QUÍMICA BIOLÓGICA
GUÍA DE PROBLEMAS 2019
EQUIPO DOCENTE:
Profesor Asociado: Dr. Andrés Venturino
Asistente de Docencia: Dra. Cecilia Lascano
Ayudante de Primera: Dra. Mariana Mardirosian
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
Nu RER Mi Ci Ex PM
66 kDa Figura 1: Western Blot de la proteína "A"
hepática. Fracción nuclear (Nu), retículo
endoplásmico rugoso (RER), mitocondria (Mi),
40 kDa citosol (Ci), medio extracelular (Ex). PM: indica
los pesos moleculares de 4 péptidos utilizados
20 kDa como patrones de referencia.
10 kDa
2) Se aísla una proteína X del citosol, que presenta un PM nativo de 120 kDa. El análisis por SDS-PAGE
en condiciones desnaturalizantes y reductoras, seguido de la incubación con el anticuerpo específico
anti-X y del revelado (Western Blot), conduce a la observación de una banda de 60 kDa.
El agregado de X a una solución conteniendo glucosa, ATP y Mg 2+ provoca la rápida aparición de
glucosa-6-fosfato (G6P). El reemplazo de ATP por GTP anula la aparición de G6P, al igual que la
eliminación de Mg2+.
NH2 (Adenina-ATP)
= O (Guanina-GTP)
GlucoquinasaGlucoquinasa
Glucosa Glucosa-6-fosfato
a) Esquematice el Western Blot obtenido durante el análisis de la proteína X.
b) Describa brevemente la organización más probable de la estructura terciaria. Tenga en cuenta su
localización subcelular y las propiedades fisicoquímicas de los grupos R.
c) Describa la estructura cuaternaria de X, número y tipos de subunidades si las hay, y los tipos
más probables de fuerzas químicas responsables de las mismas.
d) Escriba la reacción química en la que intervendría X. Indique su función biológica, analice su
especificidad y describa los requerimientos.
2
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
3) A partir de dos cepas1 diferentes de la bacteria E. coli (cepa 1 y cepa 2), se aislaron las enzimas 1 y 2.
Ambas enzimas catalizan la misma reacción, que es el primer paso en la síntesis de la vitamina “Z”.
Dicha vitamina es capaz de inhibir a las enzimas 1 y 2.
Luego de separar extractos proteicos de estas dos cepas por SDS-PAGE se obtienen bandas
correspondientes a las enzimas 1 y 2 cuyo peso molecular es de 25 kDa. Al realizar la separación de los
extractos proteicos por ultracentrifugación se logró obtener el peso molecular nativo, que para la enzima
1 fue de 100 kDa y para la enzima 2 de 25 kDa.
En las figuras se muestra el comportamiento cinético de las enzimas 1 y 2, respectivamente.
a) Indique justificando, el número y tipo de subunidades que presentan las enzimas 1 y 2.
b) Analice el comportamiento cinético de ambas enzimas y compare las constantes cinéticas con y
sin el agregado de “Z”.
c) Caracterice el efecto que produce el agregado de “Z” sobre la cinética de ambas enzimas.
Correlacione su respuesta con lo que ocurre a nivel de la estructura de la proteína.
Cepa 1 Cepa
Cepa2II
5
v (mUI/ mg prot)
4 -Z
3
+Z
2
1
0
0 2 4 6 8 10
[s] (mM)
4) La enzima aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza el primer paso en la ruta biosintética del
nucleótido citidina trifosfato (CTP):
1
Cepa: tipo particular de bacteria de cierto género y especie, que se diferencia de otros miembros de su mismo género y
especie en características serológicas, morfológicas o genéticas. Ej: E. coli K-12, E. coli B, E. coli uropatogénica, E. coli
enteroinvasiva, etc.
3
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4
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
PROBLEMA INTEGRADOR:
75 kDa
Figura 1: Western Blot de ODC
25 kDa en distintas fracciones
subcelulares de hígado de rata.
Cit: citosol; Mit: mitocondria; Núc:
10 kDa núcleo; PM: marcadores de peso
molecular.
5
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1) Se aísla una proteína X a partir de la fracción microsomal de células intestinales, para lo cual es
indispensable el tratamiento con un detergente. El análisis del peso molecular en condiciones nativas
por filtración en gel y por electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) coincide en un valor de 150 kDa.
Se determina que la proteína X purificada se une a glucosa y Na+ en forma específica. La unión de X
con Na+ se inhibe específicamente con Li+.
Al trabajar con células enteras, se demuestra que las mismas son capaces de acumular glucosa
exclusivamente en presencia de Na+ y que esta actividad es anulada por la presencia simultánea de Li+.
a) Determine la ubicación celular, peso molecular nativo y número de subunidades de X en base a
los tratamientos empleados.
b) Describa brevemente las características estructurales de X más probables en cuanto a su
ubicación e interacción con glucosa y Na+.
c) Caracterice la acción del Li+ respecto de la interacción Na+ - X.
d) Indique a qué tipo de proteínas podría corresponder X de acuerdo a su función.
Efecto de Ionóforo de H+ en la
Cinética de Captación de Glucosa Captación de Glucosa
5 2.5
Vel.de Entrada
4 2
+ATP +ATP,- FCCP
(nmol/min)
3
Ci/Ce
1.5
2 1
1 -ATP 0.5 +ATP,+FCCP
0 0
0 20 40 60 0 2 4 6
[Glucosa] (M) Tiempo (min)
Figura 1 Figura 2
3) Se estudió el transporte del ácido 1-malonil amino ciclopropano carboxílico (MACC), precursor de la
biosíntesis de la fitohormona etileno, en vacuolas aisladas de células de Catharanthus roseus. En la
Figura 1 se muestra la relación de concentraciones intra y extravacuolar (Ci/Ce) de MACC en función del
tiempo, con o sin el agregado de 5 mM de Mg-ATP. En la Figura 2 se muestra la dependencia de la
captación de MACC con respecto a su concentración inicial externa, en presencia de 5 mM de Mg-ATP,
a 30 minutos. Para caracterizar el tipo de transporte se estudió el efecto de inhibidores de la ATPasa y/o
colapsantes o bloqueantes del gradiente electroquímico de protones: DCCD, CCCP, gramicidina y
2
Ionóforo: compuesto que fija uno o varios iones y que puede difundir a través de una membrana transportando el ión unido.
6
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
benzilamina (Tabla 1). También se estudió el efecto de sustancias que modifican grupos R de
aminoácidos en las proteínas: dansil cloruro (bloqueante de grupos oxhidrilo), NEM (bloqueante de
grupos sulfhidrilo), DIDS (bloqueante de grupos amino, lo que resulta en un bloqueo de canales
aniónicos) y DCCD (bloqueante de grupos carboxilos, lo que resulta en un bloqueo de canales de
protones) (Tabla 2).
a) ¿Qué efecto produce el agregado de Mg-ATP sobre el transporte de MACC?
b) ¿Qué tipo de transporte(s) presenta el MACC en vacuola?
(nmol/10 6 vacuolas/hr)
10
captación MACC
1,5 8
6
Ci/Ce
sin ATP
1
Mg-ATP 5 mM 4
0,5 2
0
0
0 10 20 30
0 30 60 90
tiempo (min) MACC externa (mM)
7
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PROBLEMA INTEGRADOR:
4) Se realizó el análisis estructural y funcional de una proteína receptora del neurotransmisor acetilcolina
(ACh), denominada en adelante "AChR", y que media los impulsos nerviosos provocando la contracción
muscular. Para el trabajo se aislaron células de músculo y se extrajo la AChR utilizando un tratamiento
prolongado con detergente Triton X100 al 0,1%.
La proteína purificada presentó un peso molecular de 290 kDa, y el tratamiento con N-glicosidasa
(enzima que hidroliza grupos de azúcares unidos covalentemente a residuos amino en las proteínas)
redujo el PM a 280 kDa. Se realizó un estudio de AChR purificada mediante SDS-PAGE y se tiñó la
proteína con azul de Coomasie (Figura 1A).
Se realizaron estudios funcionales con células musculares intactas, midiendo el efecto del
neurotransmisor ACh sobre la concentración citosólica de Na+ y K+ según se muestra en las Figuras 2 y
3, respectivamente.
También se analizó el efecto que provoca la Proteína Quinasa A (PKA), sobre la función de AChR, para
lo cual se adicionaron sustancias activadoras específicas de PKA 5 minutos antes del tratamiento con
ACh (Figuras 2 y 3). La acción a nivel molecular de PKA sobre AChR se analizó más profundamente
sobre la proteína purificada, mediante la incubación con PKA y ATP marcado con 32P radiactivo, seguido
del análisis por SDS-PAGE y revelado del gel por autorradiografía (Figura 1B).
a) Analice la composición de AChR en cuanto a subunidades, tipo y número.
b) ¿Qué información aporta el tratamiento de AChR con N-glicosidasa? ¿Cómo clasificaría a la
proteína?
c) Analice el efecto de ACh sobre las concentraciones de Na+ y K+; ¿qué función biológica tiene
AChR como proteína? ¿Qué efecto produce ACh sobre AChR?
d) En base a la información disponible indique cuál es la localización celular de AChR y qué tipo de
estructura o dominios presentaría según su función e interacción con moléculas.
e) Analice y explique cuál es la acción de PKA sobre AChR a nivel molecular y funcional.
A) SDS-PAGE B) Autorradio-
y Coomasie grafía con 32P
PM
(kDa)
62 δ
60 γ
58 β
50 α
8
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120
100 +ACh
80
[Na +] i
60
Figura 2: Variación en el tiempo de la
40 concentración citoplasmática de Na+
sin ACh;
20
trat con PKA+ACh
en célula muscular intacta (unidades
0 arbitrarias): Efecto de ACh y del pre-
0 1 2 3 4 5 6 tratamiento con PKA seguido de
tiempo (miliseg) estímulo con ACh.
120
100
sin ACh;
80 trat con PKA+ACh
Figura 3: Variación en el
[K+] i
60
tiempo de la concentración
40 citoplasmática de K+ en
20 célula muscular intacta
+ACh
0
(unidades arbitrarias): Efecto
0 1 2 3 4 5 6 de ACh y del pre-tratamiento
tiempo (miliseg) con PKA seguido de
estímulo con ACh.
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COMPRENSIÓN DE CONCEPTOS
1) ¿Por qué no podrían formar una doble hélice los pares de bases purina-purina o pirimidina-pirimidina?
2) Para la hebra de ADN 5'-TACGATCATAT-3' la hebra de ADN complementario correcta es:
3) a) Escribe la secuencia complementaria de la siguiente hebra:
ATCGUTAGCTUAG
b) ¿Podría existir esta secuencia en la naturaleza? ¿Por qué?
4) Completa el esquema. Separa con una línea (equivalente a la membrana nuclear) los procesos
nucleares de los citoplasmáticos para un organismo eucariota.
ADN ADN
5) Un ARN mensajero tiene 336 nucleótidos de longitud, incluyendo los codones de iniciación y de
terminación. El número de aminoácidos de la proteína traducida a partir de este ARNm es:
a) 335; b) 112; c) 168; d) 111; e) cualquier valor ≤ 111; f) ninguna de estas opciones.
Explica tu respuesta.
7) Bajo condiciones en que la metionina debe ser el primer aminoácido y teniendo en cuenta la siguiente
secuencia de ARNm: 5'-CCUCAUAUGCGCCAUUAUAAGUGACACACA-3'
a) ¿qué proteína estará codificada?
b) ¿Cuál es la secuencia de la hebra de ADN molde sobre la que se sintetiza este ARNm?
c) ¿cuál es la secuencia de la hebra de ADN que codifica para este ARNm?
9) Analiza las siguientes frases e indica V o F. Justifica tus respuestas, puede hacerse de forma global.
Los genes: a) siempre codifican para un polipéptido.
b) presentan secuencias reguladoras como los promotores, que no se transcriben, y
regiones transcriptas.
c) contienen información para la producción de distintos tipos de ARN.
1) Se estudia la expresión de una proteína G en riñón de ovino, comparando los niveles de ARNm,
proteína y actividad en riñones de animales privados de agua durante 1 día con animales control.
Indique a qué niveles se produce regulación de la expresión de G.
100
90 Control
80 Estrés Hídrico
Nivel relativo %
70
60
50
40
30 Niveles relativos de ARNm de G (Northern blot),
20
proteína G (Western blot) y actividad de G,
10
0
medidos en riñón de ovejas control o sometidas
ARNm G Prot G Actividad G a estrés hídrico durante un día.
2) En biología molecular, un “gen reportero” es un gen que se adiciona a la secuencia del gen cuya
expresión se desea estudiar. Existen diversos genes reporteros, todos caracterizados por la facilidad con
que pueden ser detectados en el laboratorio.
En el presente trabajo, se estudió la regulación de la expresión de un gen relacionado con la maduración
de frutos, denominado “mad”. Para ello, se insertó el gen estructural de la enzima glucuronidasa, “gus”,
como gen reportero bajo control de la región regulatoria de “mad”, según se muestra en el siguiente
esquema:
sitio de inicio de la transcripción
1 2 Gen mad
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75 75 75
% relativo
% relativo
% relativo
50 50 50
25 25 25
0 0 0
Control Etileno Control Etileno Control Etileno
Tratamiento Tratamiento Tratamiento
100%
100%
80%
80%
60% 60%
ARNm GAD
0% 0%
0 0,5
1 12 23 2 4- 7 75 0 L1
1 L2
2 L3
3 L4
4 L5
5 L66
Tamaño de Flor (cm) Estadios de
Estadios de Desarrollo
desarrollo de
de Flor
hoja
Figura 1: Porcentaje de ARNm-GAD,
Figura 2: Porcentaje de ARNm-GAD,
proteína GAD y actividad GAD en flores en
proteína GAD y actividad GAD en hojas en
distintos estadios de desarrollo, desde 0,5-
distintos estadios de desarrollo.
a 7 cm de largo (flor abierta, pétalos
extendidos).
4) Se estudiaron los cambios en los niveles de actividad, proteína y ARNm de Metil-esterasa de Pectina
(PME), una proteína que hidroliza pectina en la pared celular, durante el desarrollo del tomate. Para ello
obtuvieron, a partir de la PME purificada, un anticuerpo específico y lograron posteriormente aislar el
ARNm de PME y preparar una copia de ADN que se utilizó como sonda para detectar y cuantificar dicho
ARNm en los preparados. En la Figura 1 se muestran los niveles de ARNm de PME (A, C), proteína
PME (A, B) y actividad PME (A) para distintos estadios de maduración del tomate (días desde floración,
RR: sobremaduro a los 50 días en promedio) y para raíz (rt), tallo (st) y hoja (lf).
a) ¿Cómo se regula la PME (a qué nivel) durante el desarrollo del fruto?
b) Explique a nivel genético la diferencia en la expresión de PME entre órganos.
c) Explique el resultado contradictorio entre actividad y nivel de proteína PME en raíz.
d) ¿Por qué se observa variación en la actividad PME en el desarrollo frutal?
e) ¿Por qué existe diferente expresión de PME de acuerdo al órgano?
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
PROBLEMA INTEGRADOR:
5) Se analizó el papel de factores regulatorios sobre las enzimas que intervienen en la vía de síntesis de
lignina, que actuarían a través de secuencias de unión al ADN de los genes que codifican para las
mismas (Plant Cell 21:248-266, 2009). Se comparó la expresión de un factor, MYB58, en plantas
normales de Arabidopsis (FN: fenotipo normal) y en plantas modificadas genéticamente con múltiples
copias del gen myb58 que codifica para este factor (FSE: fenotipo sobreexpresión). Para ello se analizó
la cantidad de ARNm-myb58 en ambos tipos de plantas (Figura 1A). Luego se analizó la cantidad de
ARNm de la enzima 4-cumarato-CoA ligasa (ARNm-4cl1), que participa en la síntesis de lignina, en
ambos tipos de plantas (Figura 1B). El gen de esta enzima tiene una secuencia regulatoria formada por
3 segmentos sucesivos ACCAACC; se construyeron plantas transgénicas conteniendo genes quiméricos
con esta secuencia en 5’ unida al gen reportero gus, a partir de FN (FN/GUS), FSE (FSE/GUS), y con la
secuencia mutada (GCCAGCC) (FSE/mut); se midió la actividad de glucuronidasa como producto de la
expresión de gus (Figura 1C).
a) Analice y explique los resultados de la figura 1A, y proponga teóricamente qué cantidad relativa
de proteína MYB58 espera encontrar en ambas plantas.
b) Analice y explique los resultados de 1B proponiendo qué nivel de regulación de la expresión de la
enzima 4CL1 estaría afectado.
c) Haga un esquema de los genes quiméricos introducidos. Analice y explique los resultados de la
Figura 1C, proponiendo un mecanismo regulatorio de la expresión para 4CL1.
120
1A 1B 1C
ARNm - myb58 ARNm - 4cl1 -Actividad GUS-
100
Nivel Relativo %
80
60
40
20
0
FN/ FSE/ FSE/
FN FSE FN FSE
GUS GUS mut
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BIOENERGÉTICA
COMPRENSIÓN DE CONCEPTOS
1) Indique si las siguientes frases son Verdadero o Falso. Justifique su respuesta:
- La función principal del ATP es suministrar energía para procesos endergónicos, no favorables.
- El ∆G de una reacción depende de la vía por la que ocurre la transformación.
- Comparando el valor de ∆G de dos reacciones es posible indicar cuál ocurre con mayor velocidad.
- Si ∆G = 0, el sistema se encuentra en equilibrio y no puede producirse cambio neto en ningún sentido
- Una reacción se produce espontáneamente sólo si ∆G es negativo.
- El ∆G de una reacción varía de acuerdo a la concentración de reactivos y productos.
- El ∆G de una reacción afecta el punto de equilibrio de la misma.
- Si ∆G > 0 para una reacción, la misma no puede ocurrir en un sistema biológico.
3) Calcule el ∆G para la reacción planteada en el problema anterior, con concentraciones iniciales de:
glucosa = 2x10-6 M; ATP = 1x10-6 M; glucosa-6P = 5x10-4M; ADP = 1x10-5M, temperatura 25 °C. Analice
comparativamente la espontaneidad de cada una de las reacciones planteadas. Discuta la diferencia de
los resultados obtenidos en los problemas 4 y 5, considerando que se trata de la misma reacción. (R=
2x10-3 kcal mol-1K-1)
4) Indique el sentido de cada una de las siguientes reacciones cuando todas las sustancias
reaccionantes están presentes en cantidades equimoleculares:
6) Indique en cada caso cuál es la opción que le permite enunciar conceptos correctos:
En una reacción de óxido reducción...
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
a) los electrones se transfieren desde un compuesto a otro en forma espontánea cuando la diferencia de
potencial redox es positiva.
b) la espontaneidad de la reacción depende únicamente del número de electrones transferidos.
8) a) Calcule la energía libre real de hidrólisis de ATP en eritrocitos humanos. El ∆G° es -30,5 kJ/mol, y
las concentraciones respectivas son: ATP = 2,25 mM, ADP = 0,25 mM y Pi = 1,65 mM. Considere que el
pH es de 7,0 y la temperatura corporal es de 37ºC (R = 8,315 J/(mol.K)).
b) ¿Qué nos dice este resultado sobre la cantidad de energía requerida para sintetizar ATP en las
mismas condiciones celulares?
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
METABOLISMO DE LA GLUCOSA
COMPRENSIÓN DE CONCEPTOS
1) Se descubre una levadura mutante cuya vía glicolítica es más corta debido a la presencia de una
nueva enzima que cataliza la reacción:
gliceraldehído-3-fosfato + H2O + NAD+ 3-fosfoglicerato + NADH + H+
Este acortamiento de la vía glicolítica: ¿sería beneficioso para la célula? ¿Por qué?
2) Predecir el efecto de cada una de las siguientes mutaciones sobre la velocidad de la glicólisis en
células hepáticas:
a) pérdida del centro alostérico para el ATP en la fosfofructoquinasa.
b) pérdida del centro de unión para el citrato en la fosfofructoquinasa.
c) pérdida del centro de unión para la fructosa 1,6-bifosfato en la piruvato quinasa.
3) Cuando se añade O2 a una suspensión anaeróbica de células que utilizan glucosa a una velocidad
elevada, la velocidad de consumo de glucosa desciende de manera espectacular a medida que se
consume el O2 añadido. Además, cesa la producción de lactato. Este efecto, observado por primera vez
por Louis Pasteur en la década de 1860, es característico de la mayoría de las células capaces de
catabolizar glucosa tanto en forma aeróbica como anaeróbica.
a) ¿Con qué nombre se conoce a este efecto?
b) ¿Por qué cesa la acumulación de lactato después de añadir O2? Tenga en cuenta al transportador de
electrones NADH.
c) ¿Por qué la presencia de O2 disminuye la velocidad de consumo de glucosa?
4) Durante el ejercicio físico intenso, la demanda de ATP en el tejido muscular se incrementa muchísimo
a la vez que el suministro de oxígeno local cae. En caso de anoxia (ausencia de oxígeno) o hipoxia (baja
presión de oxígeno) durante el ejercicio intenso del músculo:
a) ¿Cuál es el combustible metabólico utilizado por las células musculares? ¿De dónde proviene?
b) ¿Qué vía metabólica suministra ATP?
c) ¿A qué vía metabólica ingresa el intermediario metabólico producido en b)? ¿Cuál es el producto final
obtenido?
d) ¿Qué vías metabólicas se encuentran inhibidas? ¿Por qué?
e) Suponiendo que el músculo carece de lactato deshidrogenasa: ¿podría llevar a cabo una actividad
física intensa? ¿Por qué?
f) ¿Cómo sería la velocidad de consumo de glucosa en células musculares sometidas a ejercicio físico
intenso? ¿Por qué?
g) Considerando las respuestas anteriores, indique de qué manera se encuentran reguladas las enzimas
clave que participan en las vías metabólicas que le permiten al músculo seguir funcionando en anoxia o
hipoxia.
6) Aunque el O2 no participa directamente en el ciclo del ácido cítrico, el ciclo opera únicamente en
presencia de él. ¿Por qué?
7) ¿Cómo espera que responda el funcionamiento del ciclo del ácido cítrico frente a un incremento
rápido en la relación NADH/NAD+ dentro de la matriz mitocondrial? Explique.
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
METABOLISMO DE AZÚCARES
1) En presencia de cantidades saturantes de oxalacetato, la actividad de la enzima citrato sintasa de
corazón de cerdo presenta una dependencia sigmoidea con respecto a la concentración de acetil-CoA.
Cuando se añade succinil-CoA, la curva experimenta un corrimiento hacia la derecha y se acentúa la
dependencia sigmoidea:
120
100
Actividad (% de Vmax)
Sin succinil-CoA
80
60
Con succinil-CoA
40
20
0
0 20 40 60 80 100 120 140
[Acetil-CoA] (uM)
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
1.14 14
1.1
10
1.08
1.06 8
1.04 6
1.02
4
1
0.98 2
0.96 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (días) Tiempo (días)
300 7
concentración (ug/gPF)
250 6 Triosas-P
5 Etanol
200
4
150
3
100
2
50
1
0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
tiempo (días) Tiempo (días)
12
10
8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (días)
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
Figura 1: Niveles de G6P (Δ), F6P (◊), y Figura 2: Niveles de lactato en músculo
F1,6diP (О) en músculo aductor de bivalvo, aductor de bivalvo, durante la aclimatación a
durante la aclimatación a anaerobiosis. anaerobiosis.
Figura 3: Cambios en ATP (О), ADP (Δ), y Figura 4: Niveles de F2,6diP en músculo
AMP (),en músculo aductor de bivalvo, aductor de bivalvo, durante la aclimatación a
durante la aclimatación a anaerobiosis. anaerobiosis.
20
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
4) Con el fin de hacer estudios metabólicos se desarrolló un cultivo del alga verde unicelular
Selenastrum minutum en un medio que contenía las condiciones de nutrientes adecuadas, O2 y luz
(Plant Physiol. 1990, 94: 1116-1123).Cuando la cantidad de masa celular fue apropiada, el cultivo se
colocó en oscuridad y a los 20 min fue privado de oxígeno. A distintos tiempos (indicados en las figuras)
se extrajeron células y se congelaron rápidamente bajo N2 líquido para detener su metabolismo. Se
hicieron las determinaciones correspondientes de los metabolitos, balance de C, degradación de
almidón (sustrato endógeno) y estado energético de las algas, según se presentan en las tablas y
figuras a continuación.
a) ¿Qué vías metabólicas se hallan activadas o reprimidas en cada paso del experimento?
b) ¿Por qué se duplica la velocidad de degradación del almidón al pasar las algas a anaerobiosis?
c) ¿Qué función cumple y cuál es el destino del flujo de C desde almidón?
d) ¿Cuáles enzimas y vías metabólicas se encontrarán activadas y cuales inhibidas en anoxia?
Indique los moduladores responsables en cada caso.
e) ¿Por qué se desarrolló el cultivo en condiciones de luz y O2 inicialmente?
Tabla l: Balance de C en anoxia (30 min) Tabla II: Velocidad de degradación del almidón
Metabolito Equivalentes Condición Velocidad
(mol Triosa /mg
(mol glucosa/ mg clorofila/h)
clorofila/h)
Aerobiosis 13.0
Consumidos Producidos Anaerobiosis 25.3
Almidón 50.6
Lactato 29.9
Etanol 8.5
Total: 38.4
% de C recuperado
(productos/almidón) %: 84.8
21
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
22
Química Biológica-Guía de Problemas 2019
5) En el proceso de germinación, iniciado por la imbibición de semillas secas, se produce una rápida e
importante captación de O2 (respiración). Diversos autores han estudiado este proceso oxidativo en
relación a los posibles mecanismos de obtención de energía y la capacidad de germinación en los
distintos tipos de semillas.
Los datos que se presentan a continuación (Plant Physiol. 79: 879-890) son parte de un estudio en el
que se emplearon semillas de diferentes especies, con el objeto de clasificarlas en cuanto a
requerimientos de O2 para que ocurra la germinación, tipo de sustrato y vía metabólica empleada en la
obtención de energía.
La imbibición de semillas se realizó en condiciones aeróbicas durante el tiempo necesario para alcanzar
la fase II de la germinación (fase I: caracterizada por un elevada de respiración; fase II: la velocidad de
respiración se estabiliza o aumenta muy lentamente con consumo de O2 prácticamente constante).
Los datos de la tabla I indican la cantidad de etanol y lactato cuantificados al final del período de
imbibición aeróbica. La velocidad de regeneración de ATP total corresponde a la suma del ATP
producido por fermentación y el ATP producido por respiración. ATP ferm corresponde a la velocidad de
regeneración de ATP por fermentación.
En primer lugar interprete cada uno de los datos aportados por tablas y figuras.
Posteriormente, indique justificando, para cada tipo de semilla:
a) Posibles mecanismos de obtención de energía durante la germinación.
b) Relación de estos mecanismos con el proceso de captación de O2.
c) Localización subcelular de las vías metabólicas involucradas.
d) Posible clasificación de las semillas en cuanto al requerimiento de O2 para que ocurra la
germinación.
e) Causa de la imposibilidad de germinación que presentan algunas semillas en anaerobiosis.
f) Sustancia de reserva (tipo de sustrato) que emplea cada semilla durante la germinación.
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Química Biológica-Guía de Problemas 2019
Tabla II: Velocidad de acumulación de lactato y etanol por semilla, en fase II de germinación y sometidas
a anoxia durante períodos de tiempo variables.
Tiempo de anoxia
Semilla 0-4 hs. 4-24 hs. 24-48 hs.
Lactato Etanol Lactato Etanol Lactato Etanol
(nmol/h.x semilla)
Arveja 5 2750 1 2400 1 3000
Arroz 5 52 1 72 1 102
Lechuga 1 3.5 0.1 2.7 0.1 2
Rabanito 15 21 3 6 1 2
Figura 1: Variación de la carga energética en semillas germinadas bajo anoxia durante la fase II de la germinación.
Las semillas germinadas se transfieren a anoxia una vez finalizado el período de imbibición aeróbica.
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Figura 4:A. Velocidad relativa de Transporte Fotosintético de electrones. B. Velocidad de fijación de CO2, a
distintas intensidades lumínicas recibidas en hojas de plantas de arroz normales (◆) y transgénicas NK2-1 ().
a) Explique cómo afecta al crecimiento de plantas normales y mutantes la duración del fotoperiodo.
b) Explique cuáles son los principales productos de fotosíntesis en ambas variedades en un
fotoperiodo de 12 hs.
c) Explique cuáles son los principales destinos de los productos de fotosíntesis en ambas
variedades en iluminación continua y correlaciónelo con la capacidad de fijación de CO2 y el
crecimiento.
d) Analice las diferentes enzimas estudiadas indicando su función en las correspondientes vías
metabólicas y sus niveles de actividad en ambas variedades.
e) Analice las diferencias de expresión de PGM y/o PGI correlacionando las mismas con las
alteraciones metabólicas observadas en TC7, diferenciando las isoenzimas detectadas.
Complete con su respuesta el análisis realizado en la pregunta d).
f) Proponga a nivel genético un modelo que explique las características del mutante TC7.
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1,5
Fresh Weight (g)
0,5
20 30 40 20 30 40 20 30
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Figura 6:
Isoenzimas PGM (fosfoglucomutasa) y PGI
(fosfoglucoisomerasa). Se realizó una
electroforesis en gel de almidón y posterior
tinción por actividad, en extractos de hoja
entera en mutante (líneas 1 y 4); planta
normal (líneas 2 y 5) y cloroplastos aislados
de planta normal (líneas 3 y 6).
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12 A 120 B WT
10 100 NS458
8
80
6 WT
4 60
NS458
2 40
0 20
-2 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Hora Hora
20 20
WT
Sacarosa (mg dm -2)
C D
15 NS458 15
10 10
5 5 WT
NS458
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Hora Hora
Figura 1: Cambios diurnos en la tasa de fotosíntesis neta y acumulación de almidón, sacarosa y hexosas en hojas
de plantas normales (WT) y mutantes NS458de N. sylvestris. Barras negras: oscuridad, barras blancas: luz.
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A. WT B. NS458
300 300
Expansión foliar (mm2/hoja)
150 150
100 100
50 50
0 0
1 2 3 4 1 2 3 4
Días Días
Figura 2: Expansión de lámina foliar de plantas normales (WT) y mutantes NS458 al final del período de luz y
oscuridad, a lo largo de 4 días consecutivos.
ARNm WT NS458
Sacarosa Sintasa
WT WT
NS458 NS458
PGM PGI
Figura 4: SDS-PAGE, transferencia e inmunodetección con anticuerpos contra la PGM y PGI de citosol y
cloroplasto extraídos de hojas de plantas normales (WT) y mutantes (NS458).
Tabla 1: Actividad de enzimas (mol/gPF.h) extraídas de hojas de plantas normales (WT) y mutantes (NS458).
ENZIMA WT NS458
PGI citosol 292 106 481 34
PGI cloroplasto 228 20 291 22
PGM citosol 643 83 509 31
PGM cloroplasto 219 58 2.9 0.1
Inv 125 12 205 18
SuSy 6.7 0.7 8 1.3
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En función de los días a partir del inicio de la germinación, se estudió la actividad de la enzima isocitrato
liasa (Figura 1A), el contenido de lípidos totales y carbohidratos solubles totales (Figura 1B), el contenido
de varios ácidos grasos saturados (Figura 2A), e insaturados (Figura 2B), y el contenido de glucosa,
fructosa y sacarosa (Figura 3), en los cotiledones de nabo.
a) ¿Qué vía metabólica está implicada en la movilización de reservas en los cotiledones de nabo
según la figura 1A?
b) Explique la disminución de lípidos a lo largo de la germinación. Indique todas las vías
metabólicas involucradas. Relacione su respuesta con los resultados de las figuras 1B, 2A, 2B y
con su respuesta a la pregunta a).
c) Analice a qué se debe la variación de glucosa y fructosa en cotiledones (figura 3). Indique de qué
fuente de carbono provendrían ambas.
d) Analice a qué se debe la variación de sacarosa (figura 3). ¿Cuál sería el destino del carbono de
la sacarosa? Considere en su respuesta la variación de carbohidratos solubles totales mostrada
en la figura 1B.
e) Proponga un esquema metabólico fisiológico de la movilización de reservas en cotiledones de
nabo, de acuerdo a todo lo analizado. Considere para su respuesta las variaciones en la masa de
lípidos totales más carbohidratos solubles totales por kg de cotiledón entre los días 1°, 3° y 7° de
la germinación.
f) Mencione el/los tipo/s de sustancia/s de reserva presentes en semilla de nabo.
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a) Analice el tipo de sustancia de reserva acumulada en semillas de B. napus y las diferencias entre
wild type y mutante, a los 25 días de desarrollo.
b) Evalúe las diferencias en los metabolitos intermediarios para ambas variedades a los 25 días de
desarrollo. Realice un esquema del flujo de carbono.
c) Analice las diferencias en actividades enzimáticas in vitro para ambas variedades a los 25 días
de desarrollo. Discuta la relación entre la actividad medida in vitro con la posible actividad in vivo
a partir de los datos de metabolitos intermediarios mostrados, y de las sustancias de reserva.
d) Analice a nivel genético las causas de la deficiencia metabólica presentada por la semilla de la
variedad mutante durante el desarrollo temprano. Proponga un mecanismo molecular que
explique los resultados hallados.
e) Analice las sustancias de reserva en semillas maduras de B. napus. En función de los resultados,
discuta la participación de las mismas en el desarrollo y/o en la germinación de las semillas de
esta especie.
f) Analice, si existe, la regulación de la expresión de AGPasa durante el desarrollo de semillas de
B. napus, indicando a qué nivel/es ocurre.
g) Idem para la ACCasa
h) Analice y determine en caso de existir, la influencia de la mutación estudiada sobre la regulación
de la expresión de ambas enzimas en el desarrollo de semillas de B. napus. Complete de ser
necesario los modelos propuestos para el desarrollo temprano.
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A 140 B
Almidón 800 Ácidos Grasos
120
100 Wild Type Wild Type
600
mol/g PF
mol/g PF
80 Mutante Mutante
60 400
40
200
20
0 0
25 días 55 días (SM) 25 días 55 días (SM)
días después de floración días después de floración
C 120 D
Glc-1P ATP Wild Type
Contenido (nmol/g PF)
100 200
ADP-Glc Mutante
80
nmol/g PF
150
60
40 100
20 50
0
0
Wild Type Mutante
25 días 55 días (SM)
Semillas 25 días días después de floración
E
Acetil-CoA
80
Wild Type
nmol/g PF
60 Mutante
Figura 1: Contenido endógeno de almidón (A),
ácidos grasos (B), Glucosa-1P (Glc-1P) y ADP-
40 Glucosa (ADP-Glc) (C), ATP (D), y acetil-CoA (E),
en semillas recolectadas en diferentes etapas de
su desarrollo.
20
0
25 días 55 días (SM)
días después de floración
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A 300 B
actividad AGPasa actividad ACCasa
250 150
Wild Type Wild Type
nmol/g PF.min
nmol/g PF.min
100 60
50 30
0 0
25 días 55 días (SM) 25 días 55 días (SM)
días después de floración días después de floración
niveles relativos
80 Wild Type 120 Mutante
Mutante
60 90
40 60
20
30
0
0
25 días 55 días (SM)
25 días 55 días (SM)
días después de floración
días después de floración
Figura 2: Niveles de actividad medida in vitro de AGPasa (A) y ACCasa (B), y de ARNm determinado
por Northern blot y autorradiodrafía para AGPasa (C) y ACCasa (D), en semillas wild type y mutantes
recolectadas en diferentes etapas de su desarrollo.
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