PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE.

Carrascal Lázaro Eduardo Luís1, Navarro Mejía Kiara Vanessa2, Oviedo Pérez
Andrea Carolina3, Rodríguez Pérez Yuleidys Yanine4.

+ Universidad de Sucre/ Facultad de Educación y Ciencias/ Programa Biología/

Laboratorio de Genética General/ Docente: Cristhian Mendoza.
*Email: eduardocarrascal005@gmail.com1, vakna.10@hotmail.com2,
mayan1995@outlook.com3, nnleguizamo@gmail.com4.
Septiembre 21/2015

RESUMEN

En el presente informe, se manifiestan los resultados arrojados para la purificación de

ácidos nucleicos a partir de muestras de sangre humana. Es importante destacar que
existen diversos métodos de purificación y extracción de ácidos nucleicos. En esta
experiencia, se empleó la técnica convencional, en donde se efectuó el protocolo sugerido
por la misma y justamente se usó como base sangre humana con el fin de obtener
genoma cromosómico de la misma. Dicho procedimiento, incluye instrucciones que van
desde la destrucción y lisis del material celular, seguido de una remoción de proteínas
típicamente obtenida por digestión con proteinasa K, y la extracción del ADN usando altas
concentraciones de sales. Finalmente el material genético es recuperado por precipitación
usando etanol.

Palabras Claves: Purificación, sangre humana, extracción de ácidos nucleicos, genoma

cromosómico, lisis celular, proteinasa K, sales, precipitación, etanol.

ABSTRACT

In this report, the results obtained for the purification of nucleic acids from human blood
samples manifest. Importantly, there are several methods of extraction and purification of
nucleic acids. In this experiment, the conventional technique, where the suggested by the
same and fairly human blood used as a basis in order to obtain chromosomal genome of
the same protocol was performed was used. Said procedure includes instructions ranging
from destruction and lysis of the cellular material, followed by removal of proteins typically
obtained by proteinase K digestion and DNA extraction using high salt concentrations.
Finally, the genetic material is recovered by precipitation using ethanol.

Keywords: Purification, human blood, extraction of nucleic acids, chromosomal genome,

cell lysis, proteinase K, salts, precipitation, ethanol.

INTRODUCCIÓN de las proteínas disminuye y finalmente

terminan por precipitar (salting out) [2]
Todas las células, a excepción de las
células de eritrocitos humanos, contienen El propósito de la experimentación, fue
ADN en sus núcleos. También se puede comprobar los buenos resultados que
encontrar ADN dentro de otros garantizan el método para la obtención
compartimientos celulares diferentes al de ADN y la distinción de propiedades
núcleo, como las mitocondrias. La características del material obtenido en
cantidad de ADN presente en algunos sangre humana. Además se verificó la
tejidos es muy pequeño; por este motivo eficiencia de la electroforesis y la
no representa una fuente conveniente de espectrofotometría como técnicas
extracción, aislamiento y purificación [1] analíticas para la cuantificación de
material genético.
Sin embargo, para la extracción del
mencionado ácido desoxirribonucleico,
existen diversos mecanismos (método
MATERIALES
comercial InstaGene Matrix, método con
Bromuro de Cetiltrimetilamonio,  Tubos eppendorf de 1.5 mL.
preparación de lisados crudos, salting  Freezer -20º C
out, extracción orgánica, etc). Sin  Centrifuga refrigerada
embargo, el procedimiento empleado por  Vortex
el grupo de trabajo, fue un método  Micropipetas
convencional; el cual funciona en  Puntas
presencia de altas concentraciones de  Buffer de lisis de células (TEN:
sales del medio, aumentando la fuerza 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-Cl
iónica del entorno celular, y la solubilidad pH.8.0, 1 Mm EDTA pH. 8.0)
  Solución amortiguadora de  SDS 10% (P/V)
eritrocitos (0.075 M NaCl,  Proteinasa K
0.024M EDTA).  Etanol absoluto frio
 Solución amortiguadora de TE  Etanol 70% (V/V)
(10 mM Tris, 1 mM EDTA)

METODOLOGÍA  Posteriormente, se centrifugo la

muestra a 12.000 r.p.m. por 10
Para la extracción y obtención de ácidos
minutos. A su vez, se le adiciono
nucleicos a partir de sangre humana, fue
0.6 volúmenes de sobrenadante.
propicio efectuar el protocolo de manera
 Luego, se adicionó 500 µL de
secuencial y precisa:
acetato de potasio 5 M; donde se
 En primer lugar, se utilizó una efectuó una mezcla por inversión
micropipeta, a través de la cual se e incubación en hielo durante un
trasfirió un volumen de 200 µL de espacio de 15 minutos.
sangre periférica a un microtubo  Conjuntamente, luego de la
de 1.5 mL. centrifugación a 12.000 r.p.m. por
 Se centrifugó la muestra anterior 10 minutos a 4º C. se añadió al
a 12.000 r.p.m. durante cinco sobrenadante, 0.6 volúmenes de
minutos a 40º C. Isopropanol frío.
 Se adicionaron 500 µL de buffer  Se incubaron las muestras
extracción al pellet obtenido (Tris durante 15 minutos a 76º C.
10 Mm, EDTA 1 mM, SDS 1%), la  La muestra se centrifugó
cual se homogenizó evitando la nuevamente a 12.000 r.p.m.
formación de burbujas en la durante 10 minutos; y
misma. posteriormente, se descartó el
 Se agregó 2.5 µL de proteinasa Isopropanol.
K, donde ésta se mantuvo  En este punto, se lavó el pellet de
incubada durante un tiempo de 40 ADN obtenido con 1 mL de etanol
minutos en baño de maría; la cual al 70%.
se ajustó con antelación a 55º C.  Se centrifugó a 12.000 r.p.m.
 En quinto lugar, se procedió a la durante 5 minutos; donde se
inactivación de la proteinasa a descartó el etanol.
95º C durante un minuto.
  Nuevamente, se centrifugó a computacional se obtuvo una
12.000 r.p.m. y se adicionó etanol serie de datos sobre
al pellet por 15 minutos. concentraciones y otras
 En decimoquinta instancia, se relaciones de ADN, ARN y sales
procedió a secar el pellet a minerales.
temperatura ambiente en un
rango de tiempo de 10-15 Para la Electroforesis
minutos.  Se agregó sobre la celda en gel
 En último lugar, se resuspendió la una porción cualitativa de la
muestra en 5 µL de agua muestra obtenida y mediante un
destilada estéril. software computacional se obtuvo
una imagen general sobre las
Para la Espectrofometría
bandas arrojadas por el ADN y su
 Se agregó sobre el Nanodrop una barrido.
gota de la muestra obtenida y
mediante un software

RESULTADOS

A continuación se muestran los resultados obtenidos en la muestra purificada,

porcentajes de ADN y otros componentes presentes en la misma.

DATOS:

 Concentración ADN: 12,2 ng/µL

• Abs240: 0,159

• Abs260: 0,159

• 240 / 260 (Pureza - [ ] proteínas): 1

• 260 / 230 (Pureza - [ ] c. orgánico): 0.157

Se halló la Abs230; la cual se tomó como referencia de acuerdo a los valores de Abs240
nm y de 240 / 230 (Pureza- [ ] c. orgánico) de la siguiente manera:

Abs240 / Abs230 = 0, 48

0,159 / Abs230 0.157

0,159/ 0.157 = Abs230

Abs230 = 1

Tabla nº 1: Longitud de onda inicial 226 nm

Resultado A260/1 mm
Concentración[]
12,2 ng/µL 0.150

Gráfica nº 1: Absorbancia vs longitud de onda

 DISCUSIÓN muestra se incubó con el fin de producir
la activación de la enzima [2].
La sangre es una sustancia propicia para
la obtención de ADN, pero en esta el En síntesis, al sobrenadante de la
material genético se encuentra asociado muestra se le adicionó cloruro de sodio
a otros componentes, como lo son las (NaCl), ya que esta sal precipita las
proteínas, sales y algunos proteínas y otros contaminantes
contaminantes, razón por la que fue presentes en dicha muestra. A este
necesaria la purificación de dicho método empleado y es una de las
material. El procedimiento experimental técnicas de extracción de ADN más
consistió en la obtención de ADN puro utilizados por su fácil implementación,
mediante la utilización de varios baja toxicidad de los reactivos y lo más
reactivos, los cuales fueron importante es que permite la
fundamentales para la respectiva visualización del ADN [2].
purificación del material genético.
A su vez, se realizó una centrifugación
Además, uno de los reactivos utilizados con el fin de obtener una mayor
en este proceso fue el buffer de precipitación de proteínas y
extracción o buffer de lisis el cual se contaminantes a partir de la muestra.
encargó de degradar las membranas Cabe resaltar, la importancia de la
celulares y extraer el DNA. Ya que este, adición de etanol absolutamente frío al
tiene como componentes principales Tris, sobrenadante obtenido, el cual elimina
EDTA y SDS; “los cuales sirven como sustancias inhibidoras que usualmente
agentes extractores de ADN cromosomal acompañan al material extraído [3].
(Tris y EDTA); y como agente de lisis el
La incubación de la muestra de ADN en
SDS” [1]. Luego de la primera
el freezer, se realizó para permitir que el
centrifugación, se utilizó el precipitado ya
calor suavice los fosfolípidos en las
que en este se encontraban las células
membranas que rodean la célula y el
sanguíneas necesarias para la
núcleo. También desnaturalizan a las
purificación del DNA. Asimismo, se le
enzimas desoxirribonucleicas (ADNasas)
adicionó a la muestra homogenizada
las cuales, si están presentes junto al
proteinasa k, ésta digiere las proteínas e
ADN, pueden cortar el ADN en
inactiva las nucleasas las cuales podrían
fragmentos tan pequeños que lo haría
haber degradado el DNA o RNA durante
imposible visualizar. Si las enzimas se
el proceso de purificación, por lo cual la
desnaturalizan y el ADN se desenrolla,
éste pierde su forma y se vuelve inactive concentración de un soluto presente en
[3] la misma [5]

Por lo tanto, la incubación se realiza con Para la determinación de ADN mediante

el fin de desnaturalizar las enzimas espectrofotometría se tomó como
presentes juntos al ADN y de esta referencia que los ácidos
manera evitar que se dañe el ADN por desoxirribonucleicos presentan un
las enzimas ADNasas. Al precipitado se máximo de absorbancia a 260 nm (12
le agregó 1ml de etanol para obtener una ng/µL tienen una OD a 260=0.150)
mejor y última purificación, al final se (Tabla 1), mientras que las proteínas lo
centrifugó, se descartó el etanol y se le tienen a 280 nm, aunque a 260 nm
agregó buffer TE, el cual contiene Tris y también presentan absorbancia.
EDTA, entre los cuales, el Tris mantiene Entonces se calculó la relación A260/
el pH constante y el EDTA inhibe la A280 y se pudo determinar que el ADN
acción de las nucleasas (ya que pueden era más o menos puro en la muestra
haber remanentes de ellas) y finalmente analizada; por lo que fue propio afianzar
se almacena a 8 °C en el freezer para la disparidad de ésta radica en errores de
conservar el genoma cromosómico tipo humanos, puesto que en la
contenido en la sangre. [4] manipulación final de purificación, no se
siguieron las sugerencias del protocolo
Por consiguiente, la espectrofotometría
de manera coordinada. (Ver gráfica 1)
es una técnica que permite medir la
concentración de las sustancias Para la electroforesis en los ácidos
utilizando la luz; esto se debe a que cada nucleicos la dirección de migración es del
molécula de cada sustancia absorbe las electrodo negativo al positivo, y esto es
la luz de forma distinta, dependiendo de debido a la carga negativa presente en el
cómo y de que las sustancia este esqueleto azúcar-fosfato. En los
constituida químicamente. Gracias a esto fragmentos de ADN dobles (con
podemos calcular la concentración al estructura de doble hélice) la velocidad
saber cuánta y cuál longitud de onda de migración es inversamente
puede absorber cierta sustancia; debido proporcional a su tamaño.
a que el AND se mide por la A260 a
través de un espectrofotómetro fundado
en la transmisión de la luz a través de
una solución para determinar la
 CONCLUSIÓN

Una vez culminada la experiencia es REFERENCIAS

posible concluir que:
[1] Butendieck B, Morales P, Figueroa J,
 Existen diversas maneras de Concha M, León G. 1995. Detección de
extraer ADN de la sangre Renibacterium salmoninarum por
humana, sin embargo, el método amplificación génica especifica. Arch.
empleado resulta ser eficiente y Med. Vet. ISSN 0301-732x.
se fundamenta en la presencia
[2] KLUG, W. S., y CUMMINGS, M. R.,
de altas concentraciones de
1998. Conceptos de Genética, 5ª Ed.
sales, aumentando la fuerza
Prentice Hall Iberia.
iónica del medio, y la solubilidad
de las proteínas disminuye y [3] Velasco R. 2005. Marcadores
finalmente terminan por precipitar. moleculares y la extracción de ADN.
 Han sido adquiridas las destrezas Disponible en
correspondientes a la técnica de http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia
extracción y se identifican los /ediciones/vol3/Art32.pdf.
pasos que requiere el protocolo,
[4] GRIFFITHS, A. J. F., GELBART, W.
así también como cada uno de
M., MILLER, J. H., y LEWONTIN, R. C.,
los materiales que se emplean.
2.000. Genética Moderna.
 Las propiedades del ADN no
Interamericana/McGraw-Hill.
fueron bien apreciadas. Sin
embargo mediante métodos [5] Leninger A. L. 1975. Biochemistry.
cuantitativos (Espectrofotometría Worth Publishers, New York, EE.UU.
y Electroforesis) fue posible hallar
concentraciones analíticas de la
muestras del material genético.