Abundancia del Multiheme c-Tipo Cytochrome OmcB

Aumentos en Exteriores Biofilm Capas de Electrodo-

Crecido Geobacter sulfurreducens
Camille S. Stephen 1, Edward V. LaBelle2, Susan L. Brantley3, Daniel R. Vínculo 2,4*
1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, La Pensilvania Universidad Estatal, Parque Universitario, Pensilvania, Estados Unidos de América, 2 Instituto
de Biotecnología, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota, Estados Unidos de América, 3 Departamento de Geosciences, La Pensilvania Universidad
Estatal, Parque Universitario, Pensilvania, Estados Unidos de América, 4 Departamento de Microbiología, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota,

Abstracto
Cuándo Geobacter sulfurreducens utiliza un electrodo como su aceptor de electrón, células embed ellos en un conductores
biofilm decenas de microns gruesos. Mientras condiciones medioambientales como pH o redox el potencial ha sido
mostrado para cambiar cercano al electrodo, menos es sabido sobre la respuesta de G. sulfurreducens A crecimiento
en este biofilm entorno. Para investigar si abundancia de proteína respiratoria varía con distancia de el electrodo,
anticuerpos contra una membrana exterior multiheme cytochrome (OmcB) y acetato citoplasmático kinase (AckA) solió
determinar proteína localization en los trozos que abarcan ,25 mm-G grueso. sulfurreducens biofilms Creciendo encima
abrillantó los electrodos preparados en +0.24 V (vs. Electrodo de Hidrógeno Estándar). Los trozos eran immunogold labeled
que fijan correo, imaged vía microscopia de electrón de la transmisión, y digitalmente reassembled para crear las
imágenes continuas que dejan subcellular ubicación y abundancia por célula para ser cuantificada a través de un entero
biofilm. OmcB Era predominantemente localized encima membranas de célula, y 3.6-plegar más OmcB estuvo
detectado en células 10– 20 mm distantes de la superficie de electrodo comparó a capas interiores (0–10 mm). En
contraste, acetato kinase quedó constante durante el biofilm, y era siempre asociado con el interior de célula. Este
método para detectar proteínas en intactos conductores biofilms apoya un modelo donde la utilización de redox
cambios de proteínas con profundidad.
Cita: Stephen CS, LaBelle EV, Brantley SL, Vínculo DR. (2014) Abundancia de el Multiheme c-Tipo Cytochrome OmcB Aumentos en Exteriores Biofilm
Capas de Electrodo-Crecido Geobacter sulfurreducens. PLoS UN 9(8): e104336. doi:10.1371/revista.pone.0104336
Editor: Hauke Smidt, Wageningen Universidad, Netherlands
Marcha recibida 21, 2014; julio Aceptado 14, 2014; agosto Publicado 4, 2014
Copyright: © 2014 Stephen et al. Esto es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los plazos del Creativos Commons Licencia de Atribución, el
cual permite unrestricted uso, distribución, y reproducción en cualquier medio, proporcionado el autor original y la fuente están abonados.
Disponibilidad de dato: Los autores confirman que todos los datos subyacentes los hallazgos son plenamente disponibles sin restricción. Todo dato
coyuntural es dentro del papel y sus archivos de Información De apoyo.
Financiación: Este trabajo se mantuvo con las fuentes de financiación siguientes: la Fundación de Ciencia Nacional, el cual financió El Centro para
Medioambiental Kinetics el análisis debajo Concede Núm. CHE-0431328 (S.L.B., C.S.S.) (www.nsf.gov); Alfred P. Sloan Programa de Beca de Licenciado de
fundación (C.S.S.) (http://sloanphds.org/ sloan/Sloan.aspx?pageid = 30); Departamento de EE.UU. de la energía debajo Concede Núm. DE-SC0007058 (M.T.)
(Http://energía.Gov/); La Oficina de la búsqueda Naval debajo Concede Núm. N000140810162 (E.V.L.) (www.onr.navy.mil); Y Departamento de EE.UU. de
Energía, Oficina de Ciencia (Búsqueda Biológica y Medioambiental) debajo Concede Núm. DE- SC0006868 (D.R.B.) (http://science.energy.gov/ber/). El funders
tuvo ninguna función en diseño de estudio, colección de dato y análisis, decisión para publicar, o preparación del manuscrito.
Compitiendo Intereses: Los autores han declarado que ningún interés de competir existe.
* Email: dbond@umn.edu

Estados Unidos de América.

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 OmcB Y Acetato Kinase en Geobacter Biofilms
Introducción
La estrategia respiratoria anaeróbica sabida como dissimilatory reducción de metal probablemente evolucionada mucho tiempo antes de
la atmósfera de la Tierra devenía aeróbica [1,2], y queda un proceso significativo para geochemical ciclismo en sedimentos y subsurface
entornos [1,3]. Cuando la reducción de óxidos de metal puede apoyar oxidación microbiana de orgánico contaminants, y la reducción
microbiana puede alterar la solubilidad de metales, dissimilatory reducción de metal es también de implicado en bioremediation y
bioprecipitation de metales pesados [4–6]. Un metal de modelo-reduciendo la bacteria capaz de reducir ambos metales solubles e insolubles
es Geobacter sulfurreducens [7]. Gusta más Geobacter tensiones, G. sulfurreducens Puede también superficies de electrodo del uso como
aceptors de electrón terminal, dejando generación de electricidad [8–10].
Cuando en contacto con electrodos, G. sulfurreducens Las células son capaces de transferencia de electrón de membranas de célula para
apoyar crecimiento. Células de hija entonces crecen tan capas a cada otro, conectados por pathways bastante conductores para transferir
decenas de electrones de microns, dejando respiración por todas las células en el biofilm
[8,11,12]. Transferencia de electrón por G. sulfurreducens Electrodo biofilms es dependiente a múltiple extracellular las proteínas sujetaron
a células [8,9,11], en contraste a representantes del genus Shewanella, los cuales confían encima ocultados FMN como electrón soluble
shuttle para reducción de aceptors distantes [8,13–16].
Dentro de Geobacter electrodo biofilms, nutriente, pH, redox o los gradientes eléctricos pueden existir aquello afecta fisiología de célula.
Por ejemplo, conducción de electrones a través de activos biofilms aparece para devenir limitando en distancias 10–20 mm de la superficie
de electrodo, basado en microelectrode [17], espectral [18,19], fuente- experimentos de desagüe [12,20], y confocal Raman espectroscopia
[21]. Un gradiente de pH también puede existir a través del biofilm, donde las capas interiores experimentan un pH más bajo [22–24].
La existencia de estos gradientes ha dirigido a los estudios que intentan para detectar cambios en expresión de gen a través de este
estrecho ,20 mm ventana entre la superficie de electrodo y capas exteriores. Franks Et al. [25] actuó el primer microarray análisis encima
G. sulfurredu- cens biofilm Capas por microtoming secciones a interiores (0–20 mm) y exteriores (30–60 mm) folíolos. De 146 genes
differentially

Expresado [25] pocas diferencias estuvieron observadas con los genes enlazaron a transferencia de electrón, como aquellos codificando
multiheme cytochromes, así como subunits de Tipo IV pili. Immunogold Etiquetado del G. sulfurreducens extracellular cytochrome OmcZ
Sugirió en- abundancia de proteína arrugada cierra al electrodo (,5 mm) [26], pero experimentos de fusión del promotor que visualizan
omcZ la expresión era incapaz de detectar cualquiera tal gradiente en omcZ expresión, sugiriendo que diferencias en OmcZ se podría deber
a movilidad de este loosely sujetó cytochrome, o diferencias en densidad de célula cerca el electrodo [27].
Para este trabajo, un multiheme membrana exterior cytochrome (OmcB) sabido de ser regulado en respuesta a condiciones
medioambientales [28–31] estuvo seleccionado como objetivo para un anticuerpo-aproximación basada para medir cambios en abundancia
de proteína dentro de Geobacter ánodo biofilms. Acetato kinase estuvo seleccionado como control para proteínas intracelulares. Todas las
medidas estuvieron actuadas utilizando biofilms crecidos encima abrillantó ánodos, para minimizar variabilidad en distancia de los
electrodos, e imágenes de resolución alta múltiples era digitalmente reconstruido para obtener composite las imágenes que abarcan el enteros
biofilm para cada experimento de etiquetado. Este dato confirmó que etiquetado directo de resina-embedded Geobacter biofilms puede soler
determinar proteína localization y detectar cambios en abundancia de proteína durante un biofilm.

Resultados
Biofilm Crecimiento
G. sulfurreducens Las células sujetaron a electrodos preparados (n = 8) sin lag, aumentados a una densidad actual de . 700 mUn/cm2, y
era todo cosechado en la misma etapa de crecimiento (Higo. 1Un). Estos índices de crecimiento y las densidades actuales eran propio de
Geobacter biofilms crecidos grafito abrillantado encima electrodos [8,11,32]. Ningún biofilms pérdida demostrada en producción actual
cuándo el medio gastado estuvo sacado y reemplazado con medio fresco. Cyclic Análisis de voltamperometría cedió un sigmoidal ola
catalítica con un característico midpoint potencial (ca. 20.15 V) visto en crecer Geobacter biofilms (Higo. 1B). Confocal Microscopia de
electrodos en qué G. sulfurreducens biofilms Estuvo crecido bajo las condiciones similares revelaron biofilms de células intactas, basados
en Vivos/Muertos staining, extendiendo ,20 mm de la superficie de electrodo [8,33,34]. Este grosor emparejó la resina-embedded
trozos imaged vía TEM, indicando poco encogimiento, derrumbamiento, o pérdida del biofilm ocurrió durante fijación.
Higo. 2Unos espectáculos un representativos TEM micrograph de un G. sulfurreducens biofilm Crecido en el anodic electrodo, abarcando
encima 20 mm (el electrodo está indicado por la flecha). Las células que crecen más cercanos al electrodo era longitudinally orientó, y
densamente empaquetado, causando la densidad de célula cerca el electrodo para ser encima 30% más alto que en regiones más distantes
del electrodo.

Análisis de OmcB abundancia en biofilms utilizando immunogold etiquetado

Después de que desarrollo de anti-OmcB anticuerpos y condiciones de etiquetado (ve Métodos), 70-nm gruesos biofilm los trozos eran
immunogold labeled e imaged vía TEM. Dos tendencias eran inmediatamente aparentes en todas las imágenes y era más tarde substantiated
por análisis cuantitativo. Primero, la mayoría de OmcB el etiquetado estuvo asociado con la membrana de célula, indicando que proteínas
embedded en las membranas estuvieron expuestas por microtome slicing. Segundo, las células más lejanas del electrodo (10 mm a 20 mm)
tuvo una densidad más alta de membrana-asociado OmcB. Las imágenes representativas están mostradas en Higo. 2B y 2C. Las partículas
contaron tan membrana-asociado (dentro 15 nm de una membrana visible) está indicado en rojo, y las partículas intracelulares están
destacadas en

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Figura 1. Crecimiento de biofilms para análisis. (Un) el rastro Representativo que muestra producción actual por un G. sulfurreducens biofilm
Utilizando 30 mM acetato como el donante de electrón en un electrodo de grafito abrillantado preparado en +0.24 V Hidrógeno vs. Estándar
Electrodo. Acetato adicional (30 mM) estuvo añadido dónde indicado, y el medio estuvo reemplazado para sacar planktonic células. (B) Cyclic
Voltamperometría (1 mV/s) de el electrodo mostrado en Un, produciendo el característico sigmoidal respuesta actual de un G. sulfurreducens
biofilm-Electrodo colonizado. Todo biofilms estuvo crecido simultáneamente del mismo inóculo bajo condiciones idénticas, estuvo
cosechado y fijado en resina al mismo tiempo. doi:10.1371/revista.pone.0104336.G001

Negro. La distancia de 15 nm para asociación de membrana estuvo basada en la longitud del conejo IgG anticuerpo (8.6 nm), más la
longitud de anticuerpos secundarios [35].
A mejor cuantificar la abundancia y localization de OmcB, una serie de 12–15 alto-resolución TEM imágenes en 10,0006 magnification
estuvo recogido, y digitalmente re-reunido para producir un cuadro continuo de un entero biofilm. Cada biofilm entonces podría ser dividido
a 2 mm secciones, empezando de la superficie de electrodo. Dentro de cada sección, partículas de oro estuvieron separadas a dos categorías;
aquellos dentro de la célula, y aquellos en la membrana. Una imagen cruda que muestra el proceso de digital re- la asamblea que utiliza 13
imágenes de resolución alta está proporcionada en Supple- mentary Información (Higo. S1). Esta secuencia de slicing, alto- resolución
imaging, reconstrucción digital, y abundancia mea- surement estuvo actuado independientemente al menos 3 tiempo para OmcB análisis
de cuantificación.
Porque densidad de célula en el biofilm decreased fuera del electrodo, el número de partículas de oro tuvo que ser normalizado para

Figura 2. Representativo biofilm y etiquetado con anti-OmcB anticuerpo. (Un) Abajo-Microscopia de Electrón de Transmisión de resolución
la imagen que muestra un entero unlabeled G. sulfurreducens biofilm, ilustrando aumento en densidad de célula cerca la superficie de electrodo.
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(B) Ejemplos de digitalmente reconstruidos alto-imágenes de resolución que representan células 16–18 mm de el electrodo labeled con anti
-OmcB anticuerpos. Los círculos rojos indican proteínas dentro 15 nm de la membrana, los círculos negros indican intracelulares localization.
(C) los ejemplos de células localizaron 6–8 mm de el electrodo, tomado del mismo biofilm reconstrucciones, con abundancia más baja de
OmcB..
doi:10.1371/revista.pone.0104336.G002
Presente de área de la célula. Así, la abundancia total de OmcB (como número total de partículas de oro por mm2 de células) podría ser
expresado como función de distancia del electrodo y está mostrado en Higo. 3.
Mientras algún OmcB era siempre detectado dentro de células, presumiblemente de apoproteins aguardando secreción, este baseline de
intracelular OmcB el etiquetado quedó abajo durante el biofilm (ca. 0.5 partículas por mm2), con encima 70% del detectados OmcB proteína
localized a la membrana en exterior biofilm trozos. Aun así, la abundancia global de membrana exterior-localized OmcB aumentó
significativamente con distancia de el electrodo. Una gama de 0.17 a
partículas por mm2 estuvo observado encima membranas de célula en el interiores 10 mm del biofilm, mientras una gama de 2.15 a 3.42
partículas por mm2 estuvo observado encima membranas de célula en el exteriores 12–20 mm del biofilm (n = 3).
Análisis estadístico (ANOVA con dos replicación de factor) de OmcB la abundancia en trozos cierra al electrodo vs. folíolos exteriores,
así como en la membrana vs. dentro de las células, estuvo actuado para verificar estas diferencias. Para todo biofilms analizó, el aumento
en OmcB etiquetado de células 12–20 mm fuera del electrodo era significativo en p-valores,0.001. La abundancia aumentada de
membrana vs. el etiquetado citoplasmático era significativo en p ,0.03 para todos los trozos analizaron.
Cuándo el mismo experimento de etiquetado estuvo actuado en los trozos que utilizan pre-suero inmune, pocas partículas estuvieron
detectadas, y ninguna tendencia en localization o la abundancia estuvo observada. Cuando este pre- el suero inmune estuvo obtenido de los
mismos animales antes de que exposición al OmcB proteína, y no tendría que contener anticuerpos

Figura 3. Abundancia de OmcB encima G. sulfurreducens Células en distancias diferentes del electrodo. Significa mostrado es el resultado
de seis imágenes diferentes compiló de tres diferente biofilms, +/2 SEM. Dato de etiquetado después de que incubación con anti -OmcB
anticuerpos (círculos rojos) vs. etiquetado con pre-suero inmune como control (triángulos negros).
doi:10.1371/revista.pone.0104336.G003

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A OmcB, esto representó un control para etiquetado no concreto de
Geobacter Células.

Análisis de acetato kinase immunogold etiquetado

Acetato kinase la abundancia era también analizada por immunogold etiquetado, como control para la capacidad de determinar ubicación
de proteína, y como marcador para activamente metabolizing células. Cuando con OmcB, múltiple TEM las imágenes estuvieron reunidas
a secciones contiguas de la superficie de electrodo al borde del biofilm. El etiquetado dentro de células estuvo observado durante el biofilm
(Higo. 4Un y 4B), y la distancia del electrodo tuvo ningún efecto encima densidad de partícula. Células 0–10 mm fuera del electrodo contuvo
una gama de 2.33 a 2.92 partículas por mm2 de células, mientras las secciones más lejanas del electrodo contuvo 1.68 a 2.68 partículas por
mm2 de células. En todas las regiones del biofilm, 78% de las partículas estuvieron detectadas en el interior de las células, con casos muy
raros de etiquetado entre células cuál podría indicar célula lysis o liberación de acetato kinase. Nonspecific El etiquetado era también abajo
para el acetato kinase pre- suero inmune labeled biofilm (Higo. 5).

Discusión
Cuándo Geobacter especie oxidize acetato, son absolutamente dependientes a transferencia de electrón a un aceptor de electrón terminal
para generación de energía. Comparado al uso de partículas de óxido del metal o compuestos solubles, el electrodo biofilm entornoCrea
retos fisiológicos únicos [23,24,36,37]. Además de la necesidad de mantener una red conductora capaz de llevar una carga nunca creciente
cuándo creciendo en capas de célula más distancia del electrodo, transferencia de negativamente cobró los electrones al electrodo crea una
necesidad para cargo positivo a difuso outward para mantener ambos cargo y equilibrio de pH [12,17,19,23]. Mucha búsqueda reciente ha
sido centrada encima cómo, o si, Geobacter responde a estos retos.
Mientras muchos multiheme c-tipo cytochromes puede jugar funciones en reducción de metal [28,38–43], un cytochrome aquello está
conservado y coherentemente identificado en estudios con G. sulfurreducens Es OmcB. OmcB Es un putative lipoproteína dodecaheme c-
tipo cytochrome cuál fracciona en la fracción de membrana exterior [44,45], y ha sido mostrado vía immunolocalization para ser expuesto
en la superficie exterior [46]. Muchos fenotipos mutantes en Fe(III) la reducción puede ser localizada a defectos en omcB expresión o
traducción [40,47,48]. Por ejemplo, deletion del gen que codifica el diheme peroxidase MacA disminuciones omcB transcripts a undetectable
niveles y negativamente impacta Fe(III) reducción, mientras expresión de omcB de un promotor constitutivo en un DmacA el mutante
restaura Fe(III) reducción [40,47,49–51]. Cuando uno del más conservado cyto- chromes entre el Geobacteraceae, y cuando el cytochrome
más a menudo enlazado a transferencia de electrón allende la membrana de célula, OmcB estuvo escogido como objetivo para esta
prueba-de-estudio de concepto.
Cambios en cytochrome expresión por planktonic células durante Fe(III)- o reducción de electrodo ha sido informada utilizando ADN

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Figura 4. Anti-Acetato kinase etiquetado de G. sulfurreducens biofims. (Un) Ejemplos de digitalmente reconstruidos alto-imágenes de
resolución que representan células 16–18 mm del electrodo labeled con anti -acetato kinase anticuerpos. Los círculos rojos indican proteínas
dentro 15 nm de la membrana, los círculos negros indican intracelulares localization. (B) Los ejemplos de células localizaron 6–8 mm de el
electrodo, tomado de el mismo biofilm reconstrucciones.
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microarray [52,53] y proteomic [31,42] aproximaciones. Aun así, cuando células en un biofilm no es todo expuesto a condiciones
idénticas, tales análisis globales pueden representar medias que lugareño de escondrijo microen- vironments. Nosotros hypothesized que
por reunir alto-imágenes de resolución de biofilms creciendo en superficies para minimizar variabilidad en edad de célula y distancia de
el electrodo, mientras contabilidad para diferencias en densidad de célula, el dato cuantitativo relacionó a ambas ubicación celular y
abundancia de proteína global por célula podría ser obtenida. En estos experimentos, la abundancia total de OmcB estuvo encontrado para
aumentar con distancia de el electrodo, un encontrando que se podría deber a dos factores; diferencias en abundancia de proteína por
célula, o variabilidad en etiquetado de anticuerpo. Con consideraciones a etiquetado de anticuerpo, resina delgada-embedded secciones de
célula son generalmente utilizadas para cuantificar proteínas de membrana integral en diferentes bacterial genera, incluso cuándo las
células son estrechamente asociadas [53–57]. Mientras métodos que el uso centellea-helado puede preservar aspectos delicados de
celulares ultrastruc- ture, el antigenicity de proteínas de objetivo es mejores preservados en resina- embedded muestras, probablemente
porque congelación-métodos de sustitución requieren utilizar el químico fixative osmio tetroxide, el cual afecta
Proteína antigenicity [55].Para minimizar artefactos de etiquetado en este estudio, slicing solió da antigens probabilidad igual de ser
expuesto, comparado a in situ etiquetado con anterioridad a slicing donde la célula que empaqueta o acceso de límites de la asociación. G
crudo. sulfurreducens Imágenes (proporcionados en Higo. S1) demostró etiquetado en ambas célula-cruces de célula y membranas
expuestas, proporcionando evidencia de apoyo que algún antigens en la interfaz era accesible a anticuerpos, a toda costa de condiciones
locales. Mientras escogido para su carencia informada de sesgo [58], la resina embedding-slicing el método adolece el hecho que lo sólo
tiene que etiquetar un porcentaje muy pequeño de presente de proteínas en membranas, cuando cada trozo probablemente contiene
centenares de OmcB objetivos, sólo unos cuantos de los cuales están expuestos en la interfaz. Para compensar para esta eficacia baja, todo
embedding, slicing, y pasos de etiquetado estuvieron actuados juntos, de modo que cambios en la cantidad de la proteína detectada más
podría reflejar abundancia global.
Si OmcB es más abundante en secciones superiores del electrodo- crecido biofilm, entonces qué podría las células estar respondiendo a?
Expresión de omcB está afectado por la tensión-relacionado sigma factor RpoS [59–61] y el stringent respuesta [62,63]. Más pertinente a
crecimiento en estos biofilms, el cual era bajo niveles de donante de electrón constantes y condiciones de nutriente, es el hecho que
expresión de omcB.

Figura 5. Abundancia de acetato kinase isozymes en distancias diferentes del electrodo. Significa mostrado es el resultado de seis imágenes
diferentes, +/2 SEM. Dato de etiquetado después de que incubación con anti -acetato kinase anticuerpos (círculos rojos) vs. etiquetado con pre-
suero inmune como control (triángulos negros).
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Aumentos cuándo G. sulfurreducens Está limitado para Fe(III) como un aceptor de electrón [30,64]. Una hipótesis es que, cuando las capas
más lejanas fuera del electrodo devenido más reducido, menos aceptor de electrón es disponible en estas regiones, y OmcB aumentos en
respuesta. Más generalmente, si las regiones exteriores del biofilm oferta menos oportunidades para transferencia de electrón, maquinaria
de transferencia de electrón extra puede ser necesitada para conseguir índices similares de eliminación de electrón.
El concepto que la porción exterior del Geobacter electrodo biofilm representa una zona de limitación de aceptor del electrón no es nueva.
Las observaciones espectrales muestran casi 50% de c -tipo cyto- chromes queda reducido cuándo las células están creciendo en las películas
similares a aquellos utilizados en este estudio [19], una observación también apoyada por confocal Raman espectroscopia [21].
Microelectrodes Perspicaz más grueso (,150 mm) G. sulfurreducens biofilms Creciendo en los electrodos mostraron que regiones
exteriores del biofilm era en bajo redox potencial, y oxidized las zonas eran sólo detectadas en la porción interior de la película [17].
Fuente-medidas de desagüe que utilizan
G. sulfurreducens Filma crecido a través de los vacíos pequeños también mostraron que redox el potencial puede ser significativamente
bajar sólo 10 mm fuera de un oxidizing electrodo [12]. Cuando OmcB aparece para aumentar a lo largo de la misma balanza espacial, esto
sugiere que Geobacter puede notar y responder a redox potencial, en una manera similar a su capacidad sabida de notar Fe(III) disponibilidad.
En contraste a OmcB, acetato kinase el etiquetado era compatible a través del biofilm, proporcionando ninguna evidencia para cambios
en acetato
Concentraciones. Cuando estas células estuvieron cultivadas con niveles altos de acetato (30 mM), y el acetato nunca es agotado bajo
saturating concentraciones en estos delgados biofilms, el hallazgo de acetato compatible kinase los niveles no sorprendía. Redox Manchas
y viability manchas [25,27], también ha proporcionado evidencia de metabolismo activo durante biofilms de este grosor.
En general, estos resulta uso de soporte de immunogold etiquetado y biofilm reconstrucción a simultáneamente estudiar ambas proteína
localization y abundancia con resolución alta. En este experimento inicial, una diferencia en OmcB la abundancia estuvo detectada, y la
proteína estuvo asociada con superficies de célula incluso en biofilms donde extensos extracellular las conexiones son sabidas de formar.
Experi- ments Está necesitado aquello aplica esta aproximación a condiciones de crecimiento diferente, como cambios en electrodo redox
potencial. Estos experimentos podrían también proteínas de objetivo hypothesized para ser ocultados al espacio entre Geobacter células,
los cuales ofrecen oportunidades para calibración contra otro in situ métodos de etiquetado, y proporcionar un cuantitativo entendiendo de
cómo los cambios matriciales conductores para apoyar extracellular respiración en regiones diferentes del biofilm.

Procedimientos experimentales
Bacterial Condiciones de crecimiento
Geobacter sulfurreducens PCA Era routinely crecido con Fe(III) óxido (100 mM) como el aceptor de electrón y 20 mM acetato
cuando

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El donante de electrón, y transfirió 5 tiempo a medios de comunicación minerales con 20 mM acetato y 40 mM fumarate cuándo las células
estuvieron necesitadas para crecimiento de electrodo [8]. Todas las incubaciones estuvieron actuadas en 30uC bajo un 20% CO2/80% N2
atmósfera. El bioreactor constó de un jacketed vaso célula electroquímica (Instrumentos de Pino, Raleigh, NC) cupo con tapones de Teflón
hecho de encargo, puertos de muestra y ensenadas gasistas. Los electrodos laborables constaron de 2 cm2 AXF-5Q graphitic electrodos de
carbono (Poco Compañía de Grafito, Decatur, TX) aquello estuvo abrillantado con un 0.05 mm alúmina slurry (BASi, Del oeste Lafayette,
EN), sonicated en deionized agua, y limpiado con acetona, 1 M NaOH, 1 M HCl, y rinsed con deionized agua entre cada paso. Ocho
electrodos de grafito estuvieron suspendidos encima
0.25 mm cables de platino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) aquello estuvo soldado a calor de cable cobrizo-interior sellado 3 mm vaso
capillary entubando (Kimble, Vineland, NJ). Electrodos de contador de Pt era también construido en esta manera. Un Vycor frit-vertido
Luggin tubo con un.
0.1 M Na2ASÍ QUE4 1% agar puente de sal albergó un calomel electrodo de referencia (Cole-Parmer, Vernon Cerros, IL). Los electrodos
estuvieron colocados en barajó reactores, y conectados a canales de un VMP potentiostat (Bio-Lógica, Knoxville, TN).
Las células estuvieron cultivadas en medio con donante de electrón sobrante hasta la densidad óptica en 600 nm logró 0.6, y 60 mL estuvo
transferido al autoclaved el reactor que contiene 60 mL de medios de comunicación minerales con 30 mM acetato. Los electrodos eran
preparados en
0.24 V versus electrodo de hidrógeno estándar (ELLA), y 30 mM el acetato adicional estuvo añadido en 80 horas. Medio fresco con 30
mM el acetato estuvo añadido como actual plateaued (131 horas) para sacar planktonic y loosely sujetó células. Cyclic La voltamperometría
estuvo actuada en 1 mV/s de 20.56 a 0.24 V vs. ELLA encima sterile reactores, y en varios puntos de tiempo durante crecimiento. El
biofilm-aguantando los electrodos estuvieron cosechados en 150 horas, suavemente rinsed en sterile medios de comunicación y fijados en
una solución de 3% paraformal- dehyde y 0.05% glutaraldehyde buffered con 0.05 M sodio fosfato en pH = 6.8.

Preparación de biofilms para TEM

Después de que fijación, el biofilms era embedded en L.R. La resina blanca y la resina estuvo dejada a polymerize. El biofilms era
sectioned en el Penn Microscopia Estatal y Cytometry Facilidad (Parque Universitario, PA) a secciones verticales, de modo que cada trozo
abarcó el entero biofilm. El 70 nm las secciones gruesas estuvieron flotadas a verjas cobrizas (carbono coated) y permitted para secar antes
de immunolabeling.

Clonación y heterologous expresión de OmcB

La longitud llena omcB gen (2235 bp) estuvo amplificado vía PCR de G. sulfurreducens PCA ADN genómico. El primers utilizó para la
amplificación era OmcB delantero primer: (GCTAGCATGAG- TAGAAAAGTAACAAAGTAT) y OmcB inverso primer:
(CTCGAGCGGACGGGTCGT), el NheI y XhoI sitios de enzimas de la restricción están subrayados, respectivamente. El gen era sub-
clonado a pGEM T-vector fácil (Promega) y DH5unas células competentes. Las colonias estuvieron seleccionadas encima ampicilina, IPTG
y X-Gal platos (AIX platos) incubated en 37uC y entonces inoculados a Luria- Bertani (LB) medio con 100 mg/mL ampicilina para ser
screened para el omcB gen. ADN de plasmidio estuvo aislado de cada cultura que utiliza Macherey-Nagel Nucleospin caja y digerido con
NheI y XhoI enzimas de restricción. El omcB el gen era gel extraído y ligated a la mascota21un(+) plasmidio de expresión (Novagen) para
producir un Su-proteína de fusión de la etiqueta a través de heterologous expresión en BL21 (DE3) pEC86 células competentes. El pEC86
plasmidio [65] contiene los genes requirieron para heme maturation y también confiere chloramphenicol resistencia.
El transformó las células estuvieron seleccionadas en sólidos LB medio (incubated en 37uC) conteniendo 200 mg/mL ampicilina y 10
mg/ mL chloramphenicol. Las colonias estuvieron seleccionadas e inoculados a LB el medio que contiene 100 mg/mL ampicilina y 35
mg/mL chloramphenicol antibióticos y crecidos por la noche en 37uC. Para exploración de OmcB expresión, 1 mL de las células estuvieron
utilizadas como un inóculo en 11 mL LB medio con 100 mg/mL ampicilina y 35 mg/mL chloramphenicol antibióticos y crecidos en 37uC.
Expresión de proteína estuvo inducida con 1 mM IPTG cuándo la densidad óptica de las células logró 0.6 en 600 nm. Indujo las células
estuvieron crecidas para 3 horas con sacudir en 37uC. La expresión estuvo visualizada en SDS-PÁGINA gels stained con Coomassie R-
250 mancha. Las células que contienen el omcB-mascota21un plasmidio estuvo almacenado como glycerol stocks en un 274uC
congelador.
La longitud llena omcC gen (2307 bp) era también amplificado y expresado tan descrito para el omcB gen. El delantero primer la
secuencia era: GCTAGCATGAGTAGAAAAGTAACAAAG-
TAT Y el inverso primer la secuencia era: AAGCTTCG- GACGGGTCGC. El NheI e HindIII sitios de enzima de la restricción están
subrayados, respectivamente.

Purificación de recombinant OmcB

Para encima expresión y purificación del recombinant OmcB proteína, E. coli Células harboring el omcB-mascota21un plasmidio
estuvo inoculado a 500 mL de LB el medio que contiene 100 mg/mL ampicilina y 35 mg/mL chloramphenicol y crecido e inducido tan
anteriormente describió. Las células estuvieron cosechadas por centrifugación en 7,3116g para 10 minutos en 4uC y almacenados en
2 74uC. La purificación era vía un procedimiento modificado de aquel utilizado por [66]. La pelotita de célula era resuspended en 0.4
volúmenes de 50 mM Tris-Cl, pH 8 con 2 mM EDTA y 10 mM DTT. Luego, 0.01 volúmenes de 10 mM PMSF en 90% isopropanol, 10
mg/mL lysozyme y 1% Tritón X-100 estuvo añadido a la suspensión de célula. La suspensión de célula era incubated en 30uC para 30
minutos y las células sonicated cinco tiempo para 1 minuto cada vez, encima hielo. La suspensión de célula era entonces centrifuged
en 7,3116 g para 20 minutos en 5uC. La pelotita estuvo almacenada en 220uC. La pelotita era resuspended en justo bastante 50 mM
Tris-Cl, pH 8 buffer con 8 M urea, 2 mM ETDA y 1 mM DTT para conseguir la pelotita a solución. Un homogenizer solió
plenamente resuspend la pelotita en el buffer. La solución de pelotita estuvo aplicada a un Ni-NTA columna (Qiagen) equilibrated
con el obligatorio buffer (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl y 8 M urea, pH 8). El flujo a través de fracción estuvo recogido y la
columna lavada con 3 volúmenes de el lavado buffer (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl y 8 M urea, pH 6.3). La fracción de
lavado estuvo recogida y el OmcB proteína que estuvo atado a la columna era eluted con 10 mL de elution buffer (100 mM
NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea y 0.5 M imidazole, pH 8). Todo tres fracciones eran entonces resueltas en un 12% SDS-PÁGINA.
Coomassie staining Del gel reveló que el eluted la fracción consistió mayoritariamente del OmcB proteína. El eluted la fracción era
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entonces diluida con destilado H2O (para diluir el 8 M urea) y concentrado en un Amicon célula barajada con un 10 kDa cutoff
(Millipore) en 4uC a un volumen de 1 mL. El concentrado, purified la proteína era dialyzed en 4uC en 5 mM NaH2PO4 buffer, pH 7.
Uno intercambia de buffer estuvo actuado y la proteína pura estuvo almacenada en 220uC. Extracción de el urea resultó
en alguna precipitación de OmcB. La concentración de proteína estuvo determinada
Vía el Lowry ensayo [67] con BSA como el estándar.

Péptidos de acetato kinase para preparación de anticuerpo

Dos péptidos para etiquetado tanto acetato kinase isozymes estuvo seleccionado de las secuencias de proteína que utilizan el
hydropathicity programa de parcelas en www.vivo.colostate.edu (Colorado Universidad Estatal).

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Los péptidos seleccionaron, RRDVIEHASNGDHRC y CIEGLE- GIGIKLDRERNKGAM, es hidrofílico y putative antigenic

regiones de la proteína, propio para producción de anticuerpo. Las secuencias eran entonces comparadas a otras secuencias de proteína
en la proteína no redundanda base de datos a través de NCBI programa de EXPLOSIÓN de la Proteína. Los péptidos acetato
emparejado sólo kinase en G. sulfurreducens PCA Con el primer péptido que empareja AckA-1 (GSU2707) y el segundo péptido que
empareja AckA-1 y AckA-2 (GSU3448). El seqeunce de el segundo péptido que empareja AckA-2 era GIKLDRERN y el lysine el residuo
estuvo sustituido con un residuo de arginina en AckA-2. Un residuo de cisteína estuvo colocado en la amina terminus de el segundo
péptido de modo que pueda ser enlazado a una proteína cargadora para producción de anticuerpo. Ambos péptidos eran synthesized
por el Penn Estatal Hershey Facilidad de Núcleo Macromolecular.

Producción de anticuerpo
Purified OmcB Proteína y acetato kinase los péptidos estuvieron enviados a Covance Inc. de Servicios de Inmunología Hecho de encargo
(Princeton, NJ) como antigens para preparación de anticuerpo. Los anticuerpos estuvieron hechos en Nueva Zelanda conejos Blancos.
Anticuerpos a OmcB era afinidad purified tan anteriormente descrito [68]. La afinidad purified el anticuerpo estuvo mantenido en 220uC.
El acetato kinase los péptidos eran covalently enlazados a un Sulfolink Coupling Resina (Agujerea Biotecnología, Rockford, IL) en el
residuo de cisteína y utilizado a afinidad purify el acetato kinase anticuerpos. Los péptidos estuvieron enlazados al Sulfolink la resina basada
en las instrucciones del fabricante. El acetato kinase los anticuerpos eran purified basados en el procedimiento descrito en [69]. El OmcB y
acetato kinase pre-inmune sera era purified utilizando Proteína Un agarose resina (Sigma Aldrich) según el procedimiento del fabricante.
Todas concentraciones de anticuerpo estuvieron determinadas utilizando el Bradford ensayo [70].

Detección de OmcB y Acetato kinase

Proteínas de G. sulfurreducens Células enteras o de la membrana total (TM) estuvo separado en un SDS-PÁGINA y transferido a
nitrocelulosa para Occidental blotting con un 1:100 dilución de anti- OmcB afinidad-purified anticuerpo o 1:1000 dilución de anti-acetato
kinase afinidad-purified anticuerpo. El polyclonal OmcB el anticuerpo produjo sólo uno cruza-banda reactiva cuándo 10 mg de G.
sulfurreducens Proteína de membrana total estuvo analizada. E. coli Expresando cualquier OmcB u OmcC, un ligeramente más grande
homolog de OmcB cuál tiene 73% identidad de aminoácido, era también analizado vía Occidental blotting. Mientras OmcB era fácilmente
detectado con el OmcB anticuerpo, diez tiempo más la proteína tuvo que ser cargada para Occidental blots para revelar un faint banda para
OmcC. Densitometry Del Occidental blots con calibró los niveles de proteína indicaron el OmcB el anticuerpo hubo encima 30-plegar
afinidad más alta para OmcB comparó a OmcC.
Cuando acetato kinase estuvo pretendido para actuar como control para etiquetado de anticuerpo citoplasmático, los péptidos sintéticos
solieron generar un anticuerpo capaz de reconocer ambos acetato kinase isozymes expresó por G. sulfurreducens. Occidental blots de las
células detectaron ambas formas, en 47 kDa y 44 kDa, con la banda importante que es el isozyme de peso molecular más grande. Anterior
proteomic el dato también informado significativamente abundancia más alta de este isozyme debajo todas condiciones de crecimiento [31].
OmcB Y acetato kinase pre-inmune sera era también incubated con proteínas de membrana y células enteras, respectivamente, y no mostró
una banda que corresponde a OmcB o acetato kinase bajo cualesquier condiciones. Estos pre-inmune sera estuvo utilizado como controles
para nonspecific etiquetado de biofilms.
Immunolocalization De OmcB y acetato kinase en biofilm
Cada carbono-coated la verja cobriza que contiene un Geobacter biofilm trozo (abarcando el entero biofilm, parte superior a inferior)
estuvo dejado a incubate muestra-lado abajo en una gota de TBS (10 mM Tris-Cl, pH 8, 150 mM NaCl), para 1 minuto. Cada verja era
entonces colocada en una gota de 0.3% glicina en TBS para 5 minutos y entonces en una gota de 1% BSA en TBS para 30 minutos.
Después de este paso bloqueador, cada verja era incubated en una gota de 1:50 dilución de OmcB anticuerpo (0.6 mg proteína
total) en 1% BSA en TBS o en una gota de 1:100 dilución de acetato kinase anticuerpo (4 mg proteína total). Verjas separadas
incubated en purified pre-suero inmune para OmcB y acetato kinase estuvo utilizado como controles. Las verjas que estuvo utilizado
en el OmcB immunolabeling el experimento era incubated en el anticuerpo o pre-suero inmune para 10 horas en 4uC, basados en
preliminares immunolabeling experimentos con el OmcB anti- cuerpo que mostró incubaciones largas en temperatura baja etiquetado
aumentado sin creciente no-concreto atando por pre-controles de suero inmune. Las verjas para acetato kinase era incubated en el
anticuerpo o pre-suero inmune en temperatura de habitación para 1 hora. Cada verja era entonces lavada por colocarlo encima una
gota de TBS para
3 minutos (3 tiempo) y entonces en una gota de 1% BSA en TBS para 3 minutos (5 tiempo) para bloquear el biofilm antes de que
etiquetado con el anticuerpo secundario. Cada verja era entonces dejada a incubate en una gota del anticuerpo secundario: cabra anti-conejo
IgG anticuerpo secundario conjugated a 20 nm partículas de oro (BB Internacionales), el cual estuvo preparado como 1:100 dilución en
1% BSA y 0.1% pez frío gelatin en TBS. El etiquetado de anticuerpo secundario estuvo llevado a cabo para 1 hora en temperatura de
habitación. Cada verja estuvo lavada por colocarlo encima una gota de TBS cuando describió encima y entonces el biofilms estuvo fijado
por incubating les encima una gota de 1% glutaraldehyde en TBS para 5 minutos. Después de este paso, cada verja estuvo lavada por
colocarlo encima una gota de agua para 3 minutos (7 tiempo) y entonces negativamente stained en una gota de 2% uranyl acetato en agua
para 5 minutos en la oscuridad. Finalmente, cada verja estuvo lavada en una gota de agua para 1 minuto (5 tiempo) y dejado para secar
completamente (al menos 12 horas) antes de TEM imaging.

TEM imaging Y análisis de biofilms

Immunolabeled biofilms Estuvo visualizado utilizando un JEOL 1200 EX II electrón de transmisión microscopio (Estado de Pensilvania
Univer- sity, Parque Universitario) en 80 kV y un magnification de 10,000. Una serie de TEM las imágenes estuvieron reconstruidas a
continuos biofilm los cuadros que utilizan Adobe Photoshop CS2. La Imagen J software (NIH) era entonces utilizado para tomar
subsamples de cada biofilm, representando 2 mm increments de la superficie de electrodo. Para cada anticuerpo y análisis, tres completo
biofilms estuvo reconstruido.
Imagen J era también utilizado para medir área de célula dentro de cada trozo con la característica de Medida. Los valores de área de la
célula obtuvieron de Imagen J estuvo convertido a m m2 valores por determinar la longitud del 1 mm barra de escala en el TEM
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micrographs. El número de partículas de oro células de interior presente, y en la membrana estuvo contada utilizando el Contador de Célula
plugin de Imagen J.

Información de apoyo
Figura S1 imagen cruda Representativa. El dato crudo de uno completa puesto de 13 imágenes de resolución alta que abarcan un enteros
biofilm. Los trozos eran labeled con anti -OmcB correo de anticuerpos- slicing. De este dato crudo, tendencias en ambas densidad de célula,
OmcB etiquetado, y proteína localization puede ser visto antes de las imágenes estuvieron analizadas más allá. Después de esta
reconstrucción, las imágenes digitales estuvieron separadas a los campos que abarcan distancias del electrodo

Hablado en el texto y figuras, y volumen de célula relativa y el etiquetado midieron.

(TIF)

Acknowledgments
Gracias A Gilbert Ahlstrand en la Universidad de Minnesota para embedding biofilms para TEM, también Dr. Pandilla Ning y Missy Hazen del Penn
Microscopia Estatal y Cytometry Facilidad (Parque Universitario, PA) para asistencia con preparación de muestra para TEM. Gracias A Dr. Scott Geib y Dr.
Ruth Nissly para sugerencias en análisis de datos y Dr. Bruce Logan
Y Karl Shellenberger para G. sulfurreducens ADN. Algunos biofilms utilizados para testaje de anticuerpo preliminar estuvo crecido por Llamada de Douglas
del Dr.. D. R. B. se mantuvo con la Oficina de Ciencia (BER), Departamento de EE.UU. de Energía, DE-SC0006868.

Contribuciones de autor
Concebido y diseñó los experimentos: CSS DRB. Actuado los experimentos: CSS EVL. Analizado el dato: CSS DRB. Contribuyó herramientas/de
análisis/de materiales de reactivos: CSS EVL DRB. Contribuido a la escritura del manuscrito: CSS EVL SLB DRB.

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PLOS UN | www.plosone.org 14 August 2014 | Volumen 9 | Asunto 8 |

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