Anda di halaman 1dari 4

2.

Analisis lipid kromatografi lapis tipis


Aspek teknis pemisahan TLC dari lipid :
2.1. Fase diam
Fasa diam yang paling populer untuk pemisahan lipid adalah silika gel, alumina dan
kieselguhr. Silika juga dapat dimodifikasi oleh impregnasi dengan zat lain untuk memberikan hasil
yang optimal mengenai pemisahan kelas lipid tertentu.
Berdasarkan karakteristik permukaannya, fase-fase ini dapat diklasifikasikan sebagai fase
"normal" atau "terbalik".
- Dalam TLC fase normal, fase diam (biasanya silika gel) adalah polar dan fase geraknya
cukup apolar (yaitu sistem pelarut yang digunakan mengandung sejumlah besar pelarut
seperti heksana atau kloroform). Partikel 10–50 m secara teratur digunakan untuk
keperluan TLC, sementara sekitar 5m partikel dengan distribusi ukuran sempit digunakan
dalam HPTLC.
- Partikel yang lebih kecil ini menghasilkan kualitas pemisahan yang lebih tinggi. Selain itu,
jumlah sampel yang lebih kecil sudah cukup dalam kasus HPTLC dan, dengan demikian,
batas deteksi yang lebih kecil dapat dicapai.
- Kromatografi fase normal adalah metode standar pemisahan lipid sesuai dengan
perbedaan polaritas yang disebabkan oleh perbedaan headgroup PL yang diinginkan.
Selain pemisahan kelas lipid individu, pemisahan dalam kelas lipid, yaitu sesuai dengan
perbedaan komposisi asil lemak juga dimungkinkan oleh kromatografi fase normal
meskipun ini biasanya merupakan domain fase terbalik.

Di antara berbagai modifikasi fase diam, peresapan perak nitrat dan asam borat paling
populer. AgNO3 terutama digunakan untuk memisahkan lipid dengan komposisi asil lemak yang
berbeda berdasarkan tingkat ketidakjenuhan. Karena Ag + membentuk kompleks dengan elektron
ikatan rangkap dari asam lemak tak jenuh yang menyebabkan mobilitas asam lemak ini menurun.
Dalam kasus-kasus tertentu, bahkan penentuan posisi ikatan rangkap dimungkinkan dengan
pendekatan ini. Sebaliknya, asam borat (H3BO3) terutama berguna untuk mendeteksi berbagai
isomer DAG serta pemisahan isomerik PL. H3BO3 membentuk kompleks dengan senyawa yang
mengandung gugus hidroksil vicinal dan menyebabkan migrasi senyawa ini lebih lambat. Terlepas
dari ini, asam borat juga mengikat senyawa asam dan memodifikasi sifat migrasi mereka.
Modifikasi lain yang jauh lebih jarang digunakan dari fase stasioner adalah penambahan EDTA
yang telah diindikasikan untuk meningkatkan pemisahan PL asam seperti fosfatidilserin (PS) yang
sering menghasilkan tempat yang cukup difus (ulasan khusus untuk PS analisis tersedia dalam
[46]). Dengan cara yang sama amonium sulfat telah diindikasikan untuk memberikan perbaikan
antara fosfatiatilinlinolol (PI) dan PS. Menggunakan pelat silika gel diresapi dengan 0,4%
amonium sulfat dan kloroform-metanol-asam asetat-aseton-air (40: 25: 7: 4: 2, v / v / v / v / v)
sebagai fase gerak dapat ditunjukkan bahwa 5 PL yang berbeda (PS, PE, PI, PC dan SM) dan tiga
lisofosfolipid (LPS, LPE dan LPC) dapat dengan mudah dipisahkan [47]. Akhirnya, harap dicatat
bahwa dalam beberapa referensi (terutama yang lebih tua), penulis sering berbicara tentang "silika
gel H". "H" tidak ada hubungannya dengan gel silika seperti itu tetapi hanya menunjukkan bahwa
pengikat terdiri dari partikel halus silikon dioksida atau alumina dan bahwa pelat tidak
mengandung pengikat kalsium sulfat. Jenis pengikat terkadang sangat penting.
Saat ini, ada banyak fase stasioner yang berbeda yang secara komersial dapat dilakukan, yang
secara potensial menggunakan ladang data. Meskipun daftar ini jelas tidak lengkap, fase ini terdiri
dari CeliteTM.
(Supelco Inc., PA), bubuk selulosa, selulosa penukar ion, pati, poliamida dan SephadexTM
(Supelco Inc., PA). Namun, semua fase yang berpotensi bermanfaat ini tidak memainkan peran
utama dalam bidang lipid dan hanya segelintir kertas yang sejauh ini telah melaporkan tentang
aplikasi tersebut. Dengan demikian, kami akan fokus di sini terutama pada gel silika yang tidak
dimodifikasi.

2.2. Sistem deteksi


Ini adalah keuntungan utama TLC bahwa fraksi lipid yang terpisah dapat dengan mudah
divisualisasikan dengan mengikat pewarna. Banyak reagen yang berbeda saat ini tersedia - sering
bahkan sebagai agen semprot yang siap pakai - dengan harga sedang. Tinjauan komprehensif
terbaru dari pewarna yang umum digunakan juga tersedia di [48]. Agen-agen ini dapat diurutkan
sesuai dengan kekhususan mereka dan jika mereka merusak atau tidak merusak.
2.2.1. Tidak merusak, tidak spesifik
Salah satu metode yang paling sering digunakan adalah paparan pelat TLC yang dikembangkan
untuk uap yodium yang membentuk kompleks coklat non-kovalen dengan lipid. Sayangnya,
bagaimanapun, lipid yang benar-benar jenuh hampir tidak dapat diwarnai, sedangkan yodium tidak
dapat sepenuhnya dihapus dari lipid jenuh tinggi (mengandung misalnya residu arachidonil)
karena iodin terikat secara kimiawi pada pita air [49]. bintik-bintik merah muda, masing-masing,
jika pelat TLC diterangi dengan sinar UV. Partikel rodhamin sangat berguna ketika sistem pelarut
alkali telah digunakan dan 2,7-diklorofluorescein lebih disukai dengan pelarut asam karena
stabilitas pewarna. Kedua pewarna dapat dengan mudah dihilangkan jika polaritas pelarut diubah
atau lipid (dengan pewarna terikat) dilewatkan di atas kolom pendek. Hal ini juga berlaku untuk
pewarna primuline [51,52] yang dapat digunakan dengan cara yang sama dan memberikan
sensitivitas dalam kisaran nanomole rendah [52] yang sebanding dengan rhodamin [50].
Juga ditunjukkan bahwa lipid tak jenuh ganda menunjukkan kegelapan yang kuat ketika
pemisahan dilakukan pada pelat TLC AgNO3 yang diimpregnasi [53] yang harus dianggap sebagai
konsekuensi dari pengurangan Ag + menjadi koloid perak. Hebatnya, penggelapan ini tergantung
pada komposisi
sistem pelarut dan tampaknya membutuhkan keberadaan hidrokarbon aromatik seperti toluena.
2.2.2. Merusak, tidak spesifik
Menyemprotkan pelat TLC lengkap dengan pereaksi korosif dan membakar piring untuk membuat
lipid terlihat adalah metode yang sangat umum [54]. Asam sulfat 50% baik dalam metanol atau air
adalah sistem pelarut yang biasanya digunakan dan pelat dipanaskan sesudahnya hingga sekitar
120 ◦C selama sekitar 1 jam. Meskipun detail mekanistik sejauh ini tidak diketahui secara luas,
perlu dicatat bahwa lipid jenuh dan tak jenuh membutuhkan waktu yang berbeda untuk sepenuhnya
direduksi menjadi karbon. Intensitas bintik hitam ini juga dapat dianalisis secara kuantitatif (batas
deteksi sekitar 25-50ng per kelas lipid) menggunakan peralatan videodensitometrik [55].
Banyak pereaksi yang berbeda seperti kalium dikromat (5%) dalam asam sulfat 40% atau larutan
asam asetat 3-6% dalam 8-10% asam fosfat juga diindikasikan berpotensi bermanfaat.
2.2.3. Merusak, spesifik
Reagen yang berbeda dikenal yang bereaksi secara selektif dengan bagian lipid spesifik di bawah
generasi produk berwarna.
Banyak pewarna berbeda baru-baru ini dibandingkan mengenai sensitivitas yang dapat dicapai
[69]. Pewarnaan paling sensitif dapat dicapai dengan 0,2% amido black 10B dalam 1M NaCl:
Setelah direndam dalam air, pelat TLC direndam dalam larutan pewarnaan selama beberapa menit.
Sensitivitasnya sekitar 15ng mengenai DAG, TAG, dan PS, sementara hanya sekitar 100ng asam
lemak bebas dan 500ng ester phorbol yang dapat dideteksi. Ada juga perdebatan yang sedang
berlangsung apakah mencelupkan dan menyemprotkan metode memberikan hasil yang benar-
benar sebanding
Metode pewarnaan lipid yang umum digunakan.

Kelas lipid Reagen Hasil / komentar


Ester kolesterol dan kolesterol Besi klorida asam Dihasilkan titik merah ke ungu. Reaksinya
lebih cepat dengan kolesterol bebas
dibandingkan dengan ester . Juga bereaksi
dengan asam lemak bebas.
Asam lemak bebas 2 -Dichlorofluorescein / AlCl3 / Warna mawar setelah beberapa menit
FeCl3
Fosfolipid Molybdic oxide / molybdenum Fosfolipid membentuk bintik-bintik biru
dengan latar belakang putih.

Fosfolipid mengandung kolin Reagen Dragendorff (bismuth PC, LPC, dan SM dapat dideteksi sebagai
nitrate + KI) bintik oranye-merah
Fosfolipid mengandung gugus Ninhidrin dalam butanol PE, PS dan lisolipid yang sesuai terdeteksi
amino bebas sebagai bintik-bintik merah-violet
Glikolipid -Naphthol / asam sulfat Semua glikoplipid ditandai dengan bercak
kuning. Meskipun kolesterol juga reaktif,
kolesterol ini memberikan bintik merah.
Plasmalogens (lipid alkenil-asil) 2,4-Dinitrophenylhydrazine dalam 3 Alkenyl eter sangat sensitif terhadap asam
M HCl dan aldehida yang awalnya dihasilkan
bereaksi dengan reagen. Bintik-bintik
kuning-oranye pada latar belakang putih
dihasilkan karena pembentukan hidrazon
Glikolipid Orcinol / asam sulfat Bintik-bintik biru-ungu dengan latar
belakang putih
Glikolipid 5-Hydroxy-1-tetralone dalam asam Glikolipid memberikan bintik-bintik kuning
sulfat 80% yang mudah dibedakan dari bintik-bintik
biru muda fosfolipid
Gangliosides Reagen Resorcinol – HCl Hanya gangliosida yang muncul sebagai
bercak biru ungu, sementara glikolipid lain
muncul sebagai bercak kuning
Sfingolipid Sodium hipoklorit / reagen benzidin Bintik-bintik biru dengan latar belakang
putih dihasilkan dengan semua lipid yang
mengandung kelompok amina sekunder [67]
Pewarna ini diindikasikan spesifik kardiolipin
tetapi interaksi dengan lipid asam lainnya
juga mudah terjadi [68]
Cardiolipin 10-N-nonyl-3,6-bis (dimethylamino)
acridine