Ensayo sobre la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen.

Durante un siglo, el diagnóstico microbiológico de la tuberculosis, basado en la baciloscopia

y en el aislamiento e identificación de Mycobacterium tuberculosis en los cultivos, ha sido
poco sensible y lento lo que obligaba en ocasiones a iniciar de forma empírica tratamiento
con tuberculostáticos.
La incorporación rutinaria de medios de cultivo líquidos y técnicas de genética molecular,
en la última década del siglo XX, ha supuesto un avance importante al aumentar claramente
la sensibilidad, precisión y rapidez en el diagnóstico.
La actual eclosión de las técnicas moleculares está permitiendo un mejor conocimiento de
la epidemiología de la enfermedad, de los factores de virulencia y de los mecanismos de
resistencia lo que dará lugar, en un futuro inmediato, a nuevas estrategias de prevención y
tratamiento de la enfermedad.
A continuación, se abordará el tema de “La microscopía de fluorescencia en la investigación
del mycobacterium tuberculosis”. Primero adentraremos un poco al tema, sobre la
mycobacterium tuberculosis, qué es la fluorescencia y una vez teniendo estos
conocimientos como bases avanzaremos en el contenido donde a grandes rasgos se puede
decir que conoceremos que es un colorante; la técnica de Ziehl-Neelsen, así como su
fundamento y algunas de sus características, así como resultados de dos investigaciones
donde se utiliza la misma.

En 1882, Robert Koch describió el agente etiológico de la tuberculosis (TB) y lo denominó

Bacterium tuberculosis1. El nombre inicial fue sustituido por el de Mycobacterium
tuberculosis en 1896 por Lehmann y Neumann2. El término Mycobacterium significa hongo-
bacteria, y esta denominación se debe al aspecto de los cultivos, que en ciertos aspectos
recuerdan a los de los hongos. El descubrimiento de M. tuberculosis causó y sigue
causando admiración dadas las características del microorganismo. M. tuberculosis es una
bacteria que requiere técnicas especiales de tinción y medios de cultivo distintos a los
empleados habitualmente en bacteriología.
Por fluorescencia se entiende la propiedad de ciertos materiales que, al ser irradiados con
luz ultravioleta de onda corta invisible, absorben parte de esta y al mismo tiempo la emiten
en ondas más largas, visibles.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiología.3
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etc.
De acuerdo con su origen, se pueden dividir en:

 Colorantes naturales: los cuales son extraídos de plantas o animales.

 Colorantes artificiales: son aquellos de minerales procesados y manipulados en el
laboratorio.
Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un auxócromo.
El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción
característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que
tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el
nivel energético. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango de
espectro visible. Los cromóforos se pueden presentar en dos formas fundamentales: en
sistemas conjugados pi o complejos metálicos.
Los cromóforos son principalmente grupos funcionales con dobles y triples enlaces
carbono-carbono, anillos aromáticos, grupos carbonilos, imino, diazo, nitro y enlaces entre
carbono-y (y es un átomo con pares libres). Los auxócromos son grupos funcionales o
radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función
de intensificar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados;
su función es desplazar a los cromóforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar
la intensidad.
Los siguientes grupos funcionales son considerados auxócromos: grupo metilo, halógenos,
hidroxi, alcoxi y amino.4,5 Aunque los microorganismos vivos se pueden observar
directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos
para que, por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación,6 además,
la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos
permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo
color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial,
cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-
Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula
fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico).2,7
El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se asegura que la
preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo
tiempo de la evaluación de la muestra clínica, la tinción de un agente infeccioso ya
identificado mediante esa tinción, el cual funcionará como un control positivo.
Algunas técnicas tintoriales como Gram o Ziehl Neelsen requieren antes de su proceso la
fijación de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura estructural y química
de las células.6
Existen dos tipos de fijadores:

 Físicos
 Químicos.
Entre los procesos de fijación físicos se tienen los siguientes: desecación, calor seco, calor
húmedo, ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de fijación químicos se
pueden clasificar como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades químicas.
Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico, ácido acético, ácido
pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes químicos reductores son: formaldehído,
glutaraldehído, etanol, metanol, paraldehído, etcétera.7
Quizá el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste
en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los
procesos vitales de las células y los microorganismos. Sin embargo, la sobreexposición, o
la exposición en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona caliente y zona de fusión)
repercutirá en el efecto deseado; es muy común provocar alteraciones morfológicas y
destrucción celular.
Este método preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se recomienda utilizar un
método químico, que precipite proteínas, antes de teñir. Los métodos químicos ofrecen
mejores resultados para la fijación, ya que son líquidos con potencial alto de difusión
intracelular y detienen procesos enzimáticos que provocan autolisis. Los reactivos poseen
la capacidad de interactuar con biomoléculas como proteínas, glicoproteínas,
peptidoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos.
El metanol es un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante,
de tal manera, coagula proteínas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se la
arquitectura de la pared celular y evita la sobrecoloración. El metanol tiene un potencial
reductor mayor que el etanol. La concentración ideal es > 99%. El metanol preserva la
integridad de los ácidos nucleicos, por lo que también es ideal para inmunohistoquímica e
hibridación in situ.3,8,9
A continuación, se mencionará una técnica de tinción utilizada en microbiología para la
identificación de mycobacterium tuberculosis, así como su fundamento e interpretación.
Tinción de Ziehl-Neelsen.
La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica común más usada en el diagnóstico rutinario de
tuberculosis.4,7 Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda
realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite diferenciar a las bacterias
en dos grupos:

 Los que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido.

 Los que no lo son.7
La sensibilidad de esta tinción para identificar bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74%
y la especificidad del 98%, teniendo un límite de detección de 5,000-10,000 bacilos/mL de
muestra.9
El agente etiológico de la tuberculosis fue descrito por Heinrich Hermann Robert Koch,
quien, basándose en las características de las micobacterias, desarrolló una de las primeras
tinciones utilizando azul de metileno seguido de la tinción de Bismarck. Sin embargo, fueron
los trabajos de Paul Ehrlich los que definieron la resistencia a la decoloración por alcohol-
ácido, y las últimas modificaciones a la tinción fueron realizadas por los científicos alemanes
Franz Ziehl y Karl Adolf Neelsen.6
El género Mycobacterium es el único miembro en la familia Mycobacteriaceae y está
relacionado con otros géneros que contienen ácidos micólicos (Gordonia, Tsukamurella y
Rhodococcus), los cuales también pueden ser teñidos con esta tinción.6,7,8 La pared celular
de las micobacterias es extremadamente compleja en cuanto a su composición bioquímica;
dicha característica es la que se ha aprovechado para realizar la tinción de Ziehl-Neelsen.
La pared celular está compuesta por ácido mesodiaminopimélico, alanina, ácido glutámico,
glucosamida, ácido murámico, arabinosa y galactosa. Los ácidos micólicos (70-90 número
de átomos de carbono) junto con lípidos libres (ej. trealosa-6,6´-dimicolato) proveen a la
célula de una barrera hidrofóbica. Otros ácidos grasos importantes son: ceras, fosfolípidos,
ácidos micoséricos y phtienoico.9
La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para
solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el
paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos micólicos presentes
en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar,
resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como
contratinción.9 Una tinción positiva es aquélla en la que se observan bacilos ácido-alcohol
resistentes, los cuales son de color rojo fucsia. La evaluación y reporte de las laminillas se
realiza de acuerdo con el cuadro I.

Por otro lado, de acuerdo con la investigación de los siguientes autores Dra. Nilda Cafure’,
Dra. Gladis E. Amadío, Fernando Centeno, Boris Carpio y Beatriz Lei bovich, sus
resultados con dos técnicas diferentes, entre ellas la técnica de Ziehl-Neelsen, fueron los
siguientes:
Se analizaron los resultados obtenidos con microscopia por fluorescencia y se tomó como
método de referencia la coloración de Ziehl-Neelsen y los resultados obtenidos con ambas
técnicas de observación microscópica con relación al cultivo. El cuadro 1 pone de manifiesto
que el 87.6% resultó negativo por ambas técnicas y el 7.8 % positivo. En otras palabras, en
el 95.4% de los casos coincidieron los resultados, obtenidos por ambas técnicas, mientras
que en los casos en que el resultado fue positivo por una sola de las técnicas empleadas,
la microscopia por fluorescencia resultó ligeramente superior.

El cuadro 2 expresa los resultados obtenidos en las 283 muestras estudiadas por
microscopia con Ziehl-Neelsen y fluorescencia y cultivo en Loewenstein-Jensen. Las tres
investigaciones resultaron negativas en el 73.5 % de los casos, y positivas en 9.5 %. En el
12.0 % de los casos el diagnostico se realizó solamente por el cultivo, ya que el examen
microscópico fue negativo por las técnicas empleadas. No hubo diferencia significativa entre
los resultados del examen microscópico por Ziehl-Neelsen y por fluorescencia en relación
con el cultivo. En el 0.36 % de los casos se puso de manifiesto la presencia de gérmenes
no viables.
En resumen, se puede decir que se hizo un estudio comparativo de la microscopia por las
técnicas de Ziehl- Neelsen y de fluorescencia en 653 muestras. Ambas técnicas dieron los
mismos resultados en el 95.4% de los casos, aunque la micros- copia por fluorescencia
resultó ligeramente superior en los casos en que el resultado fue positivo por una sola de
las técnicas emplea- das. En 283 muestras se practicó, además, cultivo en Loewenstein-
Jensen. Las tres investigaciones resultaron negativas en el 73.5 % de los casos y positivas
en 9.5%. En el 12.0% de los casos el diagnóstico se realizó por cultivo, ya que el examen
microscópico fue negativo por las dos técnicas empleadas. No hubo diferencia significativa
entre los resultados del examen microscópico por Ziehl-Neelsen y por fluorescencia en
relación con el cultivo.
Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y
el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso
universal que ayudan al diagnóstico microbiológico.
Se puede decir que hay una técnica más precisa que la técnica de Ziehl-Neelsen, sin
embargo, ésta es más barata, fácil y a pesar de que hay otra más precisa, esta suele tener
un buen rango de asertividad.
Uno de los objetivos de este trabajo era dar a conocer la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen,
el cual se ha cumplido satisfactoriamente puesto que se ha tratado de explicar de la mejor
manera.
También es importante tener en cuenta que esta técnica es muy utilizada en laboratorios
clínicos y es crucial que las personas que trabajan en ellos sepan la importancia y qué tipos
de tinciones se deben realizar al momento de realizar un estudio. Además, de que esta es
una de las más rápidas, económicas y más conocidas, hay otras técnicas que son un poco
más costosas que pueden llegar a dar un resultado igual o hasta mejor.

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