Primer avance: Estudio en la rana venenosa Oophaga histrionica por el aposematismo

en el fondo de la coloración dado a la actividad del gen MC1R.

Diego Julián Erazo Castro

Dilsa Fabiana Arteaga Ortega
Laura Alejandra Atehortua Castillo

Presentado a: Edna Lourdes Orozco

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACNED
BIOLOGÍA
Popayán 11 de junio de 2019
Estudio en la rana venenosa Oophaga histrionica por el aposematismo en el fondo de la
coloración dado a la actividad del gen MC1R.

Especie para trabajar: Oophaga histrionica.

Tabla 1. Taxonomía de la especie Oophaga histrionica.

TAXONOMIA

Reino Animalia

Filo Chordata

Clase Amphibia

Orden Anura

Familia Dendrobatidae

Figura 1. fotos de la especie Oophaga histrionica con sus diferentes coloraciones

aposemáticas.

Descripción ecológica.

La rana cocoi o rana arlequín venenosa (Oophaga histrionica) es una especie de anfibio que
se encuentra en los bosques tropicales húmedos de la región del Pacífico, al occidente de
Ecuador y Colombia (Anonimo., 2019).
Figura 2. Distribución geográfica de la especie Oophaga histrionica.

Es una especie muy llamativa por su gran colorido, generalmente con manchas anaranjadas
o también amarillas, rojas, blancas o azules, sobre negro brillante, marrón o azul. La piel es
lisa y abundantemente provista de glándulas productoras de veneno. Cuando es adulta se
alimentan de insectos, en especial hormigas, ácaros y otros pequeños artrópodos, ayudando
a mantener el equilibrio natural. Secreta una sustancia viscosa venenosa cuando es sometida
a estrés, la cual puede causar parálisis respiratoria (Anonimo., 2019).

Las principales amenazas que afectan a la rana son: la deforestación, para el desarrollo
agrícola; los cultivos ilegales; la tala de bosques; el asentamiento humano y la contaminación
resultante de la fumigación de cultivos ilegales. La especie a veces también se recolecta
ilegalmente para el comercio internacional de mascotas y el comercio de medicamentos, pero
no está claro que esto tenga un impacto significativo en sus poblaciones; considerada por la
UICN red list como preocupación menor (LC), incluida en el apéndice II de CITES (Bolívar
et al, 2004).

PARTE MOLECULAR.

Gen del receptor de melanocortina tipo 1 (MC1R).

Estructura del gen: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/popset/1238813682?report=genbank

Los fenotipos de color y patrón han sido de interés tanto para naturalistas como para biólogos
evolutivos. Parte de este interés se deriva de la asociación de este fenómeno con presiones
selectivas como la elección de pareja y depredación. Las especies con fenotipos morfológicos
directamente relacionados con la supervivencia y la reproducción brindan excelentes
oportunidades para estudiar los fundamentos genéticos del color y el patrón, precisamente
porque estos fenotipos están tan obviamente relacionados con la supervivencia (MM Stuckert
et al, 2019).

Las especies aposemáticas se basan en el color y el patrón para advertir a los depredadores,
pero en muchos casos estos fenotipos de color y patrón son extremadamente variables,
cambian a menudo en distancias geográficas cortas o incluso exhiben polimorfismo dentro
de las poblaciones (MM Stuckert et al, 2019); a pesar de ser uno de los mejores grupos
caracterizados por tener especies aposemáticas el conocimiento es limitado, debido a que,
hay poca información sobre la genética del patrón de color en anfibios.

PROTEINA

La proteína de este gen cumple la función de realizar la síntesis de melanina, es el gen que
codifica el receptor 1 de la melanocortina (MC1R); MC1R es una proteína que se encuentra
en la membrana de los melanocitos y que controla el tipo de melanina que producen. Cuando
el receptor es activado, se inicia una cascada de reacciones químicas en el interior del
melanocito que se concretan en la estimulación de la producción de eumelanina en esa célula.
En cambio, si el receptor no está activado o está bloqueado, los melanocitos elaboran
feomelanina en lugar de eumelanina (García-Borron et al., 2014).

La proteína MC1R, es un receptor de membrana con 7 dominios de transmembrana que, tras

enlazar a su agonista, la hormona α-MSH (melanocyte stimulating hormone), desencadena
la síntesis de eumelanina (Garcia-Borrón et al., 2014).

POLIMORFISMO

El polimorfismo de color se refiere a la aparición de múltiples fenotipos de color discreto

dentro de poblaciones que resultan directamente de la variación genética. La causalidad
genética directa distingue el polimorfismo de color del polifenismo, por lo que los genotipos
idénticos poseen la capacidad de expresar fenotipos variados según el ambiente. Esta
definición también excluye el cambio de color ontogenético y reversible. El polimorfismo
del color se puede limitar a la presencia de solo dos morfos discretos (dicromatismo) (White
et al., 2016).
Más de 200 especies de ranas exhiben alguna forma de polimorfismo de color o patrón, sin
embargo, se ha realizado poco trabajo para investigar mecanismos selectivos, modos de
herencia o eventos a nivel de la población que den lugar y mantengan esta variación. Por lo
tanto, los polimorfismos de anuro siguen siendo un sistema rico, pero en gran parte no
explotado para estudiar la evolución de la variación fenotípica en la naturaleza. Varias
especies de ranas venenosas muestran niveles dramáticos de variación fenotípica dentro de
las especies. Por ejemplo, cuatro especies nominales de ranas venenosas arlequín que se
producen en los bosques húmedos del Pacífico de Colombia: Oophaga histrionica, O.
lehmanni, O. ocultador, y O. sylvatica, que comprenden más de 25 morfos de color
(Amesquita et al., 2013).

En este caso, O. histrionica, representan uno de los casos más notables de polimorfismo en
una rana aposemática. Dentro de una sola especie, la coloración dorsal puede ser desde rojo,
amarillo, naranja y azul a blanco, mientras que el patrón puede involucrar sufusiones de color,
pocas o muchas manchas, círculos y bandas transversales. Especies aposemáticas, como
ranas venenosas, ofrecen una oportunidad interesante para estudiar la evolución de la
variación fenotípica. Dado que es probable que sus fenotipos aposemáticos estén sujetos a
una fuerte selección normalizadora (White et al., 2016).

Por consiguiente, en los estudios realizados por Posso-Terranova y Andres J,A en el año 2017
exponen la hipótesis de que en las ranas que presentan la mutación Δ433 en relación con el
dominio tiene implicaciones importantes. Primero que sugiere que las ranas venenosas
arlequín, sus alelos truncados pueden provocar la expresión de receptores hiperactivos
MC1R, que a su vez resulta en una mayor dispersión del melanosomas y tonos de piel más
oscuros. Así mismo sugiere que a pesar de la existencia de un truncamiento en la proteína se
puede esperar que el receptor sea funcional. El gen se considera un gen polimórfico limitado
ya que presenta dos mutaciones reportadas no donantes y se considera limitado porque su
diversidad genética es muy reducida (Willink y Mora 2013). En O. histriónica presentan 12
haplotipos y 26 sitios segregantes.

MUTACION para Oophaga histrionica.

Como ya se ha mencionado, las señales aposemáticas representan uno de los sistemas

clásicos para estudiar la evolución y, como tales, han recibido considerable investigación
empírica y teórica. A pesar de la extensa literatura sobre la coloración aposemática, sigue
habiendo mucha incertidumbre sobre los cambios genéticos responsables de la evolución
repetida de señales similares en linajes múltiples. Aquí, estudiamos la diversificación y la
convergencia de la coloración entre linajes de ranas venenosas arlequín aposemáticas
(Oophaga histrionica). Algunos estudios sugieren que diferentes fenotipos de fondo, que
muestran diferentes colores y/o contraste de luminancia, han evolucionado
independientemente al menos dos veces en este grupo. Se ha sugerido que los arreglos
celulares están detrás de la sorprendente diversidad de colores y patrones en este grupo y
proponen que las diferencias en el color de fondo dorsal pueden estar relacionadas con uno
o ambos, la presencia/ausencia de xantóforos y la dispersión de melanosomas. Algunos
análisis genéticos respaldan el papel del receptor de melanocortina MC1R en la agregación
de melanosomas, aquí mostramos evidencia de que 2 mutaciones diferentes (Δ433-C432A)
son responsable de los fenotipos más oscuros en el color de fondo, que pueden mostrar una
señal aposemática más detectable y fácil de aprender (Posso-Terranova et al., 2017).

Tabla 2. Información sobre el gen de estudio MC1R.

Gen MC1R.
Producto Receptor tipo 1 de la melanocortina.
Mutación para color oscuro Δ433 - C432A.
Alelos para coloración de fondo Marrón claro, Marrón oscuro y Negro.
Alelo silvestre Marrón claro

El gen MC1R tiene una importante función en el proceso de pigmentación, codifica para el
receptor de la hormona α-MSH. Cuando la hormona se une al receptor, este se activa y activa
a su vez la cascada de eventos celulares que conducen a la síntesis de las dos formas de
melanina: eumelanina y feomelanina (Acosta 2010). Variantes alélicas del receptor MC1R
(el cual es polimórfico), y el riesgo aumentado a desarrollar MMC con 6 posible asociación
también al fenotipo de pigmentación. (Matichard, et al. 2004). Este gen codifica una proteína
completa de 318 aminoácidos, con 7 dominios transmembrana como se había mencionado
anteriormente y es la causante de la coloración marrón clara de fondo de las ranas. En
contraste la mutación Δ433 codifica una proteína truncada (3-receptor transmembrana)
debido a una inserción en la posición 433 (mutación con cambio en el marco de lectura)
provocando la aparición de un codón de terminación prematuro, por lo que la proteína solo
posee 150 aminoácidos (Posso-Terranova et al., 2017).

Esta mutación es la causante de la coloracion negra para el color de fondo dorsal de las ranas,
presentando a los individuos como homocigotos para esta mutación. En las ranas con
fenotipo silvestre predominó la coloración marrón clara, mientras que el genotipo
heterocigoto entre ambos alelos (silvestre y mutante) provocó una coloración marrón oscura-
negra. En cuanto al alelo C432A se mostró también un truncamiento en la proteína. la
mutación causada por un cambio trasnversional de Citocina a Adenina, cambiando un
aminoácido, se dice que la proteína presentó un truncamiento (144 aa), al igual que con Δ433.
En esta mutación la coloración de fondo del dorso también fue negra, ya que se encontró en
uno de los clados del complejo O, histrionica (Posso-Terranova et al., 2017).
DISEÑO DE LA POBLACION, 100 individuos.

1/p  Alelo/ Dorso color marrón claro

2/q  Alelo  Dorso color marrón oscuro
3/r  Alelo  Dorso color negro

Posibles Combinaciones: 6 genotipos diferentes: 1> (2=3)

1.1
1.2 2.2
1.3 2.3 3.3

Población de 100 individuos: con jerarquía 1> (2=3)

Tabla 3. Frecuencias genotípicas y fenotípicas.

Individuos Genotipo Frecuencia Fenotipo Frecuencia
genotípica fenotípica
12 1.1 0,12 Dorso color 0,3
18 1.3 0,18 marrón claro

11 2.2 0,11 Dorso color 0,24

13 2.3 0,13 marrón
oscuro
46 3.3 0,46 Dorso color 0,46
negro

Frecuencias Genotípicas:
12
 1.1 = 100 = 0,12

18
 1.3 = 100 = 0,18

11
 2.2 = 100 = 0,11

13
 2.3 = 100 = 0,13

46
 3.3 = 100 = 0,46
Frecuencias Fenotípicas:
30
 Dorso color marrón claro = 100 = 0,3

24
 Dorso color marrón oscuro = 100 = 0,24

46
 Dorso color negro = 100 = 0,46

Frecuencias alélicas:

(1.2)+(1.3) 0.18
 𝑓(1) = (1.1) + = 0.12 + = 𝑓(1) = 0.21
2 2

(2.1) (2.3) (0.13)

 𝑓(2) = + (2.2) + = 0 + (0.11) + = 𝑓(2) = 0,175
2 2 2

(3.1)+(3.2) 0.18+0.13
 𝑓(3) = + (3.3) = + 0,46 = 𝑓(3) = 0.615
2 2

𝑓(1) + 𝑓(2) + 𝑓(3) = 0.21 + 0.175 + 0.615 = 𝟏

Tabla 4. Frecuencias alélicas.

1/p 2/q 3/r Polimorfismo Heterocigosidad

0,21 0,175 0,615 95% 0,77

Alelo más frecuente: 3/r: 61,5%

Alelo menos frecuente:  2/q: 17,5%
Polimorfismo  Si

Con estos resultados podemos llegar a un análisis hipotético de que el aposematismo indica
claramente la expresión de coloraciones llamativas beneficiosa como patrón de alerta para
los depredadores, la expresión de eumelanina en los melanóforos como ya sabemos se da
gracias a la expresión del gen MC1R hace que este sea un elemento bastante importante para
la supervivencia de las ranas y claramente se ve reflejado en el número de individuos que
logran poseerla.

MARCADOR MOLECULAR.
Análisis del marcador molecular para el gen adaptativo.
Para el análisis de nuestro utilizaremos el marcador molecular RFLP: (Polimorfismo en el
tamaño de los fragmentos de restricción); se basa en la detección de fragmentos de DNA de
distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes
organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los pequeños derivados de la
digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones,
sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas
identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso
molecular (Tomado de: marcadores moleculares).

Debido a esto se representa la secuencia de nucleótidos del Gen MC1R, silvestre. Se tomaron
500pb de la secuencia de nucleótidos del gen (957pb), teniendo en cuenta la mutación dada
en el estudio de Posso Terranova, 2017.

Origen 1 atgaccccgt tttctgctct acaatcaggc atcaatatca caaacatcac tcttcaaagc

61 acctcagatg tgaaggcgaa tgaaacatcc ataattcata tcgaggtccc taaaggggtc
121 ttcttattcc tatgtgtcct cagcctagtg gagaacatcc tggtggtcgt ggctattgcg
181 aaaaatcaca accttcactc tccgatgtac tatttcatca gctgcctggc tgcgtcagac
241 atgttggtca gtatcagcaa cctggtggag accctaatcc tgatccttct cagctatgcc
301 gtcattgagt ataatgaacc catggtcaaa atgatggaca acattgtaga taccatgatc
361 ctctgttcct tggtgacttc tctctcattt ctcggagct atcgcggtgga ccgctacgtt
421 accatcttct acgctttgag ataccatagc attgtaacgc agcgtagggt ggtcagcgcc
481 attattggga tctggttggc cagcatagct tgtagcgtca cattcatagt attttcggac
541 agccatattg tcatcttgtg tcttattgca ttttttatct tcatgttggt cttaatgttg
601 ggtctctaca tccacatgtt cgttttagcg agaaaacatt cccagatcat atgggcccaa
661 cagagaggag tgcgaagggg attctctccg catcaagccg ctgccaaact ccgaggagcc
721 atcaccttga ccatgctgct tggcatcttc tttctatgct ggggtccttt tttcctccac
781 ctcactctaa tcgtgtcctg tcccaagcac cccttctgcc gtgaatactt caagtacttc
841 aacatcacct ttgtccttat gatattcaac tctattattg accctattat ctacgctttc
901 cgaagccgag agctgagaaa aaccatgaag ggcattgtga tgtgttgttc cttgtga

Como hicimos uso del marcador molecular RFLP, tomamos como enzima de restricción la
AluI (Arthrobacter luteus).

Tabla 5. Información sobre la enzima de restricción AluI.

Enzima Origen bacteriano Sitio de Resultado de corte
reconocimiento

5'AGCT 5'---AG CT---3'

AluI Arthrobacter luteus 3'TCGA 3'---TC GA---5'

Fragmentos de 500 pb:

Marrón claro:
ATGACCCCGT TTTCTGCTCT ACAATCAGGC ATCAATATCA CAAACATCAC TCTTCAAAGC
ACCTCAGATG TGAAGGCGAA TGAAACATCC ATAATTCATA TCGAGGTCCC TAAAGGGGTC
TTCTTATTCC TATGTGTCCT CAGCCTAGTG GAGAACATCC TGGTGGTCGT GGCTATTGCG
AAAAATCACA ACCTTCACTC TCCGATGTAC TATTTCATCA GCTGCCTGGC TGCGTCAGAC
ATGTTGGTCA GTATCAGCAA CCTGGTGGAG ACCCTAATCC TGATCCTTCT CAG CTATGCC
GTCATTGAGT ATAATGAACC CATGGTCAAA ATGATGGACA ACATTGTAGA TACCATGATC
CTCTGTTCCT TGGTGACTTC TCTCTCATTT CTCGGAG CTA TCGCGGTGGA CCGCTACGTT
ACCATCTTCT ACGCTTTTGA GATACCATAG CATTGTAACG CAGCGTAGGG TGGTCAGCGC
CATTATTGGG ATCTGGTTGG

Fragmento 1: 293pb
Fragmento 2: 104pb
Fragmento 3: 103pb

Marrón oscuro, aparece un codón de stop:

ATGACCCCGT TTTCTGCTCT ACAATCAGGC ATCAATATCA CAAACATCAC TCTTCAAAGC
ACCTCAGATG TGAAGGCGAA TGAAACATCC ATAATTCATA TCGAGGTCCC TAAAGGGGTC
TTCTTATTCC TATGTGTCCT CAGCCTAGTG GAGAACATCC TGGTGGTCGT GGCTATTGCG
AAAAATCACA ACCTTCACTC TCCGATGTAC TATTTCATCA GCTGCCTGGC TGCGTCAGAC
ATGTTGGTCA GTATCAGCAA CCTGGTGGAG ACCCTAATCC TGATCCTTCT CAG CTATGCC
GTCATTGAGT ATAATGAACC CATGGTCAAA ATGATGGACA ACATTGTAGA TACCATGATC
CTCTGTTCCT TGGTGACTTC TCTCTCATTT CTCGGAG CTA TCGCGGTGGA CCACTACGTT
ACCATCTTCT ACGGTTTTGA GATACCATAG CATTGTAACG CAGCGTAGGG TGGTCAGCGC
CATTATTGGG ATCTGGTTGG

Fragmento 1: 293pb
Fragmento 2: 104pb
Fragmento 3: 16pb

Negro, mutación de transversión en pb de C por A:

ATGACCCCGT TTTCTGCTCT ACAATCAGGC ATCAATATCA CAAACATCAC TCTTCAAAGC
ACCTCAGATG TGAAGGCGAA TGAAACATCC ATAATTCATA TCGAGGTCCC TAAAGGGGTC
TTCTTATTCC TATGTGTCCT CAGCCTAGTG GAGAACATCC TGGTGGTCGT GGCTATTGCG
AAAAATCACA ACCTTCACTC TCCGATGTAC TATTTCATCA GCTGCCTGGC TGCGTCAGAC
ATGTTGGTCA GTATCAGCAA CCTGGTGGAG ACCCTAATCC TGATCCTTCT CAG CTATGCC
GTCATTGAGT ATAATGAACC CATGGTCAAA ATGATGGACA ACATTGTAGA TACCATGATC
CTCTGTTCCT TGGTGACTTC TCTCTCATTT CTCGGAG CTA TCGCGGTGGA CAG CTACGTT
ACCATCTTCT ACGGTTTTGA GATACCATAG CATTGTAACG CAGCGTAGGG TGGTCAGCGC
CATTATTGGG ATCTGGTTGG

Fragmento 1: 293pb
Fragmento 2: 104pb
Fragmento 3: 16pb
Fragmento 4: 87pb
ELECTROFORESIS del perfil molecular.

Tabla 6. Electroforesis de nuestro perfil molecular; asociado en grupos según las frecuencias
genotípicas resultantes; por ejemplo: 15 individuos con genotipo 1,1 nos dará electroforesis
igual a la columna A.

MARCADORES DE ANALISIS POBLACIONAL.

ADN mitocondrial que abarca el gen de la subunidad 1 de la citocromo oxidasa (COI) peso
de COI en 424pb;
Ubicación: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KFS582751.1
Cebadores: COI-A (5 'AGTATAAGC GTC TGG GTA GTC 3'), COI-F (5'CCT GCA GGA
GGA GGA GAY CC 3 ').

Este sistema lo elegimos porque ya existe información disponible sobre estos fragmentos
para otras especies relacionadas (Medina et al., 2013).

Los marcadores microsatélites son muy buenos, puesto que nos ofrecen ventajas que se deben
en parte a la posibilidad de la amplificacion en cadena de la polimerasa (PCR), ya que los
tejidos que se utilizan no necesitan ser de mmucha calidad, incluso ADN en estado avanzado
de degradacion es suficiente para ser analizado. En este caso aventaja a nuestro primer
marcador de perfil molecular como el nuestro RFLP. Los microsatelites so nmarcadores
apropiados para el estudio de genetica de poblaciones en especies en peligro de extincion
porque se pueden amplificar a partir de cualquier muestra (pelo, heces, plumas, etc) que no
suponen el sacrificio de individuos a estudiar (González).

Tabla 7. Nombre de los loci para los marcadores moleculares y su número de alelos.
Loci Número de alelos
Dpum44 7
Oop_B9 3

Marcador Dpum44

Tabla 8. Información sobre los datos genotípicos del marcador molecular y su frecuencia.
Número de Genotipo Frecuencia
individuos genotípica
12 1,1 0,12
6 1,6 0,06
16 2,4 0,16
8 3,3 0,08
10 3,6 0,10
7 4,1 0,07
12 5,6 0,12
9 5,8 0,09
20 7,7 0,20

Frecuencias alélicas:
(1.2)+(1.3)+(1,4)+(1,5)+(1,6)+(1,7) 0.06+0.07
F (1) = (1.1) + = (0,12) + = 0,185
2 2
(2.1)+(2.3)+(2,4)+(2,5)+(2,6)+(2,7) 0.16
F (2) = (2.2) + = (0) + = 0,08
2 2
(3.1)+(3.2)+(3,4)+(3,5)+(3,6)+(3,7) 0.10
F (3) = (3.3) + = (0,08) + = 0,135
2 2
(4.1)+(4.2)+(4,3)+(4,5)+(4,6)+(4,7) 0.16+0.07
F (4) = (4.4) + = (0) + = 0,155
2 2
(5.1)+(5.2)+(5,3)+(5,4)+(5,6)+(5,7) 0.12+0.09
F (5) = (5.5) + = (0) + = 0,105
2 2
(6.1)+(6.2)+(6,3)+(6,4)+(6,5)+(6,7) 0.06+0.10+0.12
F (6) = (6.6) + = (0) + = 0,14
2 2
(7.1)+(7.2)+(7,3)+(7,4)+(7,5)+(7,6)
F (7) = (7.7) + = (0,20) = 0,20
2

Tabla 9. Frecuencias alélicas del marcador molecular Dpum44.

Alelo Frecuencias alélicas
1 0.185
 2 0.08
3 0.135
4 0.155
5 0.105
6 0.14
7 0.20

F (1) + F (2) + F (3) + F (4) + F (5) + F (6) + F (7) = 1

Tabla 10. Heterocigosidad observada para determinar el polimorfismo al 95%.

1 2 3 4 5 6 7 Polimorfismo Heterocigosidad
0,185 0,08 0,135 0,155 0,105 0,14 0,20 95% 0,6

Alelo más frecuente: 7: 20%

Alelo menos frecuente:  2: 8%
Polimorfismo  Si

ELECTROFORESIS PARA EL MARCADOR Dpum44.

Tabla 11. Electroforesis del marcador molecular Dpum44; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6.
Tabla 12. Electroforesis del marcador molecular Dpum44; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6.
Tabla 13. Electroforesis del marcador molecular Dpum44; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6.
Tabla 14. Electroforesis del marcador molecular Dpum44; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6.
Tabla 15. Electroforesis del marcador molecular Dpum44; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6.

Marcador Oop_B9

Tabla 16. Información sobre los datos genotípicos del marcador molecular y su frecuencia.
Número de Genotipo Frecuencia
individuos genotípica
15 1.1 0,15
21 1.2 0,21
35 2.3 0,35
29 3.3 0,29

Frecuencias alélicas
(1.2)+(1.3) 0.21
F (1) = (1.1) + = (0,15) + = 0,255
2 2
(2.1)+(2.3) 0.21+0,35
F (2) = (2.2) + = (0) + = 0,28
2 2
(3.1)+(3.2) 0.35
F (3) = (3.3) + = (0,29) + = 0,465
2 2
Tabla 17. Frecuencias alélicas del marcador molecular Oop_B9.
Alelo Frecuencias alélicas
1 0.255
2 0.28
3 0.465

F (1) + F (2) + F (3) = 1

Tabla 18. Heterocigosidad observada para determinar el polimorfismo al 95%.

1 2 3 Polimorfismo Heterocigosidad

0,255 0,28 0,465 95% 0,56

Alelo más frecuente: 3: 46,5%

Alelo menos frecuente:  2: 25,5%
Polimorfismo  Si

Electroforesis para el marcador Oop_B9

Tabla 19. Electroforesis del marcador molecular Oop_B9; asociado en grupos de igual modo
que la tabla 6, 11, 12, 13 y 15.
Referencias
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https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n Enzimas de restricción.