COLESTEROL OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN

MARCO TEORICO
El colesterol pertenece al grupo de las grasas o lípidos que es útil para las
fibras nerviosas, para las paredes celulares, para los ácidos tales como los ácidos biliares y
también para el equilibrio de ciertas hormonas. El colesterol HDL son las lipoproteínas de alta
densidad (colesterol bueno) que realizan la función vital de la eliminación del exceso de colesterol,
que es el colesterol malo (llamado LDL). Por lo tanto, evita los bloqueos en las arterias y transporta
el exceso de colesterol al hígado para que pueda ser excretado. Los niveles de colesterol deben
ser de esta manera: Alta HDL y LDL bajo. Pero, cuando es a la inversa, lo que significa, bajo
HDL y LDL alto, esto significa que la persona necesita una modificación seria de la dieta, así
como algunos cambios productivos en el estilo de vida. Es importante aumentar los niveles de
HDL La eliminación de colesterol malo, la prevención de enfermedades del corazón,
y la protección contra el ataque al corazón y accidente cerebrovascular son algunas de las
ventajas principales de las lipoproteínas de alta densidad, conocidas comúnmente como el
colesterol HDL. HDL se considera "colesterol bueno" lo que se necesita en general para la función
saludable del cuerpo, mientras que las lipoproteínas de baja densidad, o LDL, se reconoce como
un tipo dañino de colesterol. Los tipos de alimentos que se consumen, es decir los que no
tienen grasas saturadas peligrosas, contribuyen a la fuente de colesterol HDL en el
cuerpo y proporcionan una serie de beneficios.

BIOQUÍMICA

Los componentes típicos del sistema nervioso (cerebro) son los lípidos, que están contenidos
principalmente en los cilindroejes de los nervios. La sustancia blanca contiene proporcionalmente
más lípidos que la gris. El contenido total alcanza del 12 al 15% del peso fresco,
aproximadamente la mitad del peso seco. Para los distintos grupos de lípidos se han obtenido los
siguientes valores (tanto por ciento del peso en fresco):

 Fosfátidos 6%

 Cerebrósidos 2%

 Esteroles 4% (sustancia blanca: 9%, 4%, 1-2%, respectivamente)

 Sustancia gris: 4%, 1%, 1-2%, respectivamente.

La vaina de mielina de los nervios es birrefringente. Se supone que está formada por capas
coaxiales de proteínas y lípidos, y de tal manera, que siempre entre dos capas de proteínas esta
intercalada una laminilla bimolecular de lípidos.

La neuroglia, o tejido de sostén del tejido nervioso, contiene una proteína esencial, la
neuroqueratina. Probablemente esta es también un componente de las propias células nerviosas
(dendritas y cilindroejes). Es igual a la queratina, si bien la proporción de aminoácidos básicos es
algo diferente. (El parentesco químico con la queratina es interesante porque las células de
neuroglia son también de origen ectodérmico).
El colesterol

Es quizá el esteroide mejor conocido debido a su relación con la arteriosclerosis. Se encuentra

ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero especialmente en las del tejido
nervioso. Es el constituyente de mayor importancia en las membranas celulares y de las
lipoproteínas plasmáticas. A menudo se encuentra combinado con ácidos grasos como ester de
colesterico. Existen en las grasas animales, pero no es las vegetales. El nombre químico es 3-
hidroxi-5,6 colesteno. El colesterol también es identificado como un grupo principal de
lipoproteínas para transportar a los lípidos en el plasma. Aproximadamente la mitad del colesterol
del organismo se origina de su síntesis y el resto es proporcionado por una alimentación
promedio. El hígado sintetiza más o menos 10% del total en los seres humanos, el intestino cerca
de 15% y la piel una gran porción del resto. Prácticamente los tejidos que contienen células
nucleadas son capaces de sintetizar colesterol. La fracción microsomica y el citosol son
responsables de su síntesis.

Glicerofosfolípidos: el alcohol es el glicerol

Esfingofosfolípidos: el alcohol es la esfingosina.

Los fosfolípidos son los principales constituyentes lipídicos de la membranas. El ácido fosfatidico
es muy importante como intermedio en la síntesis de triacilgliceroles y fosfolípidos. Los lípidos
son transportados en el plasma como lipoproteínas y un grupo identificado como tal es el grupo
de los fosfolípidos. Tanto los fosfolípidos como la apolipoproteina C-III se requieren como
cofactores para la actividad de la lipoproteína lipasa. La apolipoproteina C-II .

Los Glucolípidos

son lípidos complejos, líquidos que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. Los
glucolípidos están distribuidos ampliamente cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido
nervioso (como el cerebro). En especial se encuentran en la capa externa de la membrana
plasmática donde forman parte de los carbohidratos de la superficie celular.

Los glucolípidos principales en tejidos animales son los glucoesfingolípidos; contienen ceramida
y uno o más azucares. Los dos más sencillos son la galactosilceramida y glucosilceramida. La
galactosilceramida es un glucoesfingolípido mayoritario del cerebro y otros tejidos nerviosos y
bajo en el resto del cuerpo; contiene cierto número de ácidos grasos C24 característicos.

La glucosilceramida es el glucoesfingolípido sencillo predominante en los tejidos extra neurales,

pero también existen en el cerebro en cantidades pequeñas.

OBJETIVOS

Trataremos de obtener la totalidad de los lípidos de cerebro y fraccionarlos de acuerdo a su

solubilidad en diferentes solventes orgánicos.
MATERIAL

1 vaso de precipitado de 250 ml

5 pipetas graduadas de 10 ml

3 pipetas Pasteur

2 tubos de centrifuga

1 varilla de vidrio

parrilla

centrifuga

3 frascos de 20 ml

Biológico

1 cerebro de (2.5 gramos)

Reactivos

Acetona

Éter

Etanol 95%

METODOLOGÍA

Se pesan los frascos, etiquetándolos como fracción 1 a la 3. Solo pesaremos en papel aluminio
2.5 gramos de cerebro, este se picara y se colocara en un tubo de centrífuga, adicionándole
acetona, 1ml por cada 0.5 g. de cerebro, se homogeniza el tejido por 1 minuto y sé centrífuga a
3000 rpm. Se decanta el SN en el frasco fracción I, y al residuo se le añadirá 2 ml de acetona y
se homogeniza nuevamente, se centrífuga y se vuelve a colocar el SN con la fracción I, (fracción
I es colesterol).
Por 5 minutos se dejará el residuo a temperatura ambiente para evaporar la acetona. Se adicionan
3 ml de éter al residuo, esto sé centrífuga por 2 minutos a 3000 rpm; el SN se colecta en otro tubo
de centrífuga con la leyenda fracción A, esto contiene fosfolípidos, nuevamente se hará otra
extracción con éter y se junta el SN en la fracción A. Ahora quitaremos los residuos de éter
dejando que le dé un poco de aire, entonces se adicionaran 3 ml de etanol al 95% caliente (70°),
agitando y después centrifugando (2 min. a 3000 rpm), el SN se colecta en el frasco de
la Fracción III, la cual son glucolípidos, y se hará otra vez la extracción con 3 ml de etanol.

Calcularemos el volumen de la fracción A y agregaremos 2 volúmenes de acetona,

homogenizamos y centrifugamos (mismo tiempo y rpm); el SN se colocará con la Fracción I; al
residuo se adiciona 3 ml de éter y agitarlo 4 minutos y después centrifugamos, el SN se colocará
en el frasco de la Fracción II (fosfolípidos), esta extracción se repetirá dos veces más y los SN
van al mismo lugar.

En cada frasco se colocarán dos perlas de ebullición y se evaporara a sequedad todos los frascos
sobre la parrilla, no deben quemarse los residuos. Por último, se pesarán los frascos nuevamente
y calcularemos la cantidad obtenida de cada fracción
RESULTADOS.

En este momento se calculará el porcentaje de cada una de las fracciones. Tomando los datos
que obtuvimos al pesar los frascos como lo indica la tabla:

Tabla 1.

Peso inicial del Peso final del Rendimiento

frasco frasco (grs)
Fracción I
73.45 74.07 0.62
(Colesterol)
Fracción II
73.05 73.32 0.27
(Fosfolípidos)
Fracción III
73.46 73.52 0.06
(Glucolípidos)
Ya que tenemos el rendimiento en gramos, ahora podemos obtener el rendimiento porcentual
de cada fracción en una muestra de 2.5 g. de cerebro.

Ahora para hacer la comparación del porcentaje teórico con los resultados obtenidos,
convertiremos los porcentajes teóricos a gramos. Utilizando la media del porcentaje teórico total
de lípidos en el cerebro (12 al 15%).

Colesterol = 4% Fosfolípidos = 6% Glucolípidos = 2%

Tabla 2.

Valor Rendimiento Rendimiento

Fracción
Teórico (grs) (%)
Colesterol (Fracción
0.54 g 0.62 24.8
I)
Fosfolípidos
0.81 g 0.27 10.8
(Fracción II)
Glucolípidos
0.27 g 0.06 2.4
(Fracción III)

Como se puede observar en la tabla 2, el contenido de los diversos lípidos varia en un cierto
rango, es por eso que se necesita sacar el promedio del contenido y sumar lo que se localiza
también en la materia gris como en la blanca, dado que en la obtención se utilizaron ambas. Los
valores teóricos de la tabla 2 son solo promedios de la variación en el contenido de los mismos,
por lo que el resultado del colesterol se encuentra dentro del rango, aunque el porcentaje parece
que excede el contenido propio.

DISCUSIÓN.

IMPORTENTE: Se tiene que tomar en cuenta que el valor teórico es un promedio de entre
12% a 15% del peso fresco del cerebro.

Durante la práctica se determinaron tres tipos de lípidos, colesterol, fosfolípidos y glucolípidos.

Se pudo observar que las concentraciones varían de un compuesto a otro, debido al porcentaje
que se encuentra en el cerebro y pudiera ser también debido a que pudieron quedar pequeños
errores en la extracción, por lo que no se obtiene el valor exacto con respecto a la bibliografía.

El procedimiento de estimación de la grasa por extracción de la materia de origen con un

disolvente, la evaporación de este y la determinación gravimetriílla del residuo es uno de los
métodos más antiguos de extracción.

La propiedad de solubilidad de los lípidos en compuestos orgánicos puede ser aprovechado como
un método de extracción de estos a partir de tejidos de origen animal.

CONCLUSIÓN.

La solubilidad de los lípidos en compuestos orgánicos se aprovecha en la extracción de lípidos

de cerebro debido a que estos son apolares y se pueden extraer de las membranas con
disolventes de la misma naturaleza esto es con disolventes apolares como los utilizados en la
práctica ya que estos al calentarlos reaccionan disolviendo mejor el ácido graso y después se
evapora más rápido el disolvente dejando solo el ácido graso.

De acuerdo con los resultados de este experimento y el parámetro dado en la bibliografía, puede
decirse que la obtención de nuestro producto es aceptable ya que presenta un poco de dificultad
al extraer lípidos de dicho cerebro de pollo ya que existe una interacción con proteínas también
contenidas la cual imposibilita el 100% de extracción y también del experimento ( podemos
agregar que no se verifico la pureza de los solventes) ya que se utilizó el solvente correcto para
cada sustancia como lo es el etanol para la extracción de glucolípidos, la acetona para el
colesterol y el éter comenzando la extracción y la acetona para los fosfolípidos. Se agrega un
comentario para mejorar la manera de analizar las mezclas de ácidos grasos es por medio de la
técnica de cromatografía liquido - gaseosa en columna. El primer paso es convertirlos a ésteres
en una columna caliente formada por un tubo en espiral. Este tubo se empaca con un material
cubierto por una sustancia liquida. Al inyectar, esta se vaporiza y se mezcla con un gas inerte.
Luego, al aplicar la mezcla de gases pasa a través de la columna y las sustancias se separan
debido a sus diferentes solubilidades en la fase líquida estacionaria.

Como la fase líquida está caliente, las sustancias se re evaporan continuamente para volver a
mezclarse con la fase gaseosa en movimiento. El gas que sale de la columna ingresa a un aparato
que detecta y registra la presencia y cantidad de sustancias en cada zona. Único requisito para
poder utilizar la cromatografía para el análisis de cualquier tipo de material no polimérico es la
volatilidad.
 CUESTIONARIO

1.Durante la extracción de los lípidos, ¿Qué ocurrió con las proteínas del
tejido? Explique.
2. Haga una lista de disolventes orgánicos en orden decreciente de
polaridad.

3. De los siguientes lípidos: colesterol, fosfolípidos y glucolípidos ¿Cuál es

la de mayor polaridad y cual la de menor polaridad?
para la extracción utilizamos acetona, eter y etanol, siendo el disolvente mas
polar el etanol seguido de la acetona y por ultimo el menos polar, eter. En la tabla
3 se ven los valores de su respectiva constante dielectrica.

Por tanto la Fracción 3 de glucolípidos es la mas polar, enseguida la Fracción 1

de colesterol y la Fracción 2 de eter, es la menos polar.

4. ¿Qué otro tipo de moléculas lipídicas se deben encontrar en el tejido

cerebral?
Los lípidos del cerebro han sido objeto de estudios intensivos y se ha podido saber mas
acerca de estos gracias a técnicas como la cromatografía. Gracias a estos métodos es
posible determinar la composición de lípidos con mas precisión y descubrir además,
componentes secundarios.

El análisis de lípidos se representa en porcentajes molares, de manera que la composición

de lípidos de un tejido puede compararse directamente con la de otro. Se estudiaron ácidos
grasos de los lípidos del lóbulo frontal incluidos en el cuadro.

Tabla 4. Naturaleza de lípidos de los acidos grasos en el cerebro.

Porcentaje de acidos grasos

Porcentaje de acidos grasos
con cadenas de mas de 18
poliinsaturados en:
atomos de carbono en:
Sulfato
Glicerofosfá Glicerofosfá Glicerofosfá
Esfingomi Cerebró de
Tejido tidos de tidos de tidos de
elina sido cerebrós
etanolamina serina colina
odo
Sustan
cia sujeto: 10
gris meses
46.9 53.0 2.7 9.4 16.1
Sustan 9.1
13.9 23.5 20.3 70.1 71.2
cia
blanca 3.5
12.9 11.5 23.6 80.1 ---
Mielin 1.0
a
Sustan 41.2 36.0 5.8 15.0 34.0
sujeto: 6
cia
años
gris 24.9 9.0 50.4 65.7 88.3
Sustan 5.7 2.4 9.5 54.2 86.5 90.0
cia
blanca 2.6

Mielin indicios
a
Sustan
cia sujeto: 9
gris años
28.4 25.1 7.9 34.7 32.5
Sustan 7.9
23.7 12.5 42.8 85.1 85.6
cia
blanca 4.3
17.4 9.0 46.0 87.1 89.4
Mielin 3.7
a
Sustan
cia sujeto: 55
gris años
41.0 48.5 25.5 90.2 90.0
Sustan 7.6
15.5 14.9 63.2 86.4 82.1
cia
blanca 2.1
4.1 4.4 59.8 87.5 86.0
Mielin 0.4
a

5. ¿Qué otros métodos se conocen para aislar y purificar lípidos?

El contenido total de lípidos se determina comúnmente por métodos de
extracción con disolventes orgánicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier),
sin embargo también puede cuantificarse por métodos de extracción que no
incluyen disolventes (por ejemplo, Gerber, Babcock) y por métodos
instrumentales que se basan en propiedades físicas o químicas de los
lípidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorción de rayos x).
 a. Métodos con solventes:
 Soxhlet: Es el más ampliamente utilizado, usa una extracción Solida- Liquida
en un aparato llamado de la misma manera, se tiene un flujo constante de un
solvente orgánico, por lo general Éter de petróleo, éter etílico o Hexano-
Diclorometano. Este solvente es calentado hasta ebullir, luego condensado y
dispuesto en el tubo Soxhlet, en el cual extrae el aceite contenido en la
biomasa hasta que el tubo se llena, cuando el tubo está lleno de solvente,
este es sifonado hasta el balón que contiene el resto de solvente y se repite
el proceso.
Es sencillo, no es de un trabajo intensivo y los lípidos pueden ser usados para
posteriores determinaciones. Sin embargo, los resultados son menos eficientes
comparados con los del método Bligh & Dyer, no se pueden determinar los
lípidos totales, se necesitan grandes cantidades de solvente, se requiere de un
equipo especial, puede tener efectos adversos en lípidos lábiles y es difícil
controlar muchas de las condiciones (Carvalho et. Al., 2009).
 Folch: también es ampliamente utilizado, se considera el método más fiable
para la recuperación de los lípidos totales, en la extracción los perfiles de los
ácidos grasos permanecen estables, el método subestima sistemáticamente
concentraciones en las muestras que contienen más de 2% de. En algunos
estudios se reporta mas bajo rendimiento en extracción comparado con
Soxhlet.
 Bligh and Dyer: es un método estándar bien establecido, determina lípidos
totales, se basa en un sistema bifásico de equilibrio Liquido- Liquido. Las
muestras pueden ser analizadas directamente sin necesidad de pre-secarlas
y los lípidos obtenidos pueden ser usados para futura determinación, sin
embargo la utilización de cloroformo es una desventaja, pues te compuesto
es toxico con el ambiente.
El procedimiento consiste en realizar una cuantificación gravimétrica, en la cual
se tienen en cuenta tres pasos para la extracción: 1) Methanol+ cloroformo, 2)
Cloroformo y 3) Agua. Después de la separación de fases lípidos totales se
determinan en la fase de cloroformo por análisis gravimétrico seguido de la
evaporación del solvente.
 Schmid-Bondzynski-Ratzlaff: Es un método muy empleado para determinar
los lípidos en queso y en leche en polvo. Económico, extrae lípidos totales y
las muestras pueden ser abalizadas sin secado previo, sin embargo, los
lípidos no pueden ser usados para determinaciones posteriores. El
Procedimiento consiste en ubicar en un vaso de precipitado de 100 ml la
cantidad adecuada de muestra, agregar HCl y calentar. Dejar enfriar, transferir
el contenido a una probeta graduada con tapa esmerilada, lavando el vaso de
precipitado con unos 10 ml de alcohol etílico en dos porciones y luego agregar
50-60 ml de éter. Dejar en reposo 24 horas y leer el volumen de la fase etérea.
Tomar una alícuota exactamente medida y evaporar el éter en un vaso de
precipitado pequeño previamente tarado. Una vez evaporado el éter pesar
nuevamente y determinar el contenido de lípidos por diferencia, teniendo en
cuenta la alícuota tomada para realizar los cálculos.
 Fluidos supercríticos: Los fluidos supercríticos (FSC) tienen la capacidad de
extraer ciertos compuestos químicos con el uso de determinados solventes
específicos bajo la combinación de temperatura y presión. El CO2 es el fluido
supercrítico más utilizado debido a que no es ni tóxico, ni inflamable, ni
corrosivo, es incoloro, económico, se elimina fácilmente, no deja residuos, sus
condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con
diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura y por tanto,
se pueden separar compuestos termolábiles (Velazco et Al., 2007). Después
del paso del CO2, este es evaporado y los lípidos son medidos. Las ventajas
que presenta este método es que es rápido, utiliza solventes orgánicos y los
lípidos pueden ser usados para futuros análisis, sin embargo el alto costo de
los equipos y su complejidad, limita el uso de esta técnica.
 b. Extracción por instrumentos:
 Extracción asistida por Microondas: consiste en el calentamiento de un
solvente en contacto con la muestra. El proceso implica la perturbación de los
 enlaces por puente de hidrógeno, como resultado de la rotación de dipolos
por la radiación en las moléculas y la migración de iones; con la consiguiente
penetración del solvente en la matriz, y transporte al seno del líquido de los
componentes.
La rapidez en el calentamiento es la principal ventaja de las microondas frente a
los métodos tradicionalmente empleados en la extracción con disolventes, que
causan el calentamiento a partir de la transmisión de la energía al material de
forma indirecta. El empleo de las microondas permite, por tanto, significativos
ahorros de tiempo; disminución de los volúmenes de disolventes necesarios en
los tratamientos y, en consecuencia, de energía en el proceso; no contamina
el medio ambiente, lo cual se manifiesta en la reducción de los costos en general,
que constituyen aspectos deseables de alcanzar en todo proceso de extracción,
además de que permite obtener altos recobrados de los compuestos de interés.
Espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) Algunas clases de lípidos
muestran bandas fuertes de absorción de grupos carbonilo en la región
infrarroja, lo que quiere decir que cada uno de ellos, tiene su espectroscopia. Por
consiguiente para establecer un complemento a las técnicas tradicionales surge
el uso de la refractancia en el infrarrojo cercano, que consiste en irradiar con un
haz de luz monocromática los materiales orgánicos, que en función de
la naturaleza de los enlaces y cargas electrostáticas existentes entre sus átomos
y moléculas, absorben una determinada cantidad de energía (reflectancia). Con
esta técnica se generan modelos matemáticos que relacionen la
composición química con cambios de energía en la región correspondiente al
rango infrarrojo cercano. Este método no es destructivo, requiere un mínimo o
nulo tratamiento de la muestra, minimiza el daño ambiental y es una técnica
multianalítica de alta precisión que permite predecir varios factores
simultáneamente. Una vez calibrado el espectrofotómetro, el uso del NIR es de
bajos costos. El NIR está establecido para medir la composición lipídica en
cereales como granos de maíz