BAB III METODOLOGI

3.1. Pembelian dan Pengeringan Bahan Baku Rumput Laut Eucheuma cottoni

3.1.1. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam pembelian bahan baku rumput laut dan

pengeringan sampel yaitu alat transportasi dan oven. Sedangkan bahan yang

diperlukan yaitu rumpuyt laut jenis Eucheuma cottoni.

3.1.2. Cara Kerja

Pertama yaitu menyiapkan bahan baku yang telah dibeli dari

petani rumput laut di daerah Pantai Jumiang, Pamengkasan, Jawa

Timur kemudian timbang. Setelah itu rumput laut dikering anginkan

atau dikeringkan menggunkan oven. Pengeringan tidak oleh

menggunakan sinar matahari langsung. Kemudian rumput laut yang

telah kering ditimbang kembali untuk mengetahui rendemennya.

3.2. Ekstraksi Rumput Laut (Maserasi)

3.2.1. Alat dan Bahan

Pada praktikum ekstraksi rumput laut alat - alat yang

digunakan yaitu bulb, erlenmeyer, aluminium foil, wrap, pipet volume,

kapas. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu sampel rumput laut

Eucheuma cottoni, dan etil asetat

3.2.2. Cara Kerja

Pada praktikum ekstraksi rumput yang pertama dilakukan yaitu

menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kemudian

 menimang rumput laut kering yang telah dihaluskan sebanyak 100

gram.lalu siapkan pelarut. Selanjutnya bilas erlenmeyer dengan

pelarut (etil asetat), kemudian masukkan 100 gr rumput laut kering ke

dalam erlenmeyer. Tuang pelarut etil asetat 300 ml hingga sampel

terendam. Tutup erlenmeyer dengan kapan dan wrap, setelah itu lapisi

erlenmeyer dengan aluminium foil dan diamkan selama 24 jam.

3.3. Tahap Evaporasi

3.3.1. Alat dan Bahan

Pada praktikum evaporasi alat - alat yang digunakan yaitu

rotary evaporator dan bahan yang digunakan yaitu sampel filtrasi hasil

ekstraksi.

3.3.2. Cara Kerja

Pada praktikum evaporasi yang pertama dilakukan yaitu

menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kemudian atur

rotary evaporator pada suhu 45°C dengan pelarut etil asetat.tekanan

mencapai 1 atm. Kemudian filtrat dimasukkan ke dalam alat melalui

bagian input sampel. Setelah sampel dimasukkan agitasi diatur hingga

kecepatan 60 rpm dan diturunkan hingga cukup terendam pada

akuades. Setelah sampel mengering, makan sampel dinaikkan, lalu

agitasi dihentikan dan mesin dimatikan. Setelah selesai ambil

pengumpul solven kemudian pindahkan ke dalam wadah kaca.

3.4. Skrinning Senyawa Alkaloid

3.4.1. Alat dan Bahan

 Pada praktikum skrinning senyawa alkaloid alat-alat yang

digunakan yaitu bejana KLT, pinset penjepit, gelas ukur, lemari asam,

pipa kapiler. Sedangkan bahan- bahan yang digunakan pada praktikum

kali ini yaitu esktrak rumput laut, plat KLT, etanol, kertas saring,

kloroform, etil asetat, penampak noda dragendrof.

3.4.2. Cara Kerja

Pada praktikum skrinning alkaloid yang pertama dilakukan

yaitu menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kemudian

menimbang 0,05 gr ekstrak rumput laut. Siapkan bejana KLT dan plat

KLT ukuran 10 x 2 cm. Selanjutnya siapkan eluen klorofom : etil asetat

(1 : 1) sebanyak 10 ml. Masukkan kertas saring ke dalam bejana, serta

eluen yang sudah ditentukan ke dalam bejana. Lalu larutkan ekstrak

dengan etanol. Setelah itu totolkan ekstrak tadi sebanyak 6 µl.

Masukkan plat KLT ke dalam bejana KLT dengan pinset penjepit ke

dalam bejana KLT yang telah jenuh (ditandai dengan basah nya kertas

saring secara merata). Eluasi plat KLT sampai batas tanda (bejana

KLT tidak boleh dibuka selama proses eluasi berlangsung). Setelah itu

ambil plat KLT dengan pinset penjepit, kemudian angin-anginkan

hingga eluen menguap. Semprot plat KLT dengan penampak noda

drogendrof. Apaila muncul warna jingga pada plat KLT menunjukkan

sampel mengandung alkaloid. Terakhir hitung nilai Rf dengan rumus :

Jarak Noda (x)

𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 Rf =
Jarak Eluasi (y)

3.5. Skrinning Senyawa Flavonoid

3.5.1. Alat dan Bahan

Pada praktikum skrinning senyawa flavonoid alat-alat yang

digunakan yaitu bejana KLT, pinset penjepit, tabung reaksi, rak kayu,

vial, pipa kapiler. Sedangkan bahan- bahan yang digunakan pada

praktikum kali ini yaitu esktrak rumput laut, palt KLT, uap amonia,

kertas saring, etanol, kloroform, aseton, asam format.

3.5.2. Cara Kerja

Pada praktikum skrinning flaonoid yang pertama dilakukan

yaitu menyiapkan bejana, lalu siapkan eluen kloroform, aseton, asam

format dengan perbandingan 6 : 6 : 1 sebanyak 10 ml. Kemudian

masukkan kertas saring ke dalam bejana serta eluen yang sudah

ditentukan ke dalam bejana. Setelah itu siapkan plat KLT 10 cm x 2

cm tandai dengan pensil jarak dari bawah 1,5 cm dan dari atas 0,5 cm.

Timbang 50 mg sampel ekstrak ditambahkan 3 ml heksana dan kocok.

Buang n-heksan residu ditambahkan n-heksan 3 ml dan kocok

kembali. Lakukan pencucian dengan n-heksan berkali-kali hingga n

heksan tidak berwarna. Kemudian larutkan residu dengan beberapa

tetes etanol (sedikit mungkin). Lalu totolkan ekstrak sebanyak 10 µl

pada plat KLT menggunakan pipa kapiler 2 µl (5x2 µl). Usahakan

entuk totolan sekecil mungkin. Setelah itu masukkan plat KLT ke

dalam bejana KLT yang telah jenuh. Tunggu hingga eluasi plat KLT

sampai menunjukkan batas tanda (bejana KLT tidak oleh dibuka

selama proses eluasi berlangsung). Setelah selesai ambil plat KLT

 dengan pinset penjepit, kemudian angin-anginkan sampai eluennya

menguap. Semprot / celupkan plat KLT dengan penampang noda

warna kuning yang menunjukkan sasmpel flavonoid. Melaporkan

jumlah noda warna kuning yang muncul dan harga Rf untuk tiap noda.

Rumus Rf :

Jarak Noda (x)

𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 Rf =
Jarak Eluasi (y)

3.6. Uji Antioksidan

3.6.1. Alat dan Bahan

Pada praktikum uji antioksidan bahan yang diperlukan yaitu

ekstrak pasta rumput laut 0,005 gr, metanol, larutan DPPH, larutan

DMSO. Kemudian alat yang diperlukan yaitu labu ukur 5 ml,

timbangan analitik, mikropipet, mikrotip, tabung reaksi spatula, pipet

tetes, kaca arloji, vial, pipet ukur, spektrofotometri, kuvet, bulb,

loyang, lemari asam, oven, beaker glass, gelas ukur.

3.6.2. Cara Kerja

Pada praktikum uji antioksidan hal pertama yang dilakukan

yaitu menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan, kemudian

menyiapkan larutan DPPH terlebih dahulu. Setelah itu menimbang

sampel ekstrak pasta rumput laut sebanyak 0,005 gr, lalu tuang larutan

DMSO ke kaca arloji. Setelah itu masukkan larutan metanol sebanyak

5ml dengan cara menyemprotkan pada kaca arloji yang berisi ekstrak

dan DMSO ke dalam lau ukur kemudian homogenkan. Selanjutkan

lakukan pengenceran dengan cara mengambil larutan menggunakan

mikropipet dengan volume yang sama dengan perhitungan

sebelumnya. Dari larutan baku induk 1000ppm diambil menggunakan

mikropipet dengan volume 0,15 ml dimasukkan ke dalam labu ukur

konsentrasi 30ppm, kemudian ambil kembali menggunakan

mikropipet sebanyak 0,26 ml dari larutan baku induk lalu masukkan

ke dalam labu ukur dengan konsentrasi 50ppm. Ulangi lagi mengambil

0,4 ml dari larutan baku induk kemudian masukkan kedalam labu ukur

dengan konsentrasi 80ppm. Yang terakhir ambil 0,6 ml dari larutan

aku induk kemudian masukkan ke dalam lau ukur konsentrasi 100ppm.

Pengenceran dilakukan dari konsentrasi yang rendah ke konsentrasi

yang tinggi. Selanjutnya setelah pengenceran selesai campurkan setiap

konsentrasi dengan DPPH pada tabung reaksi hingga 3ml dengan

perbandingan 300 µl setiap konsentrasi (1000ppm, 100ppm, 80ppm,

50ppm, 30ppm) ditambahkan 2700 µl DPPH. Selain lima tabung

reaksi sesuai konsentrasi ditambah lagi 2 tabung reaksi yang satu berisi

larutan kontrol DPPH 3 ml dan yang satunya berisi larutan blanko

metanol 3 ml. Kemudian inkubasi 6 tabung reaksi (kontrol, 1000ppm,

100ppm, 80ppm, 50ppm, 30ppm) menggunakan oven dengan suhu

30°C selama 30 menit. Setelah itu tuang setiap tabung ke dalam

masing-masing kuvet sebanyak 7 buah (kontrol DPPH, 1000ppm,

100ppm, 80ppm, 50ppm, 30ppm, Blanko metanol). Hitung

absorbansinya menggunakan spektrofotometri dengan panjang

gelombang ℷ 517 nm dengan rumus :

 A. Kontrol − A. Sample
% 𝐻𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑅𝑎𝑑𝑖𝑘𝑎𝑙 =
A. Kontrol

Setelah didapatkan nilai asorbansinya kemudian hitung menggunakan

excel (R2 yang didapat minimal 0,8). Terakhir setelah persamaannya

didapatkan cari IC50.

3.7. Uji Antimikroba

3.7.1. Alat dan Bahan

Pada praktikum pengujian antimikroba bahan yang dibutuhkan

yaitu sampel rumput laut yang telah di evaporasi , larutan DMSO,

spirtus, akuades. Sedangkan alat-alat yang dipergunakan pada

praktikum uji antimikroa yaitu cawan petri, paper disk, timbangan

analitik, magnetik stirer, kaca arloji, blutip, mikropipet 100-1000µl,

drigalski, batang pengaduk, beaker glass, nampan palstik, pinset,

autoclaf, spuit, refrigerator.

3.7.2. Cara Kerja

Pada praktikum pengujian antimikroba pertama-tama siapkan

alat dan bahan yang akan dipergunakan, kemudian menyiapkan

standar pembuatan MHA, lalu menimbang 15,2 gram dan

ditambahkan 100 ml akuades. Kemudian panaskan menggunakan

magnetik stirer, setelah itu di sterilisasi menggunakan autoclaf dengan

suhu 121°C dan kemudian dituang ke dalam 2 buah cawan petri steril.

Setelah pembuatan media selesai selanjutnya yang dilakukan yaitu

menimbang sampel 19,3 mg, kemudian tambahkan DMSO 193 µl

pada sampel. Lalu tambahkan isolat bakteri E.Coli dan Staphylococcus

0,1 ml pada masing-masing media MHA menggunakan spuit.

Kemudian lakukan spread isolat bakteri tadi pada cawan petri berisi

media agar yang telah dibagi menjadi empat bagian yaitu kontrol

negatif, kontrol positif, perlakuan 1 dan perlakuan 2. Masukkan

paperdisk yang telah dicelupkan pada kloramfenicol kemudian

letakkan pada bagian kontrol positif, lalu celupkan paperdisk yang lain

pada larutan DMSO kemudian letakkan pada bagian kontrol negatif.

Pada bagian perlakuan 1 dan 2 masukkan paperdisk tanpa dicelup

apapun. Setelah memasukkan paperdisk pada media agar letakkan

media tersebut pada refrigerator selama 1 jam. Kemudian inkubasi

pada suhu 37°C selama 24 jam. Amati dan hitung zona bening yang

terbentuk.