ubi jalar banyak mengandung
vitamin, mineral, fitokimia, dan serat (pektin, selulosa, dan hemiselulosa).
Penggunaan mikroorganisme seperti bakteri, ragi, dan jamur dalam sektor
industri makanan telah menyebabkan ekspansi tinggi pada industri makanan
dengan aset ekonomis yang bersangkutan. Selama empat dekade terakhir, hal ini
merupakan hasil dari perkembangan yang cepat pada bidang bioteknologi
terutama dalam industri enzim. Enzim sejak jaman prasejarah telah banyak
diperoleh dialam dan banyak digunakan untuk produksi produk makanan seperti
keju, bir, anggur, dan cuka (Kirk et al., 2002). Pektin adalah polisakarida
heterogen dimana merupakan kandungan utama dalam sereal, sayur, buah dan
serat yang terbuat dari residu asam α-(1,4)-D-Galakturonat. Pektinase adalah
kelompok enzim yang mampu menghidrolisis polimer pektin, yaitu jenis
polisakarida yang banyak terdapat dalam dinding sel tumbuhan terutama dibagian
lamela tengah. Enzim pektinase tersebar 25% dalam penjualan global enzim dan
semakin meningkat hari demi hari. Saat ini mikroba menjadi sumber utama dalam
menghasilkan pektinase karena sifatnya yang mudah ditumbuhkan, proses
pemanenan enzim lebih mudah dan hasil akhir yang dapat ditingkatkan melalui
rekayasa genetika. Sehingga perlu dilakukan eksplorasi mengenai mikroba
pektinolitik potensial yang dapat diaplikasikan dalam bidang industri (Berutu,
2017).
Produksi enzim pektinase banyak dipengaruhi oleh beberapa aspek seperti
sifat substrat padat, kadar air, serta keberadaan karbon dan nitrogen. Banyak
penelitian yang telah diarahkan untuk memproduksi pektinase dari
mikroorganisme, namun beberapa penelitian yang telah dilaporkan mengeluhkan
mengenai keefektifan biaya produksi. Substrat yang sulit didapat menjadi masalah
utama untuk pengembangan studi ini. Diperlukan substrat yang cocok dan hemat
biaya namun memberikan nutrisi yang cukup untuk mikroorganisme. Salah satu
substrat yang banyak dikembangkan berasal dari ubi jalar (Ipomoea spp) dimana
merupakan bahan yang mudah didapat dan murah untuk memproduksi enzim
pektinase (Syaikh R et al., 2018). Penelitian ini akan dilakukan produksi pektinase
dari mikroorganisme tanah yang terisolasi dengan fermentasi menggunakan ubi
jalar sebagai substrat. Enzim yang dihasilkan melalui mikroba akan memiliki
keuntungan dan nilai kebermanfaatan yang lebih tinggi dibanding dengan yang
lain. Produksi enzim pektinase menggunakan ubi jalar (Ipomoea Spp) akan
dilakukan dengan kondisi yang dioptimalkan.

1.2 Rumusan Masalah


Rumusan masalah dari penelitian ini adalah Bagaimana Mengisolasi dan
Mengkarakterisasi Enzim Pektinase yang diisolasi dari Ipomoea sp.?

1.3 Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui cara mengisolasi dan
Mengkarakterisasi Enzim Pektinase yang diisolasi dari Ipomoea sp.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ubi Jalar


Ubi jalar (Ipomoea batatas) atau ketela rambat atau “sweet potato” diduga
berasal dari Benua Amerika. Para ahli botani dan pertanian memperkirakan
daerah asal tanaman ubi jalar adalah Selandia Baru, Polinesia, dan Amerika
Bagian Tengah. Ubi jalar menyebar ke seluruh dunia terutama negara-negara
beriklim tropika, diperkirakan pada abad ke-16. Orang-orang Spanyol dianggap
berjasa menyebarkan ubi jalar ke kawasan Asia terutama Filipina, Jepang dan
Indonesia. Menurut Rukmana (1997), dalam sistematika tumbuhan ubi jalar
diklasifikan sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Ordo : Convolvulales
Famili : Convolvulaceae
Genus : Ipomoea
Spesies : Ipomoea batatas L. sin.
Ubi jalar adalah tanaman yang tumbuh baik di daerah beriklim panas dan lembab,
dengan suhu optimum 27°C berkelembaban udara 50% – 60% dan lama
penyinaran 11-12 jam per hari dengan curah hujan 750 mm – 1500 mm per tahun.
Produksi dan pertumbuhan yang optimal untuk usaha petani ubi jalar yang cocok
adalah pada saat musim kemarau (kering). Tanaman ini dapat tumbuh sampai
ketinggian 1.000 meter di atas permukaan laut. Ubi jalar masih dapat tumbuh
dengan baik di dataran tinggi (pegunungan) tetapi umur panen menjadi panjang
dan hasil yang didapat rendah (Rukmana, 1997).
Menurut Andrianto dan Indarto ( 2004), berdasarkan tekstur, ukuran,
warna kulit, dan warna umbi yang sangat bervariasi tergantung varietasnya.
Warna ubi jalar terdiri dari ubi jalar kuning, ubi jalar oranye, ubi jalar putih, ubi
jalar jingga dan ubi jalar ungu. Ubi jalar berwarna jingga atau oranye
mengandung betakaroten tinggi dari pada ubi lainnya. Sementara varietas ubi
jalar yang digunakan untuk pangan berdasarkan tekstur daging ubi jalar dapat
dibedakan dalam dua golongan, yaitu umbi berdaging lunak karena banyak
mengandung air tidak berserat (agak berair, berdaging manis) dan umbi berdaging
keras karena banyak mengandung pati dan serat (banyak mengandung tepung)
(Sarwono, 2005). Gambar 2.1 berikut adalah gambar dari ubi jalar

Gambar 1. Ubi Jalar (Ipomoea batatas L.)


Komposisi ubi jalar sangat tergantung pada varietas dan tingkat
kematangan serta lama penyimpanan. Karbohidrat dalam ubi jalar terdiri dari
monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Ubi jalar mengandung sekitar 16-
40 % bahan kering dan sekitar 70-90% dari bahan kering ini adalah karbohidrat
yang terdiri dari pati, gula, selulosa, hemiselulosa, dan pektin (Meyer, 1982).
Tabel kandungan karbohidrat ubi jalar dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kandungan Karbohidrat dalam Ubi Jalar (persen berat kering)
Komponen Besaran (%)
Pati 46,2
Gula 22,4
Hemiselulosa 3,6
Selulosa 2,7
Pektin 0,47
Sumber: Meyer (1982)
Jumlah kandungan gizi ubi jalar dalam 100 g bahan yang dapat dimakan dapat
dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kandungan gizi dalam Ubi Jalar
No. Kandungan gizi Besaran
1 Kalori (kal) 123,00
2 Protein (g) 1,80
3 Lemak (g) 0,70
4 Karbohidrat (g) 27,90
5 Kalsium (mg) 30,00
6 Fosfor (mg) 49,00
7 Zat besi (mg) 0,70
8 Natrium (mg) -
9 Kalium (mg) -
10 Niacin (mg) -
11 Vitamin A (SI) 7.700,00
12 Vitamin B1 (mg) 0,90
13 Vitamin B2 (mg) -
14 Vitamin C (mg) 22,00
15 Air (g) 68,50
16 Bagian daging (%) 86,00
Sumber: Suprapti (2003)
Serat makanan merupakan kelompok makanan non gizi yang bermanfaat
bagi kesehatan, yaitu berperan penting dalam proses pencernaan, mempercepat
waktu cerna makanan dalam usus besar, memperbesar volume feses, menurunkan
kadar gula dalam darah, memperlambat rasa lapar, dan melindungi usus dari
gangguan kanker (Marsono, 1995). Hampir semua serat pangan yang terkandung
dalam makanan bersumber dari pangan nabati. Serat tersebut berasal dari dinding
sel berbagai jenis buah, sayuran, serelia, umbi-umbian dan kacang-kacangan.
Proporsi dari berbagai komponen serat pangan sangat bervariasi antara satu bahan
pangan dengan bahan pangan lainnya (Selvendran dan Dupont, 1984).
Berdasarkan sifat kelarutannya serat pangan dibedakan menjadi serat larut
(soluble fiber) dan serat tidak larut (insoluble fiber) yang ternyata juga memiliki
perbedaan dalam sifat fisiologisnya. Secara kimiawi serat tidak larut terutama
tardiri dari selulosa, hemisellulosa, dan lignin, sedang serat larut terdiri dari pektin
dan polisakarida lainnya misalnya gum (British Nutrition Foundafion, 1990).
Peningkatan konsumsi makanan yang mengandung serat yang tinggi dapat
mengurangi kadar kolesterol darah. Penelitian menyebutkan bahwa soluble fiber
(serat larut) seperti pektin lebih efektif menurunkan kadar kolesterol darah.
Adanya soluble fiber akan mengikat kolesterol dan asam empedu sehingga dapat
diekskresikan bersama feses (Smolin and Grosvenor, 2000).

2.2 Enzim Pektinase


Pektinase merupakan kelompok enzim yang berperan dalam mendegradasi
polimer pektin. Pektin merupakan struktur polisakarida kompleks yang banyak
terdapat pada tumbuhan terutama dalam lamela tengah dan dinding sel primer.
Polimer pektin tersusun atas subunit asam galakturonat dan dihubungkan oleh
ikatan α-1,4-glikosidik (de Vries & Visser 2001). Pektin juga berfungsi sebagai
bahan perekat antara dinding sel yang satu dan lainnya. Substansi pektin tersusun
dari asam poligalakturonat, dimana gugus karboksil dari unit asam
poligalakturonat teresterifkasi sebagian dengan metanol.
Mekanisme hidrolisis pektin dapat dilakukan oleh pektinase. Secara alami
enzim ini dapat diproduksi dari tumbuhan dan mikroba, seperti fungi berfilamen,
bakteri dan khamir. Penelitian mengenai mikroba pektinolitik telah banyak
dilakukan karena peranan enzim pektinase yang beragam pada bidang industri.
Beberapa di antaranya pada kelompok bakteri seperti Bacillus sp. NT-33 (Cao et
al. 1992), Bacillus sp. DT7 (Kashyap et al. 2000); kelompok fungi seperti
Penicillium frequentans (Borin 1996), Aspregillus ficuum (Yadav et al. 2008),
dan kelompok ragi seperti Saccharomyces cerevisiae (Blanco et al. 1994),
Kluyveromyces marxianus (Serrat et al. 2002). Klasifikasi pektin dapat dilihat
pada Tabel 3 berikut ini:
Tabel 3. Klasifikasi pektinase (Jayani et al., 2005).
Enzim Tipe Reaksi Substrat Produk
Pektin metil esterase Hidrolisis Pektin Asam pektat,
metanol
Propektinase Hidrolisis Protopektin Pektin
Endopoligalakturonase Hidrolisis Asam pektat Oligalakturonat
Eksopoligalakturonase Hidrolisis Asam pektat Monogalakturonat
Oligogalakturonat Hidrolisis Trigalakturonat Monogalakturonat
hidrolase
Endopolimetil Hidrolisis Pektin Oligometil
galakturonase esterifikasi Galakturonat
Eksopolimetil Hidrolisis Pektin Oligalakturonat
galakturonase esterifikasi
Endopoligalakturonat Trans- Asam pektat Oligalakturonat
liase eliminasi tak jenuh
Eksopoligalakturonat Trans- Asam pektat Oligalakturonat
liase eliminasi tak jenuh

2. 3 Produksi Pektinase
Saat ini mikroba menjadi sumber utama penghasil pektinase karena
sifatnya yang mudah dan cepat ditumbuhkan pada berbagai jenis media, baik cair
maupun padat, produktivitasnya tinggi, serta proses pemanenan enzim yang lebih
mudah. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi, bahan
pembangun sel, sintesis protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba
mempunyai sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula.
Faktor yang penting dalam optimasi media fermentasi adalah pemilihan
komposisi sumber karbon dan nitrogen karena sel-sel mikroba sebagian besar
terdiri atas unsur karbon dan nitrogen serta garam-garam dalam jumlah seimbang
(Suhartono 1989). Mikroba akan melakukan hidrolisis secara perlahan pada media
yang mengandung senyawa karbon dan sumber nitrogen untuk mencegah
terjadinya represi katabolit (proses yang menyebabkan fase lag menjadi
berkepanjangan sehingga mempengaruhi sifat pertumbuhan dan pembentukan
produk yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim) dan produksi enzim
meningkat (Bierbaum et al. 1994).
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor tertentu yang
menentukan efektivitas kerja suatu enzim. Apabila faktor pendukung tersebut
berada pada kondisi yang optimum, maka kerja enzim akan berlangsung optimum.
Hasil karakterisasi enzim walaupun masih bersifat ekstrak kasar, namun dapat
menggambarkan karakter enzim di dalamnya. Kondisi lingkungan harus
menunjang kondisi yang dibutuhkan enzim untuk dapat berfungsi sebagai katalis
reaksi (Ryta 2001). Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah
pH dan suhu. 6 Banyak enzim yang sensitif terhadap perubahan pH dan setiap
enzim memiliki pH optimum untuk aktivitasnya. Perubahan pH dapat
menyebabkan berhentinya aktivitas enzim akibat proses denaturasi pada struktur
tiga dimensi enzim. Umumnya enzim bekerja optimum pada rentang pH 6-8,
tetapi beberapa jenis organisme dapat hidup pada pH yang lebih rendah (Poedjiadi
2006). Penelitian sebelumnya mengenai enzim pektinase menyatakan bahwa
enzim ini bekerja optimum pada pH 3.0-6.5 (Zheng & Shetty 2000).
Suhu juga berpengaruh terhadap aktivasi dan deaktivasi enzim. Semua
enzim bekerja dalam rentang suhu tertentu pada tiap jenis organisme. Peningkatan
suhu eksternal secara umum akan meningkatkan kecepatan reaksi kimia enzim,
tetapi kenaikan suhu di atas nilai optimumnya akan menyebabkan terjadinya
denaturasi protein yaitu terurainya rantai polipeptida, selain itu deaktivasi enzim
dapat terjadi pada suhu rendah karena mempengaruhi kekuatan interaksi protein
yang membuat disosiasi sub-unit enzim. Beberapa penelitian melaporkan bahwa
enzim pektinase memiliki suhu optimum pada kondisi 35°C (Kumar et al. 2012)
dan 50 °C (Zheng & Shetty 2000).

2.4 Aplikasi Pektinase pada Industri


Perkembangan dunia industri saat ini turut memberikan dampak yang
signifikan terhadap pemanfaatan enzim sebagai biokatalisator dalam pembuatan
suatu produk. Pektinase menjadi salah satu enzim yang banyak digunakan dalam
industri makanan dan minuman. Pemanfaatan pektinase secara komersial telah
berlangsung pada tahun 1930 dalam pembuatan wine dan penjernihan sari buah
(Oslen, 2000). Pektinase merupakan enzim yang memecah pektin, suatu substrat
polisakarida yang terdapat pada dinding sel tumbuhan. Kandungan pektin pada
jaringan tumbuhan yang diukur dari berat basah adalah sebesar 0.5-1.0%.
Penambahan pektinase pada pembuatan sari buah menyebabkan terjadinya
berbagai reaksi seperti penurunan viskositas larutan, perubahan struktur daging
buah, penghancuran struktur jelly sehingga sari buah yang dihasilkan menjadi
maksimal.
Saat ini pektinase telah banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang
industri, salah satunya industri makanan dan minuman. Jus atau sari buah adalah
salah satu produk olahan buah-buahan yang telah lama dikenal dan semakin
diminati karena semakin berkembangnya informasi mengenai kandungan gizinya
yang tinggi dan rasanya yang menyegarkan. Penelitian mengenai pengaruh
pektinase terhadap kualitas sari buah yang telah dilakukan diantaranya jus pisang
(Tapre & Jain 2014), jus sirsak (Yusof dan Ibrahim 1994), jus jambu biji (Brasil et
al. 1995), jus mosambi (Rai et al. 2004) dan jus sapodila (Sin et al. 2005). Pada
aplikasinya, pektinase berperan penting untuk membantu proses ekstraksi,
maserasi dan likuifikasi, serta penjernihan sari buah. Manfaat lain dari pektinase
adalah untuk membantu meningkatkan flavor jus buah yang dihasilkan. Apel
(Malus domestica) adalah salah satu buah yang tersebar luas di berbagai negara
yang bers tinggi akan kandungan serat, potasium, pektin serta vitamin A dan C.
Menurut Oszmianski et al. (2011) pemberian pektinase mampu meningkatkan
kejernihan pada proses pengolahan sari buah apel.

2.5. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electroforesis)


Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan
sebuah molekul seperti protein, fragmen DNA, dan RNA. Elektroforesis
digunakan dalam pemisahan molekul bermuatan berdasarkan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium, maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju
muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut bergantung pada rasio muatan
terhadap massa dan berat molekulnya (Yuwono, 2008).
Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan secara luas pada saat ini
adalah elektroforesis SDS gel poliakrilamida (SDS-PAGE). SDS-PAGE adalah
teknik yang digunakan untuk memisahkan rantai polipeptida protein berdasarkan
kemampuan untuk bergerak dalam arus listrik (Anam, 2009). SDS-PAGE dinilai
lebih menguntungkan dibandingkan elektroforesis kertas dan elektroforesis pati.
Hal ini disebabkan karena besarnya pori penyangga, serta perbandingan
konsentrasi akrilamida dan bis-metilen akrilamida. Selain itu, gel ini tidak
menimbulkan konveksi dan bersifat transparan (Bintang, 2010).

Gambar 5. Skema SDS-PAGE (Saputra, 2014)


Medium penyangga dibuat dari reaksi polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida
yang dikatalisis oleh amonium persulfat dan tetra metil etilen diamin (TEMED),
SDS bersama merkaptoetanol digunakan untuk merusak struktur tiga dimensi
protein. Hal ini terjadi akibat reduksi ikatan disulfida membentuk gugus sulfidril
yang dapat mengikat SDS sehingga protein bermuatan sangat negatif dan bergerak
ke arah kutub positif (Bintang, 2010).
2.6 Kromatografi Kertas (KKt)
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil atau dalam
bentuk cairan yang dilapisi pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding
kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan (Rohma, 2003).
Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan dengan konsep dua
fase yang memiliki perlakuan masing-masing sebagai stasioner dan bergerak.
Secara sederhana pemisahan kromatografi memiliki dasar yang sama dengan sifat
kemagnetan besi-fase stasioner sebagai magnet dan fase bergerak sebagai besi.
Dalam proses pemisahannya dirancang sedemikian rupa agar episiensi mendekati
100 % secara analisa, teknik pemisahan ini berguna untuk memisahkkan sampel
yang memiliki interval densitas yang sangat dekat (Hambali, 2007).
Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan
distribusi suatu senyawa pada dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan
sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas
adalah salah satu pengembangan dari kromatografi kortesi yang menggunakan
kertas sebagai padatan pendukung fase diam. Oleh karena itu, disebut
kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang teradsorbsi pada kertas dan
sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan
dengan air (Basset, 1994).
Pemisahan kromatografi pianar (kromatografi lapis tipis dan kromatografi
kertas) pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh
permukaan fase diam. Solut pada kromatografi ini dialihkan dengan faktor
relandasi atau jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Faktor
retordasi solut (R), didefinisikan sebagai berikut :
Jarak yang ditempuh solut
RF = Jarak ditempuh fase gerak

(Rahman, 2003).
BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan


3.1.1 Alat
Alat yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, pipet,
gelas ukur, erlenmeyer, plate agar, inkubator, stopwatch, sentrifugas, rangkaian
alat elektroforesis SDS-PAGE, Kromatografi kertas, kertas whatman no 1.
3.2.1 Bahan
Sampel tanah dari Kebun Raya dekat Departemen Bioteknologi,
Universitas VNSG, India, Akuades, pektin, CaCl2, Sodium lauryl sulfat, NaNO3,
Tripton, kristal violet, substrat Ubi Jalar (Ipomoea sp.), Pepton, esktrak daging
sapi, NaCl, DW, Agar, Congo red, K2HPO4, MgSO4.7H2O, Na2SO4, (NH4)2SO4,
CaCO3, Bradford, Ammonium Sulfat, BSA (Bovine Serum Albumin), Tris-HCL
pH 8, Amonia, Alumunium foil, Jus jeruk.

3.2 Prosedur Penelitian


3.2.1 Isolasi Mikroorganisme
Sampel tanah diambil yang dari kebun raya dekat Departemen
Bioteknologi, Universitas VNSG, India ditimbang sebanyak 1g dan dilarutkan
dalam 100 mL akuades. Dengan bantuan pipet, 0,1 mL disebar di wadah agar
pektin (berisi pektin 0,75; agar 4,5 g, CaCl2 0,12 g, Sodium lauryl sulfat 0,02 g,
NaNO3 0,4 g, Tripton 0,2 g, kristal violet 2 tetes pH 7,2). Kemudian plate di
inkubasi pada suhu 30 ºC. Koloni yang diamati diplate pektin agar berada pada
interval reguler. Teknik uji plate dilakukan untuk mendeteksi bakteri yang
mendegradasi pektin oleh goresan inokulum stain bakteri yang diidentifikasi
dalam piring pektin agar. Plate selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada suhu
30 ºC. Pertumbuhan koloni menunjukkan pembentukan zona yang diamati
menunjukkan degradasi pektin. Organisme diidentifikasi oleh identifikasi
morfologi dengan bantuan pewarnaan.
3.2.2 Pesiapan inokulum untuk Bakteri
Medium Luna Bertani telah dilengkapi dengan 1% pektin (1g pektin / 100
mL) dan koloni terisolasi ditangguhkan disiapkan dimedia. Flask inkubasi dalam
inkubator bersuhu 37 ºC 200 rpm selama 48 jam. Untuk produksi enzim dilakukan
segar semalam.

3.2.3 Karakterisasi Pektinasi secara In vitro


a. Substrat terhadap aktivitas enzim
Substrat mentah disiapkan sebanyak 100 mL dalam erlenmeyer 250 mL.
Dari hasil penyegaran semalaman, 5% inokulum kultur bakter diinokulasi pada
substrat mentah disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit. Diperoleh
supernatan digunakan sebagai substrat mentah untuk penentuan aktivitas enzim.
b. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim
Substrat mentah (bubuk kering dari Ubi jalar) disiapkan dengan volume
100 mL dalam erlenmeyer 250 mL. Penyesuaian pH dilakukan di antara kisaran
pH 6 sampai 8. Dari disiapkan budaya penyegaran semalam, 5% inokulum kultur
bakteri diinokulasi pada substrat mentah dalam kondisi aseptik. Flask diinkubasi
selama 72 jam pada 37ºC. Setelah inkubasi, sampel disentrifugasi pada 10000 rpm
selama 10 menit. Diperoleh supernatan digunakan sebagai substrat mentah untuk
penentuan aktivitas enzim.
c. Pengaruh suhu pada aktivitas enzim
Substrat mentah disiapkan; volume 100 mL dalam 250 mL Erlenmeyer.
Penyesuaian pH dilakukan di antara kisaran pH 6 sampai 8. Dari disiapkan
budaya semalam segar, 5% inokulum kultur bakteri diinokulasi pada substrat
mentah dalam kondisi aseptik. Flask diinkubasi selama 72 jam pada 37 ºC.
Setelah inkubasi, sampel disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit.
Diperoleh supernatan digunakan sebagai substrat mentah untuk penentuan
aktivitas enzim.

3.2.4 Penentuan aktivitas enzim ekstraselular


a. Plate nutrien agar dengan 1% pektin
Kedua isolat berlabel R1 dan R2 yang melesat di plate agar nutrien (Pektin
1,5 g; Pepton 0,75 g; esktrak daging sapi 0,45 g, NaCl- 0,75 g, DW- 150 mL,
Agar- 2,25 g, pH- 7,4 ± 0,2) dengan 1% pektin. Pelat diinkubasi dalam inkubator
selama 48 jam pada 37 ºC. Plate ditambahkan 1% Congo red (Congo red- 1 g,
DW- 100 mL) dan zona pemanfaatan pektin diamati.
b. Plate agar Mc Beth
Kedua isolat diberi label R1 dan R2 dimana diletakkan dalam plate nutrien
agar (K2HPO4 0,1 g; MgSO4.7H2O 0,1 g, Na2SO4 0,2 g, (NH4)2SO4 0,2 g, CaCO3
0,2 g, Pektin 0,5 g, Agar 3 g, DW 100 mL). Plate diinkubasi dalam inkubator
selama 48 jam pada 37 ºC. Zona utilisasi menampilkan warna putih dikelilingi
koloni yang dapat diamati.
c. Penentuan konsentrasi enzim dengan metode Bradford
Kultur filtrat dari 1 mL dicampur dengan 5 ml reagen Bradford dalam
tabung reaksi. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm menggunakan
spektrofotometer. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan standar
BSA (Bovine Serum Albumin).
d. Pemurnian parsial pada enzim
Kultur filtrat dipindahkan di 80% b/v Amonium sulfat, endapan protein
diamati. Protein diendapkan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dilarutkan dalam 2 ml 0,5 mM
Tris-HCl (pH-8).
e. Analisis SDS-PAGE pada Pektinase
Profil protein dikonfirmasi dan dianalisis dengan SDS-PAGE.
Elektroforesis SDS-PAGE elektroforesis dilakukan pada 10% (b/v) gel dan
sampel dipanaskan selama 10 menit pada 45 °C dalam buffer sampel sebelum
loading pada sumur.

3.2.5 Pemisahan Enzim dengan Kromatografi Kertas


Campuran dari 10 mL dari 2% larutan amonia dengan 20 cm 3 dari
Propan-2-ol di tempat yang bersih, 500 cm 3 gelas disiapkan, dan tertutup rapat
dengan sepotong aluminium foil. Hal ini untuk digunakan sebagai pelarut
(Peringatan berbahaya: Propan-2-ol mudah terbakar). Selembar kertas
kromatografi dengan ukuran sekitar 10 cm x 30 cm ditempatkan, garis pensil
cahaya ditarik ke bawah dan sekitar 1,5 cm jauh seperti pada gambar. Sejalan
dengan hal ini, tujuh titik cahaya (0) ditandai dengan interval sekitar 1,5 cm.
Sejumlah gambar. Sejalan dengan hal ini, tujuh titik cahaya (0) ditandai dengan
interval sekitar 1,5 cm. Sejumlah gambar. Sejalan dengan hal ini, tujuh titik
cahaya (0) ditandai dengan interval sekitar 1,5 cm. Sejumlah kecil masing-masing
larutan enzim yang tepat ditempatkan dengan menggunakan tabung kapiler pada
posisi yang ditandai sepanjang garis pada kertas kromatografi. Tempat di atas
kertas lebih besar dari sekitar 3mm diameter harus dihindari seperti yang
ditunjukkan pada [Gambar-1]. Kertas dibiarkan kering selama beberapa menit di
udara. Setelah kering, kertas digantung dari batang baja disimpan di atas sebuah
ruang kaca berbentuk silinder yang mengandung pelarut. Pastikan bahwa kertas
tidak menyentuh dinding gelas. Pelarut kenaikan hingga diizinkan untuk kertas
untuk setidaknya 2 jam. Jika waktu yang lebih pendek, komponen mungkin tidak
cukup dipisahkan untuk memudahkan identifikasi. Makalah ini telah dihapus dan
ditempatkan terbalik di atas meja kering. Suatu larutan ninhidrin (2%)
disemprotkan di atas kertas ringan tapi benar-benar, dan terus kertas di lemari
asam sampai solusi semprot kering. Kertas ditempatkan dalam oven pada 100-110
ºC selama sekitar 10 menit, atau sampai semua tempat telah dikembangkan.
Bintik-bintik ditandai dan jarak dari masing-masing tempat berwisata diukur, juga
pengukuran jarak yang ditempuh oleh pelarut pada setiap posisi dilakukan dan
nilai Rf untuk setiap sampel pengukuran jarak yang ditempuh oleh pelarut pada
setiap posisi dilakukan dan Rf nilai untuk setiap sampel pengukuran jarak yang
ditempuh oleh pelarut pada setiap posisi dilakukan dan Rf nilai untuk setiap
sampel dihitung.
Gambar 3.1. Kromatografi kertas menunjukkan tempat sampel

3.2.6 Aplikasi Enzim Pektinase pada Jus Buah yang diklarifikasi


Dua ekstrak eksperimen yang diperoleh dengan sampel R1 dan R2
digunakan dalam proses substrat untuk klarifikasi jus buah. Solusinya disiapkan;
10 ml jus jeruk dan yang 1 mL ekstrak enzim ditambahkan. Untuk tes klarifikasi,
tabung uji yang mengandung campuran jus dan enzim ekstrak jeruk ditempatkan
ke waterbath thermostatic di 50ºC untuk waktu reaksi 60 menit. Selanjutnya
sampel ditempatkan untuk pendinginan dalam penangas es untuk mengganggu
reaksi. Sampel disentrifugasi selama 10 menit pada 10.000 rpm dan 20 º C.
Dengan bantuan kertas Whatman no. 1, sampel disaring. Kekeruhan sampel
dengan kontrol dibandingkan.
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Absorbansi pada 595 nm Konsentrasi (mg/mL)


Parameter
Sampel R1 Sampel R2 [sampel R1] [sampel R2]
Substrat 0,111 1,119 0,28 1,34

6 0,23 0,115 0,41 0,29

pH 7 0,433 2,15 0,62 2,41

8 1,211 2,368 1,43 2,64

30 0,534 1,451 0,72 1,68

Suhu 35 0,209 0,721 0,38 0,92

40 0,164 0,259 0,34 0,44

4.2 Pembahasan
4.2.1 Isolasi Mikroorganisme
Sampel tanah serial diencerkan disaring untuk memproduksi bakteri
pektinase. Dari beberapa bakteri yang tumbuh pada media screening, hanya 3
strain menunjukkan zona yang jelas dan ditemukan sebagai produsen pektinase.
Strain kemudian dimurnikan menggunakan sub-kultur berulang menggunakan
Plate Nutrient Agar dan budaya tanam dipertahankan di miring Nutrient Agar.
Identitas dan filogeni dari isolat dianalisis melalui pewarnaan gram. Koloni
bakteri dengan diameter zona maksimum terpilih sebagai strain terbaik dan
didahulukan untuk studi lebih lanjut. Dari tanah sebagai sumber, 2 isolat diisolasi
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.1 yang mampu menghasilkan enzim
pektinase; dan dinamakan sebagai R1 dan R2. Kedua isolat disaring untuk
produksi efisien menggunakan piring pektin agar dan disub-kultur seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4.2. Untuk screening, setelah inkubasi Plate yang
berisi isolat yang berbeda selama 24 jam, zona pemanfaatan pektin
divisualisasikan dan pewarnaan gram dilakukan; hasilnya ditunjukkan pada
Gambar 4.1.

Gambar 4.1 Screening Isolat

Gambar 4.2 Sub-kultur isolat untuk identifikasi

4.2.2 Karakterisasi In Vitro pada Aktivitas Pektinase


Strain terbaik diisolasi dan dipelajari secara rinci atas dasar berbagai
parameter untuk produksi enzim yang sehubungan pengembangan dalam biaya
murah dan mudah didapat. Kultur selanjutnya disaring untuk produksi pektinase
dengan fermentasi terendam menggunakan ubi jalar sebagai substrat. Studi
didasarkan pada produksi dan sekresi pektinase dari mikroorganisme yang penting
sehingga untuk mengembangkan sistem enzim yang bisa langsung digunakan
untuk mengkonversi biomassa menjadi enzim.
a. Pengaruh substrat terhadap aktivitas enzim
Aktivitas enzim dengan inokulasi isolat R1 dan R2 untuk efek substrat, di
bawah pengaruh nilai-nilai pH yang berbeda dan data masing-masing
sebagaimana dimaksud dalam Tabel 4.1, menunjukkan bahwa enzim
menunjukkan aktivitas relatif minimal dengan R1 isolat sehubungan dengan R2
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.3.

Gambar 4.3 Grafik Pengaruh Substrat


b. Pengaruh pH pada Aktivitas Enzim
Hasil penelitian ini, aktivitas enzim dengan inokulasi isolat R1 dan R2
untuk efek pH, ditemukan bahwa isolat memiliki potensi untuk menghasilkan
jumlah maksimum pektinase pada pH-8 dan jumlah minimum pada pH-6 sebagai
yang masing-masing data yang disebutkan dalam Tabel 4.1. Hal ini menunjukkan
bahwa pH optimum untuk produksi pektinase yang lebih baik yaitu pH sekitar 8,0
optimal untuk produksi pektinase ditingkatkan seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 4.4
Gambar 4.4 Grafik Berdasarkan Pengaruh pH
c. Efek suhu pada aktivitas Enzim
Dari penelitian kami aktivitas enzim dengan inokulasi isolat R1 dan R2
untuk pengaruh suhu, ditemukan bahwa isolat memiliki potensi untuk
menghasilkan jumlah maksimum pektinase pada suhu 30 °C dan jumlah minimum
pada 40 °C sebagai yang masing-masing Data yang disebutkan dalam Tabel 4.1.
Hal ini menunjukkan bahwa suhu optimum untuk produksi yang lebih baik dari
isolat bakteri adalah 30 °C seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.5

Gambar 4.5 Grafik Berdasarkan Pengaruh Suhu

4.2.3 Penentuan Aktivitas Enzim Esktraselular


a. Plate Nutrien agar dengan 1% Pektin
Zona pemanfaatan dapat divisualisasikan, yang menunjukkan bahwa pektin yang
dimanfaatkan sebagai sumber tunggal seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.6
Gambar 4.6 Zona dari utilisasi melalui isolat R1 dan R2
b. Plate agar Mc.Beth
Zona Utilisasi dapat divisualisasikan melalui zona putih yang mengelilingi
koloni, yang menunjukkan bahwa pektin yang dimanfaatkan seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4.7

Gambar 4.7 Zona Utilisasi melalui Isolat R1 dan R2


c. Penentuan Konsentrasi Enzim dengan Metode Bradford
Dengan bantuan standar BSA seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.10
konsentrasi enzim dari sampel yang tidak diketahui dapat diukur. uji protein
Bradford ini didasarkan pada mengikat proporsional dari pewarna Coomassie
untuk enzim, yang dapat dilihat dengan jelas dalam variasi warna seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4.8 dan Gambar 4.9
Gambar 4.8. Uji Bradford dengan enzim berbeda dari Isolat R1

Gambar 4.9. Uji Bradford dengan enzim berbeda dari Isolat R2


d. Penentuan parsial Enzim
Pektinase dari kedua organisme dimurnikan untuk homogenitas
menggunakan berbagai langkah. Awalnya, enzim sebagian dimurnikan dengan
penambahan padat amonium sulfat dengan supernatan bebas sel seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4.10

Gambar 4.10 Pemurnian Parsial Enzim


e. Analisis SDS-PAGE
Profil protein dianalisis dengan SDS-PAGE menunjukkan adanya pita
protein, sekitar berat molekul 45-50 kDa, yang menegaskan kehadiran enzim
pektinase seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.12 Hasil ini mirip dengan
pekerjaan sebelumnya (Belarbi et al., 2000).
Gambar 4.11. Grafik Standar BSA

Gambar 4.12. Analisis SDS-PAGE pada enzim pektinase dari isolat R1 dan R2

4.2.4 Pemisahan Enzim dengan Kromatografi kertas


Hasil kromatografi kertas menunjukkan bahwa enzim terisolasi serupa
karena yang garis horizontal lurus band dapat divisualisasikan dalam kertas
kromatografi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.13. Nilai estimasi dari
nilai faktor retensi (Rf) adalah 0,453.
Perhitungan: Di sini, jarak yang ditempuh oleh sampel yang mengandung enzim
pektinase adalah 4,3 cm dan jarak yang ditempuh oleh pelarut adalah 9,5 cm.

𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑝𝑖𝑛𝑑𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 4,3


Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 = 9,5 = 0,453
Gambar 4.13 Kromatografi kertas enzim dari isolat R1 dan R2

4.2.4. Aplikasi Enzim Pektinase dalam Jus Buah


Pektinase dari isolat R1 dan R2 dalam jus jeruk menunjukkan kegiatan
pectinolytic dengan memperjelas sebagai dibandingkan dengan kontrol tabung
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.14

Gambar 4.14. Jus Buah melalui Enzim yang diisolasi dari isolat R1 dan R2
BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat ditarik pada penelitian ini adalah Enzim pektinase
strain bakteri diisolasi dari Ipomoea sp. (Ubi Jalar). Strain bakteri yang diisolasi
diidentifikasi sebagai Pantoea sp. dan Sphingomonas paucimobilis. Studi
produksi dan optimasi mengungkapkan bahwa strain terisolasi membutuhkan
keadaan optimasi 30 ° C, pH 8,0, pektin, ekstrak ragi, dan 72 jam waktu inkubasi
untuk produksi enzim pektinase yang lebih tinggi. Pemurnian parsial pektinase
dilakukan oleh presipitasi amonium sulfat. The pektinase sebagian dimurnikan
ditandai dan profil protein dianalisis di SDSPAGE dengan menunjukkan band
yang cocok. Studi saat ini jelas menunjukkan dan menjelaskan bahwa mikroba
dapat digunakan dalam pembuatan jus buah dan di berbagai industri untuk biaya
produksi yang efektif pektinase. Keuntungan lainnya adalah bahwa sifat-sifat
enzim dapat diubah dengan mengubah gen yang bertanggung jawab untuk
karakteristik tertentu melalui teknologi rDNA untuk meningkatkan produksi.
DAFTAR PUSTAKA

Basset, J. Dkk. 1994. Vogel: Kimia analis kuantitatif. Jakarta: EGC


Berutu, Cocok A M. 2017. Isolasi Mikroba Penghasil Pektinase dan Optimalisasi
Produksinya Pada Penjernihan Sari Buah Apel (Malus domestica). Tesis.
Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Bierbaum G, Karutz M, Weuster-Botz D, Wandrey C. 1994. Production of


protease with Bacillus licheniformis mutants insensitive to repression of
exoenzyme biosynthesis. Applied Microbiol and Biotechnol. 40: 611-617.

Blanco P, Sieiro C, Díaz A, Villa TG. 1994. Production and partial


characterization of an endopolygalacturonase from Saccharomyces
cerevisiae. Canadian J of Microbiol. 40: 974-977.

Borin, MDF, Said S, Fonseca MJV. 1996. Purification and biochemical


characterization of an extracelular endopolygalacturonase from Penicillium
frequentans. J of Agr and Food Chem. 44: 1616-1620.

Brasil IM., Maia GA, de Figueiredo W. 1995. Physicalchemical changes during


extraction and clarification of guava juice. Journal Food Chem. 54(4): 383-
386.

Cao J, Zheng L, Chen S. 1992. Screening of pectinase producer from alkalophilic


bacteria and study on its potential application in degumming of ramie.
Enzyme and Microbial Technol. 14: 1013-1016.

De Vries RP, Visser J. 2001. Aspergillus enzymes involved in degradation of


plant cell wall polysaccharides. Microbiol Molecular Biology. 65(4): 497-
522.

Hambali, Elita. 2007. Teknologi Bioenergi. Bandung: ITB.


Jayani RS, Saxena S, Gupta R. 2005. Microbial pectinolytic enzymes: a review.
Process Biochem. 40: 2931-2944.

Kashyap DR, Chandra S, Kaul A, Tewari R. 2000. Production, purification and


characterization of pectinase from a Bacillus sp. DT7. World J Microbiol
Biotech. 16: 277-282.

Kumar MDJ, Saranya GM, Suresh K, Andal Priyadharshini D, Rajakumar R,


Kalaichelvan PT. 2012. Production and optimization of pectinase from
Bacillus sp. MFW7 using cassava waste. Lant Sci Research Suppl. (3): 369-
375.

Oszmianski J, Wojdylo A, Kolniak J. 2011. Effect of pectinase treatment on


extraction of antioxidant phenols from pomace, for the production of
pureeenriched cloudy apple juices. Journal Food Chem. 127: 623–631.

Rai P, Majumdar GC, Gupta SD, De S. 2004. Optimizing pectinase usage in


pretreatment of mosambi juice for clarification by response surface
methodology. Journal of Food Engineer. 64(3): 397-403

Rohman, A. 2003. Kromatografi untuk Analisis Obat. Jakarta: Graha Ilmu


Serrat M, Bermúdez RC, Villa, TG. 2002. Production, purification and
characterization of a polygalacturonase from a new strain of Kluyveromyces
marxianus isolated from coffee wet-processing wastewater. App Biochem
and Biotechnol. 97: 193-208.

Sin H.N, Yusof S, Hamid NSA, Rahman RA. Optimization of enzymatic


clarification of sapodilla juice using response surface methodology. Journal
of Food Engineer. Available online July 2017.

Suhartono. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan


Kebudayaan, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Antar Universitas
Bioteknologi. Bogor: IPB.

Syaikh R., Nayak J., Mehta M., dan Shah G. 2018. Isolation, Screening, and
Characterization of Microorganism Producing Pectinase Enzyme From
the Ipomoea SPP. And Its Potential Application. International Journal of
Microbiology Research. India: Department of Biotechnology, Veer
Narmad South Gujarat University

Tapre AR, Jain RK. 2014. Optimization of an enzyme assisted banana pulp
clarification process. Int Food Research J. 21(5): 2043-2048.

Yadav S, Yadav P, Yadav D, Yadav K. 2008. Purification and characterization of


an acidic pectin lyase produced by Aspergillus ficuum strain MTCC 7591
suitable for clarification of fruit juices. Annals of Microbiol. 58: 61-65.

Yusof S, Ibrahim N. 1994. Quality of soursop juice afer pectinase enzyme


treatment. Food Chem. 50: 83-88.

Zheng Z, Shetty K. 2000. Solid state production of polygalacturonase by Lentinus


edodes using fruit processing wastes. Process Biochem. 35: 825-830