PETUNJUK PRAKTIKUM

KIMIA SEPARASI

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
2018
 PETUNJUK TEKNIS PELAKSANAAN PRAKTIKUM

1. Sistematika Laporan Resmi 2. Sistematika TA

- Identitas Laporan: meliputi - - Identitas laporan : meliputi

Judul, Nama, NIM. Judul, Nama, NIM.

- Dasar Teori (1) - - Tujuan
- Tujuan (0,5) - - Data Fisik
- Bahan, Alat, dan Metode (0,5) - - Diagram alir (metode)
- Hasil (1)
- Pembahasan (3) Persentase Praktikum :
- Kesimpulan (1,5) - Tugas awal : 5%
- Jawab Pertanyaan (2) - Laporan resmi : 10%
- Daftar Pustaka (0,5) - TK : 5%
- Lampiran - Aktivitas : 5%

: 25%

Pembagian Praktikum
Maserasi dengan Fraksinasi Bertingkat
Maserasi dengan Fraksinasi Tunggal
Sonikasi dengan Fraksinasi Bertingkat
Sonikasi dengan Fraksinasi Tunggal
Distilasi
 DISTILASI CAMPURAN (AZEOTROP)

Pengantar
Distilasi adalah suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan pada
perbedaan tingkat volalitas (kemudahan suatu zat untuk menguap) pada suhu dan
tekanan tertentu. Distilasi sangat baik digunakan untuk memisahkan bahan-bahan
alam yang berupa zat cair atau untuk memurnikan cairan yang mengandung
pengotor. Distilasi merupakan proses fisika dan tidak terjadi adanya reaksi kimia
selama proses berlangsung.
Dasar utama pemisahan dengan cara distilasi adalah perbedaan titik didih dari
masing-masing senyawa komponen penyusun campuran pada tekanan tetap. Proses
distilasi biasanya melibatkan suatu penguapan campuran dan diikuti dengan proses
pendinginan dan pengembunan.
Distilasi ada beberapa macam, salah satunya ialah distilasi azeotrop. Azeotrop
ialah campuran zat cair yang mempunyai titik didih tetap dengan komposisi
campuran yang tetap pula. Pada campuran azeotrop, kita tidak dapat memisahkan
campuran dengan sempurna menjadi dua komponen murni dengan fraksionasi
sederhana. Memisahkan campuran azeotrop (campuran dua atau lebih komponen
yang sulit dipisahkan) biasanya dalam prosesnya digunakan senyawa lain yang dapat
memecah ikatan azeotrop tersebut atau dengan tekanan tinggi.

Tujuan
1. Menentukan persentase yield distilat
2. Membandingkan hasil distilasi secara teori dengan hasil pengamatan

Alat dan Bahan

Alat: 1 set peralatan distilasi yang terdiri dari termometer, pemanas/bunsen,
waterbath, 2 buah kolf/erlenmeyer, pendingin balik/kondensor, steel head,
konektor, adaptor (jika diperlukan), selang, dan batu didih.
Bahan: campuran diklormetan : etanol (1 : 1 dan 3 : 1, v/v)
Langkah Kerja
1. Dirangkai alat distilasi seperti Gambar 1.

Gambar 1. Rangkaian Alat Distilasi

2. Ke dalam labu destilasi diisikan 40 mL campuran bahan kemudian
dimasukkan pula batu didih ke dalamnya. Selanjutnya labu destilasi kembali
dipasangkan pada rangkaian alat.
3. Dipastikan rangkaian alat dan aliran air telah terpasang dengan benar.
4. Panaskan bahan hingga mendidih dan pemanasan dihentikan jika distilat
sudah tidak menetes lagi.
5. Hitung %yield yang diperoleh.
Pengamatan
Campuran:……………………
Variabel Pengamatan Distilat 1 Distilat 2
Suhu ketika mulai mendidih (°C)
1. Sampel
2. Waterbath
Suhu saat distilat mulai menetes (°C)
1. Sampel
2. Waterbath
Volume distilat (mL)
%yield

Pertanyaan
1. Bagaimana cara memisahkan campuran azeotroph?
 EKSTRAKSI, PEMISAHAN, DAN IDENTIFIKASI KLOROFIL

Pengantar
Tumbuhan diekstrak dengan cara homogenasi dimana penggilingan dan
ekstraksi terjadi secara bersama-sama. Pigmen merupakan zat warna alami yang
terdapat pada organisme yang melakukan fotosintesis. Secara umum pigmen
fotosintesis dapat dikelompokkan ke dalam tiga kelompok besar: pigmen berwarna
hijau (klorofil), pigmen berwarna kuning sampai merah (karotenoid), dan pigmen
berwarna merah sampai ungu (antosianin).
Ekstraksi klorofil ialah proses pemisahan klorofil dari campurannya dengan
menggunakan pelarut. Pelarut yang digunakan harus memiliki kemampuan
melarutkan solut yang tinggi, selektif, dan mudah diuapkan. Metode ekstraksi yang
diterapkan pada percobaan ini ialah secara maserasi dengan pengadukan
menggunakan stirrer dan secara sonikasi menggunakan ultrasonikator.
Klorofil dan beberapa turunannya mengabsorbsi daerah biru sampai merah
dari spektrum visible, adalah hijau. Klorofil dan turunannya adalah fluorosen
sehingga dapat ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri. Oleh sebab itu,
analisis kandungan klorofil pada ekstrak klorofil yang diperoleh dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Selanjutnya komponen-komponen dari ekstrak pigmen dipisahkan secara
kromatografi menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), KLT Preparatif, dan
Kromatografi Kolom. Pemisahan dari dua atau lebih komponen-komponen campuran
dapat dilakukan dengan pengikatan suatu campuran pada kertas atau pada suatu
adsorben, seperti alumina atau silika. Kemudian pelarut murni ataupun pelarut-
pelarut campuran dilalui melalui kertas ataupun kolom. Ini menyebabkan komponen-
komponen dari campuran bergerak pada berbagai kecepatan melalui adsorben dan
komponen tersebut dapat terpisahkan.

Tujuan
1. Menentukan % rendemen ekstrak yang diperoleh secara maserasi/sonikasi
2. Menentukan kandungan klorofil a dan klorofil b dari ekstrak yang
diperoleh secara spektrofotometri
 3. Menentukan fase gerak yang tepat untuk pemisahan komponen klorofil
secara kromatografi lapis tipis
4. Menentukan nilai Rf dari masing-masing komponen senyawa
5. Menentukan pola pemisahan yang terjadi pada KLT Preparatif
kromatografi kolom
6. Menentukan jenis komponen penyusun klorofil yang terpisahkan dan
membandingkannya dengan KLT

Alat dan Bahan

Ekstraksi
Alat: neraca analitis, alumunium foil, gelas beaker, magnetic stirrer, ultrasonikator,
kertas saring, corong, corong pisah, gelas ukur, spektrofotometer, dan rotary
evaporator.
Bahan: sampel (daun singkong), aseton, metanol, dietil eter, saturasi garam dapur,
natrium sulfat

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Alat: plat KLT, pipa kapiler, chamber, kertas saring, pinset, pensil, penggaris, dan
pipet ukur
Bahan: ekstrak pigmen, aseton, heksan

KLT Preparatif
Alat: plat kaca KLT Preparatif, pengaduk, gelas beaker, pipa kapiler, chamber, kertas
saring, pinset, pensil, penggaris, dan pipet ukur
Bahan: ekstrak pigmen, aseton, heksan, silika gel 60, akuades

Kromatografi Kolom
Alat: kolom, statif, klem, pipet tetes, kapas, pengaduk, gelas beaker, plat KLT, pipa
kapiler, chamber, kertas saring, pinset, pensil, penggaris, pipet ukur,
spektrofotometer
Bahan: ekstrak pigmen, aseton, heksan, silika gel 60, akuades
Langkah Kerja
Ekstraksi
1. Ditimbang 2 gram sampel yang telah dipotong kecil-kecil.
2. Sampel diekstrak dengan pelarut aseton : metanol (7 : 3, v/v) selama 30 menit
menggunakan magnetic stirrer atau ultrasonikator. Ekstraksi dilakukan dalam
gelap (tertutup alumunium foil).
3. Ekstrak disaring dengan kertas saring kemudian ditentukan volumnya dengan
gelas ukur.
4. Ekstrak dituang ke dalam corong pisah dan ditambahkan dietil eter dengan
perbandingan 1 : 1 (v/v) terhadap ekstrak. Jika fraksinasi bertingkat, maka
dietil eter ditambahkan sebanyak dua kali (setelah langkah no 6) dengan total
volume tetap 1 : 1 (v/v) terhadap ekstrak.

Gambar 3. Proses Fraksinasi pada Corong Pisah

5. Dikocok perlahan dan diamati proses pemisahan pada corong pisah.
6. Ditambahkan saturasi garam dapur secara bertahap sampai terjadi pemisahan.
7. Dikeluarkan lapisan atas kemudian ditambahkan natrium sulfat.
8. Disaring dan digenapkan dengan dietil eter menjadi 50 atau 100 mL (jika
ekstrak yang diperoleh mendekati 50 mL maka digenapkan menjadi 50 mL,
jika lebih maka digenapkan menjadi 100 mL) pada labu ukur.
9. Diukur serapan pigmen pada panjang gelombang 470; 642,2; dan 660,6 nm
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Dietil eter digunakan sebagai
blanko.
10. Dihitung kandungan klorofil a, klorofil b, dan karotenoid total dengan rumus
di bawah ini.
Klorofil a = 10.05A660.6 – 0.97A642.2
 Klorofil b = 16.36A642.2 – 2.43A660.6

11. Ekstrak selanjutnya dikeringkan dengan rotary evaporator dan gas N2 jika
perlu.

Gambar 4. Proses Pemekatan Ekstrak dengan Rotary Evaporator

12. Ditimbang berat pigmen yang diperoleh.
13. Pigmen yang diperoleh disimpan dalam botol sampel yang tertutup
alumunium foil untuk digunakan analisis selanjutnya.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. Dibuat garis melintang pada KLT selebar 1 cm sebagai batas bawah dan batas
atas.
2. Dibuat spot pada plat KLT menggunakan pipa kapiler.
3. Disiapkan chamber berisi campuran pelarut aseton : heksan dengan
perbandingan tertentu (ketinggian pelarut ≤ 0,5 cm)
4. Diletakkan plat KLT pada chamber yang telah dijenuhkan dan chamber
ditutup rapat.
5. Diamati pergerakan pigmen yang terjadi dan disudahi pemisahan setelah
pelarut mencapai batas atas.
6. Dikeluarkan plat dari chamber dan ditandai jarak dan warna spot yang
muncul selama pemisahan.
7. Diukur nilai Rf dari masing-masing spot yang terbentuk.
 8. Diulang langkah-langkah diatas sampai diperoleh pemisahan yang baik
dengan variasi perbandingan pelarut. Campuran pelarut yang menghasilkan
pemisahan terbaik, digunakan sebagai pelarut untuk analisis-analisis
selanjutnya.

Gambar 5. Contoh KLT pada Berbagai Variasi Fase Gerak

KLT Preparatif
1. Dibuat KLT preparat (dilakukan 1 minggu sebelum praktikum dimulai)
dengan cara:
a. Dibersihkan kaca preparat dan dibilas menggunakan aseton.
b. Dibuat bubur silika dengan perbandingan 6 : 10 (b/v) dengan akuades.
c. Dituang silika ke atas permukaan kaca dan digoyangkan agar diperoleh
plat silika yang rata.
d. Dikeringkan KLT preparat dengan memasukkan ke dalam oven 100°C
selama 1 jam.
2. Disiapkan chamber yang diisi dengan fase gerak sesuai dengan KLT dan
sudah diberi kertas saring pada salah satu sisi dindingnya.
3. Sampel (ekstrak pigmen) ditotolkan membentuk garis horizontal pada
permukaan KLT preparat yang sudah diberi tanda garis setinggi 1 cm dari
permukaan bawah kaca.
4. KLT preparat dielusikan dalam chamber sesuai ukuran.
5. Elusi dihentikan ketika fase gerak telah mencapai batas atas (± 1 cm dari
permukaan kaca bagian atas).
 Gambar 6. Contoh Hasil Pemisahan KLT Preparatif
6. Diamati hasil KLT preparatif dan dibandingkan dengan hasil KLT.

Kromatografi Kolom
1. Ditimbang 4 gram silika gel 60 dan dilarutkan dalam pelarut (fase gerak)
sesuai hasil percobaan KLT.
2. Disiapkan kolom lengkap dengan kapas penyangga seperti pada gambar di
bawah ini.

Gambar 7. Rangkaian Alat Kromatografi Kolom

3. Dibasahi permukaan kolom dengan pelarut KLT.
4. Diisi kolom dengan silika melalui dinding kolom.
5. Dibiarkan kolom memadat dan terekuilibrasi.
6. Disisakan pelarut setinggi 1-2 mm dari permukaan kolom silika dan
diaplikasikan ekstrak pigmen sebanyak 1-2 pipet. Dibiarkan lapisan pigmen
masuk ke dalam gel.
7. Ditambahkan pelarut melalui dinding kolom (2 cm).
 8. Diamati proses pemisahan yang berlangsung dan dijaga agar kolom tidak
kering.
9. Digambar skematik pemisahan pigmen dalam kolom, warna pigmen, dan
posisinya.

Gambar 7. Contoh Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom

Pengamatan
Ekstraksi
Metode ekstraksi: ………………………
Variabel Pengamatan Hasil
Massa sampel (g)
Massa ekstrak pigmen (g)
% ekstrak
Absorbansi pada λ 470 nm
Absorbansi pada λ 642,2 nm
Absorbansi pada λ 660,6 nm
Kandungan (mg/L)
- Klorofil a
- Klorofil b
- Karotenoid total

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

 Variabel Pengamatan Hasil
Fase gerak yang tepat
Jumlah komponen yang terpisahkan
Nilai Rf
- Spot 1
- Spot 2
- Spot 3
- Dst

KLT Preparatif
Hasil pemisahan KLT Preparatif

Kromatografi Kolom
Variabel Pengamatan Hasil
Pola pemisahan pigmen
Jumlah fraksi yang diperoleh

Pertanyaan
1. Sebutkan (minimal 3) kelebihan dan kekurangan ekstraksi secara maserasi
dan ultrasonikasi!
2. Sebut dan jelaskan (minimal 3) faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf!
3. Bagaimana hasil pemisahan komponen-komponen ekstrak klorofil pada KLT
Preparatif dan Kromatografi Kolom? Apakah sesuai dengan pemisahan pada
KLT? Jelaskan!
4. Sebut dan jelaskan salah satu metode analisis dan/atau pemisahan klorofil
(meliputi prinsip metode dan langkah kerja) selain metode-metode yang telah
digunakan pada praktikum yaitu KLT, KLT Preparatif, Kromatografi Kolom,
dan Analisis secara Spektrofotometer!