BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam

teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa
berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.
(Kimia farmasi Prof.Dr. sujadi Gholib Gandjar, DEA,apt Abdul Rohman ,M.SI.Apt)

Enzimatis adalah salah satu proses modifikasi sifat fisika-kimiaminyak dan lemak.
Interesterifikasi banyak digunakan oleh industri untukmenggantikan proses hidrogenasi dalam
menurunkan asam lemak trans.Resrukturisasi lemak kakao dengan minyak kelapa dan dengan
minyak kemiridengan rasio (90:10); (80:20); (70:30) dan (60:40) dilakukan dengan
prosesinteresterifikasi enzimatis dengan lipase inti sawit, lipase kemiri dan lipase
kakaosebagai katalis dan lipozyme TL IM dan NaOCH3 sebagai katalis
pembanding.Kandungan lemak padat (SFC), titik leleh (TL), komposisi asam lemak
(FA),komposisi trigliserida (TG), dan asam lemak bebas (FFA) ditentukan dalamcampuran.
Proses interesterifikasi menurunkan kandungan lemak padat dan titikleleh pada campuran (
https://brainly.co.id/tugas/28676)

Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS, atau alternatif HPLC-MS) adalah

teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari kromatografi
cair (atau HPLC) dengan kemampuan analisis massa spektrometer massa. LC-MS adalah
teknik yang banyak digunakan untuk berbagai aplikasi yang memiliki sensitifitas dan
spesifisitas sangat tinggi. Pada umumnya aplikasinya berorientasi pada deteksi dan
identifikasi potensi spesifik bahan kimia terhadap kehadiran bahan kimia lainnya (dalam
campuran yang kompleks) (Sumbono 2010).

Kombinasi kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrometri massa (LC/MS) memiliki
dampak yang signifikan terhadap pengembangan obat selama dekade terakhir. Perbaikan
secara terus menerus dalam teknologi antarmuka LC/MS dikombinasikan dengan fitur
canggih untuk analisis struktur, kualitatif dan kuantitatif, telah menghasilkan lingkup aplikasi
yang lebih luas (Lee 1999)

1.2. Rumusan masalah

1) Apa Itu Metode KCKT?
2) Apa Kelemahan Dan Kelebihan Metode KCKT?
3) Bagaimana Cara Penetapan Kadar Metode KCKT?
4) Apa Itu Metode Kromatografi Cair-Spektrometri Massa ?
5) Apa Kelemahan Dan Kelebihan Metode Kromatografi Cair-Spektrometri Massa ?
6) Bagaimana Cara Penetapan Kadar Metode Kromatografi Cair-Spektrometri Massa?
7) Apa Itu Metode Enzimatis?
8) Apa Kelemahan Dan Kelebihan Metode Enzimatis ?
9) Bagaimana Cara Penetapan Kadar Metode Enzimatis?
1.3.Tujuan
1) Mengetahui Apa itu Metode KCKT
2) Mengetahui Apa Saja Kelemahan Dan Kelebihan Metode KCKT
3) Mengetahui Bagaimana Cara penetapan kadar metode KCKT
4) Mengetahui Apa itu Metode kromatografi cair-spektrometri massa
5) Mengetahui Apa Saja Kelemahan Dan Kelebihan Metode kromatografi cair-
spektrometri massa
6) Mengetahui bagaimana Cara penetapan kadar metode kromatografi cair-
spektrometri massa
7) Mengetahui Apa Itu Metode Enzimatis
8) Mengetahui Apa Saja Kelemahan Dan Kelebihan Metode Enzimatis
9) Mengetahui Bagaimana Cara penetapan kadar metode enzimatis
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1. Metode Kromatografi cair kinerja tinggi

merupakan teknik yang mana solute atau zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan
elusi, dikarenakan solute solute ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solute
solute ini diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaaan
kromatografi cair secara sukses terhadap suatu massalah yang dihadapi membutukan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase
gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak suhu kolom, dan ukuran sampel
untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka dibutuhkan
pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam factor yang mempengaruhi pemisahan
pada kromatografi cair. Instrument KCKT pada dasarnya terdiri dari atas delapan komponen
pokok yaitu: (Kimia farmasi Prof.Dr. sujadi Gholib Gandjar, DEA,apt Abdul Rohman
,M.SI.Apt)
a. Wadah fase gerak:
harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menumbuhkan fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan
harus dilakukan degassing(penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas
akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan dektetor sehingga akan
mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat
dianjurkan untuk menggunakan pelarut,buffer dan reagen dengan kemurnian yang sangat
tinggi dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKTs
berderajat KCKT(HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan
gangguan pada system kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam
kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan
pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus
disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel partikel kecil ini.
b. Fase gerak pada KCKT :
Fase gerak atau eluan biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,polaritas fase diam , dan
sifat komponen komponen sampel. Untuk fase normal(fase diam lebih polar dari pada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik(fase diam kurang polar dari fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan panduan
yang berguna dalam memilih fase gerak yang akan digunakan dalam KCKT (tabel 15.1).
Dalam tabel ini juga disertakan data panjang gelombang UV cut-off (pemenggalan UV).
Nilai pemenggalan UV merupakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberikan absorbs lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Pengetahuan tentang
nilai pemenggalan UV ini sangat penting terutama ketika menggunakan detector UV-Vis
dan detector fluorometri. Oleh karena itu, sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang
gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau disekitar dengan panjang gelombang
pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik(komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergeradien(komposisi fase gerak bergerak-gerak selama elusi).
Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campura yang kompleks
terutara jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah camuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal , fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alcohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang
umum dibandingkan dengan fase terbalik.

i. Tabel 15.1
c. Pompa pada KCKT
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,teflom dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 Ml/ menit . untuk tujuan
preparative, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/ menit.
Tujuan penggunaan pompa atau system penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,reprodusibel, konstan,
dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
d. Penyuntikan sampel pada KCKT
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sampel
loop) internal atau eksternal(gambar 15.2)
Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat peyuntikan, katub diputar sehingga
fasea gerak mengalir melewati sampai keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom.
Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik
ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada
KCKT

i. GAMBAR
e. Kolom pada KCKT
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat pada tabel 15.2

Tabel
 f. Fase diam pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silica yang dimodifikasi secara
kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene.
Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-
OH).
gambarrrrrr
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus fungsional yang lain sebagaimana dalam gambar 15.3. hasil
reaksi yang diperoleh disebut dengan silica fase terikat dan stabil terhadap hidrolisis
karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silica yang dimodifikasi ini
mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan
dengan silica yang dimodifikasi.
g. Detector

Detector pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu detector universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum,tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detector
indeks bias dan detector spektrometri massa, dan golongan detector yang spesifik yang hanya
dan akan mendeteksi aanalit secara spesifik dan selektif, seperti detector UV-Vis, detector
fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detector harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

 Mempunyai respon terhadap solute yang cepat

 Mempunyai sensitifitas yang tinggi yakni mampu mendeteksi solute pada kadar yang
sangat kecil.
 Stabil dalam pengoperasiannya
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8µ𝑙 atau lebih kecil lagi
 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran yang
luas
  Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detector yang paling sering digunakan pada KCKT diringks pada tabel 15.4
TABEL

2.2. Penetapan kadar KCKT

2.3. Kekurangan dan kelebihan KCKT

2.3.1. Kelemahan:
 Sulit untuk mengidentifikasi senyawa kecuali jika KCKT dihubungkan dengan
spektrofotometri massa.
 Jika sampelnya sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh
2.3.2. Kelebihan
 Dapat menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam amino,asam-
asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis
 Menentukan menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat
 Memurnikan senyawa dalam suatu campuran
2.4. Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS)
adalah teknik analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari
kromatografi cair dengan spesifisitas deteksi spektrometri massa. Kromatografi cair
memisahkan komponen-komponen sampel dan kemudian ion bermuatan dideteksi oleh
spektrometer massa. Data LC-MS dapat digunakan untuk memberikan informasi tentang
berat molekul, struktur, identitas dan kuantitas komponen sampel tertentu (Agilent 1998).
Instrumen LC-MS pada dasarnya terdiri dari atas empat komponen pokok yaitu.
(acedemia.edu)
1. HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri atas kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan
 kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (Himawan 2010).
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran,
karena perbedaan kekuatan interaksi antara larutan terhadap fasa diam. Larutan
yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih
dulu. Sebaliknya, larutan yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka larutan
tersebut akan keluar kolom, kemudian dideteksi oleh detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram (Isnawati 2013).
2. Analisis Massa
Ada empat jenis umum dari analisis massa yang dapat digunakan untuk
pemisahan ion dalam spektrometri massa (Chemwiki 2014).
a. Quadrupole Analisis Massa: Quadrupole adalah analisis massa yang
menggunakan medan listrik untuk memisahkan ion.
b. TOF (Time of Flight) Analisis Massa:
Prinsip-prinsip dasar analisis massal menggunakan TOF analisis massa
relatif mudah jika dibandingkan dengan banyak perangkat analisis massa lainnya
dimana ion diambil (atau diproduksi) dalam ledakan singkat atau paket dalam
sumber ion dan dikenakan tegangan percepatan.
c. Quadrupole Ion Perangkap Analisis Massa
Analisis ini menggunakan prinsip yang sama seperti analisis quadrupole
dengan menggunakan medan listrik untuk pemisahan ion. Spektrometer massa
perangkap ion bekerja berdasarkan kekuatan ion dalam perangkap, dan
memanipulasi ion dengan menggunakan tegangan konstan dan bidang retensi.
Amplitudo tegangan yang diterapkan memungkinkan analisis massa perangkap
ion membuat ion terperangkap pada perangkat analisis, dimana ion yang tidak
terseleksi diberikan lintasan oleh medan elektrostatik yang menyebabkan mereka
untuk keluar dari perangkap dengan mengisi perangkap dengan fragmentasi gas
inert dari ion yang dipilih sehingga ini berguna ketika informasi struktural
diperlukan.
d. Ion Cyclotron Resonance (ICR)
ICR adalah perangkap ion yang menggunakan medan magnet untuk
menangkap ion ke dalam orbit di dalamnya. Dalam analisis ini tidak ada
pemisahan yang terjadi karena tidak semua ion dapat terjebak di dalam sehingga
medan listrik eksternal diterapkan untuk membantu menghasilkan sinyal .
Frekuensi orbit tergantung pada muatan dan massa ion, bukan dari
kecepatan. Jika medan magnet tetap konstan, muatan untuk rasio massa dari
masing-masing ion dapat ditentukan dengan mengukur kecepatan sudut. Muatan
dari ion-ion yang berlawanan memiliki kecepatan sudut yang sama, yang
membedakan hanyalah mengorbit dalam arah yang berlawanan.
Dalam orbit energi tinggi, seperti ion yang berosilasi antara dua piring,
elektron menumpuk di salah satu piring atas yang lain dan mendorong arus untuk
berosilasi, berbanding lurus dengan jumlah ion dalam sel pada frekuensi tertentu.
3. Detektor
Setelah ion keluar dari analisis massa, ion tersebut harus dideteksi dan
diubah menjadi sinyal yang dapat digunakan. Detektor merupakan elemen penting
dari spektrometer massa yang menghasilkan sinyal dari ion dengan menghasilkan
elektron sekunder, yang selanjutnya diperkuat dengan menginduksi arus
(dihasilkan dengan memindahkan beban). Sistem detektor ion terbagi dalam dua
kelas utama :
 Detektor titik: ion tidak spasial diselesaikan dan berurutan menimpa
detektor yang terletak pada satu titik dalam geometri spektrometer.

Gambar 13 Detektor titik

  Detektor array: ion secara spasial diselesaikan dan semua ion tiba secara
bersamaan (simultan atau dekat) dan dicatat di sepanjang pesawat
menggunakan bank detektor.

Gambar 14 Detektor array

2.5. Penetapan kadar

Cara kerja kromatografi cair adalah sama dengan HPLC atau kromatografi cair
lainnya. Sedangkan cara kerja spektrometer massa menggunakan metode ESI (Wibowo
2011) adalah sebagai berikut :
Gambar 15 Proses pemisahan analit pada kromatografi cair sampai dengan penyemprotan
(penyemprotan oleh spray needle tip)

a. Analit bersama dengan eluen dari syringe pump atau LC masuk ke dalam kapilari.
Di dalam kapilari terdapat anoda (kutup negatif) pada Taylor cone dan katoda (kutup
negatif) didekat masukkan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi agar muatan yang
berkumpul pada Taylor cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat terjadi
penyemprotan dan terbentuk droplet (tetes–tetes) tidak bergabung menjadi droplet yang
lebih besar lagi.
b. Analit dan solven (eluen) disemprotkan (spray) melalui Taylor cone.
Akan terbentuk droplet–droplet yang akan mengalami tahap evaporasi solven untuk
mengurangi solven yang menempel di analit.
c. Droplet yang mengalami ledakan kolom tersebut akan masuk ke dalam cone dimana di
sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N2). Gas ini berfungsi agar analit
yang terjadi stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen.
Droplet tersebut ditransfer melalui lubang kapiler untuk dianalisis menggunakan
spectrometer massa.

Gambar 16 Proses setelah analit dipisahkan oleh Liquid Chromatography

d. Analit yang terikut dalam eluen masuk ke dalam jarum penyemprot/kapiler, kemudian
eluen bersama analit disemprotkan menjadi bentuk tetes-tetes (droplet). Tetes-tetes
 tersebut masuk ke dalam counterelectrode (biru). Tetesan masuk melalui kapiler transfer
kemudian menuju spektrometer massa.
e. Pada jarum kapiler terdapat Taylor cone dimana daerah tersebut bermuatan negatif
sehingga analit dalam solven yang memiliki muatan positif akan berkumpul di daerah
Taylor cone, pada saat terjadi penyemprotan, tetesan-tetesan (droplet) permukaannya
memiliki muatan positif.
f. Droplet mengalami evaporasi solven, akibatnya droplet menyusut sampai titik dimana
tegangan permukaan pada droplet tidak dapat menopang muatan dipermukaannya
sehingga terjadi perpecahan dalam droplet tersebut yang disebut “coulombic” ledakan
menjadi bagian-bagian, dimana bagian-bagian tersebut antara lain :
a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion)
b. Satu analit bersama solven yang diliputi oleh muatan positif
c. Beberapa analit bersama beberapa molekul solven dan diliputi oleh beberapa
muatan positif.

Gambar 17 Proses droplet berubah menjadi analit

g. Muatan positif pada solven biasanya ditambahkan dari ion-ion Na+, Li+, K+, NH4+ dan
kationik lainnya. Akibatnya pada spektra sering terjadi penambahan berat molekul ion-
ion tersebut disamping penambahan berat molekul solven. Ion harus dibuat bermuatan
positif agar masing-masing tetesan (droplet) tidak saling menempel lagi (membentuk
 tetesan yang lebih besar). Tetesan (droplet) dapat bermuatan positif atau negatif
tergantung dari daya yang ditempelkan pada kapilari. Untuk ion negatif digunakan Cl-.

2.6. Kelebihan dan kelemahan

2.6.1. Kelebihan
Keuntungan dari LC-MS yaitu dapat menganalisis lebih luas berbagai komponen, seperti
senyawa termal labil, polaritas tinggi atau bermassa molekul tinggi, bahkan juga protein.
Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi relatif dengan lapisan kimia partikel-partikel
(fase diam) dan elusi pelarut melalui kolom (fase gerak). Komponen elusi dari kolom
kromatografi kemudian diteruskan ke spektrometer massa melalui antarmuka khusus
(Gates 2005).

2.6.2. Kelemahan

2.7. Metode enzimatis

Suatu metode spektrofotometri UV yang sederhana,cepat,peka dan tidak mahal untuk analisis
amoksisilin dalam sediaan farmasetik telah dikembangkan dengan mendasarkan pada reaksi
enzimatis. Dalam metode ini, rantai samping D-4hidroksifenilglisin pada amoksisilin secara
selektif dipecah oleh aksi penisilin asilase. Selanjutnya, senyawa hasil pecahannya beraksi
dengan 2-oksoglutarat dengan katalis D-fenilglisin aminotransferase (DPhgAT)
menghasilkan produk yang sangat menyerap UV, yakni 4-hidroksibenzoilformat. Banyaknya
amoksisilin ditetapkan sebagai perubahan absorbansi di 335 nm (gambar 4.17). prinsip reaksi
amoksisilin dengan 2 enzim ini adalah sebagai berikut
GAMBAR