TRABAJO N°2

ESTERILIZACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS

 INTRODUCCION

Cuando se trabaja en una laboratorio con tecnicas de asilamientos Y/o identificacion

de patogenos causales de enfermedad siempre se rrecurren a tecnicas de esterilizacion
por tanto El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con
materiales y equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada
antes de usarlos. Esto se debe cumlir para reunir unas cndiciones de asepcia y limpieza
en las muestrar analizadas con el fin de determinar el agente causal especifico de la
enferemdad y evitar agentes contaminantes.

A parte de la esterilizacion la peparacion de los medios de cultivos es de vital

importancia al encontrarse trabajando en un centro de sanidad vegetal ya que estos son
uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos porque
permite observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Actualmente se reportan
cantidades de tecnicas de esterilizacion y de preparacion de medios hasta considerar
cantidades en el mundo de por lo menos 10.000 medios de cultivo diferentes. En este
trabajo aprenderemos a identificar las principales tecnicas de esterilizacion de equipos
y los diferentes medios de cultvos mas importantes y mas usado en la fitopatologia para
el crecimiento de hongos y Bacterias

OBJETIVOS

 Conocer los tipos de esterilización que existen y como llevarlas a cabo para
realizar las actividades de análisis de muestras vegetales enfermas

 Aprender a cuales son los medios de cultivo mas importante y los mas usados
para análisis de tejidos enfermos

 Aprender a elaborar los medios de cultivo más comunes usados en el aislamiento

de hongos y bacterias fitopatógenos.
 REVISION DE LITERATURA

ESTERILIZACION DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO

Antes de Iniciar el tema es importante conocer la definiciones de Esterilización la cual

Según Loredo, (2009) la define como el proceso mediante el cual se obtienen
sustancias o materiales libres de organismos vivos.

Este término de esterilización suele aplicarse en el área de Sanidad Vegetal

específicamente en el énfasis de Fitopatología Donde entre otras actividades se realiza
la búsqueda de organismos patogénicos para su identificación reproducción y
purificación a fin de llevar a cabo una investigación específica. Para esto es necesario
que todos los equipos y medios utilizados para dicha actividad estén libres de
contaminante.

Por lo tanto para realizar la esterilización de equipos existen diversos metodos Entre
los cuales se mencionan los métodos físicos tales como el calor, las radiaciones y la
filtración. Y por otra parte los metdos químicos que incluye el uso de gases o
sustancias líquidas con propiedades biocidas.

1. Esterilización mediante calor seco.

Este procedimiento es apropiado para esterilizar cristalería e instrumentos de metal. Se
lleva a cabo en estufas u hornos alimentados por energía eléctrica o por gas. El periodo
de exposición varía según la temperatura del horno, generalmente se expone el material
por tres horas a 140-180 oC, para esterilizar material de vidrio o metal.

No se recomienda esterilizar medios de cultivo con calor seco.

El procedimiento utilizado es el siguiente:

1). Deposite el material seco y limpio en la estufa.

2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor.

3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el

termómetro y cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura
requerida (100-180 oC).

4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato. ADVERTENCIA: no saque

cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire frío o caliente se
revientan.

2. Esterilización con calor húmedo. Es el método más rápido y eficaz, usándose ollas de
presión (express) o autoclaves.

El principio se basa en el uso de vapor de agua a presión, contenidos en recipientes

herméticamente cerrados. Los medios se esterilizan normalmente a 15-20 libras por
pulgada cuadrada (120 oC) por espacios de 15-20 minutos. El suelo y otros materiales
pueden requerir tiempos mayores a 30 minutos, según se desee esterilizar o
pasteurizar.

el procedimiento es el siguientes:

1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal.

2). Introducir el material a utilizar.

3). Cierre el recipiente correctamente.

4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión.
5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de escape.
El tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15
libras/pulgadas cuadradas.

6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, reglando la flama
del mechero.

7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero
presión antes de sacar con cuidado el material caliente.

ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia.

3. Esterilización por filtración. Se usa en el caso de sustancias no termoestables

(algunos azucares, sueros o extractos), utilizando para ello filtros de porcelana o de
membrana millipore. Estos filtros evitan el paso de esporas, bacterias, aun de las más
pequeñas, de tal forma que las sustancias pasan libres de contaminantes.

4. Esterilización por radiación. Se usa generalmente para esterilizar cuartos o cámaras

de transferencia de cultivos, comúnmente mediante luz ultravioleta.

5. Esterilización mediante sustancias químicas. Se usan gases o líquidos. Entre los

gases, el más usado es el oxido de propileno, sobre todo para esterilizar material vegetal,
aunque también puede usarse para material termosensible. El suelo puede ser
esterilizado con gases tales como mezclas 2

En los laboratorio de fitopatología se puede usar en casos muy extremos bromuro de

metilo y cloropicrina a altas dosis. Este método requiere de recipientes cerrados y es
peligroso, por lo que su uso es muy limitado.

6. Esterilización con líquidos. La esterilización con líquidos no es común. En laboratorio

es frecuente la desinfección con alcohol o hipoclorito de sodio, pero esta práctica no es
una esterilización en sentido estricto.

MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y
desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalar que la mayoría
de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en
medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos
obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas.

Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr

exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran:

1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono,

nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. y otras sustancias

2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en

recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles
es decir, evitando contaminaciones.

3. 3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes

de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando
autoclave u olla express.

4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe

mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el
desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia
para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo.

5. La mayoría de los hongos crecen bien a Ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La

temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el
crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas
cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio,
pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento
fungoso. Mietras que las bacterias crecen en medios de cultivos mas a Ph. Mas
altos 7.-8

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS

 Según su estado:
A. Medios líquidos:

B. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico

producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una
concentración del 1,5%.

C. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.

Los Medios de cultivo más comunes usados en el aislamiento de hongos fitopatógenos

Elaboración de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayoría de hongos y bacterias.

Ingredientes:

 Papa partida 200 gr

 Dextrosa (glucosa)13 gr
 Agar 18-16 gr
 Agua destilada 1000 ml

Procedimiento:

1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua.

2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver.

3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle ambos

líquidos, agregue la dextrosa y homogenice.

4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces

con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a
estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los
tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser tubos
con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la esterilización.

5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20

libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del momento
en que se alcance la presión ya mencionada. 6. Abra la olla o autoclave hasta que la
presión baje a cero.

6. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se
vacía a cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de
 transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros
de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo

7. Los tubos de de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio

solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate.

8. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar) para

prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas
cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina,
penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización
en las condiciones antes señaladas. A

Elaboración de V8-agar. Para Phycomycetes y otros:

 Jugo V8 200 ml
 Carbonato de calcio 3 gr
 Agar 16-18 gr
 Agua destilada 800 ml

Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y

el agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el agar. Una vez
que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vacíe el
medio en recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión
durante 20 minutos.

Elaboración de agua-agar. Phycomycetes y otros.

No crecen bacterias.

 Agar 16 gr
 Agua destilada hasta completar 1000 ml

Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez disuelto, lleve el
volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes apropiados y esterilice en
el autoclave a 15 libras de presión.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS PARA BACTERIAS:

Para el cultivo invitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que
proporciones todos los requerimientos nutricionales, que permitan su reproducción, los
cuales se les conoce como medios de cultivo

Los medios de cultivos contienen cuatro componentes esenciales: Fuentes de Carbono

y Nitrógeno. Minerales y Vitaminas

Agar Nutritivo:

Ingredientes

 Agar Nutritivo 23 gr.

 Agua destilada 100 ml.

Preparación

Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el liquido en dos matraces,
esterilizar en autoclave a 115 lbs./pul.2 durante 15 min. Y vaciar en cajas de petri. Este
medio generalmente se emplea para asilamientos de material vegetal. Es un medio útil
para el asilamiento de especies de Xanthomonas.

Medios de Cultivos Diferenciales (TTC)

Ingredientes:

 Peptona 10 gr
 Casina Hidrolizada 1 gr
 Glucosa 5 gr
 Agar 12 gr
 Agua 1000 ml

Ajusta el PH a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una

temperatura de aproximadamente 45-50°C adicionar solución acuosa de cloruro de
tetrazolio al 1% para una concentración final de o,05 % con este medio de cultivo se
puede detectar colonias virulentas y a virulentas de Ralstonia Solanacerum

Medios de gelatina y carne

Ingredientes

 Extracto de carne 3 gr
  Peptona 5 gr
 Gelatina 120 gr
 Agua 1000 ml

La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 -30 minutos y luego se

calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros
constituyentes. Ajustar el pH 7. Y vaciar a tubos y esterilizar a 120 °C durante 20
minutos.

BIBLIOGRAFIA

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Rodriguez, M. M. 2001. Manual de Practicas de bacterias Fitopatogenas, Departamente

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