Anda di halaman 1dari 21

BIAKAN MURNI

Apa yang dimaksud dengan Biakan Murni ?

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang
ditumbuhkan dalam medium buatan. Medium buatan tersebut berfungsi sebagai medium
pertumbuhan. Pada medium ini bakteri dapat tumbuh dan berkembangbiak. Bahan dasar yang
digunakan untuk medium pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk hasil yang lebih baik agar
bakteri tumbuh, alat dan bahan yang digunakan disterilkan terlebih dahulu.

Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan


mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Persyaratan utama bagi isolasi dan pembuatan biakan murni adalah harus adanya kondisi
optimum untuk petumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteri paling baik dan paling
utama adalah dari inang. Sebagai contoh bakteri E. Coli yang dijumpai didalam pencernaan
dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang.

Isolasi adalah cara untuk mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam


dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari
mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah
dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu
macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis
mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini
dapat dilakukan dengan menumbuhkan dalam media padat, karena dalam media padat sel-sel
mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996).

Cara-cara Isolasi Bakteri

1. Isolasi Pada Agar Cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan


mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme
lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi
berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan,
yaitu: metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang.

2. Isolasi Pada Medium Cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.

3. Isolasi Sel Tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme


berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel
tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun
micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

Metode Pembuatan Biakan Murni Pada Cawan Petri

1. Metode Cawan Gores

Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari
koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi
3 - 4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3 -
4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen
setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goreskan sebelumnya pada sisi cawan
kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Metode cawan gores
yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme
yang diinginkan.Ada beberapa cara menggores yang biasa digunakan dalam cara
penggoresan, yaitu:

- Goresan T - Goresan radian

- Goresan kuadran - Goresan Sinambung

2. Metode Cawan Tuang

Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah
dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba
di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu
dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan-cawan tersebut
mengandung koloni-koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode
ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu
tinggi. Proses pemisahan atau pemurniaan dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena
semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme
memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja

3. Teknik Dilusi (Pengenceran)

Tujuan dari teknik ini adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya kedalam air, sehingga lebih mudah penanganannya. Sampel yang telah diambil
kemudian disuspensikan dalam aquades steril. Teknik dilusi sangat penting dalam analisa
mikrobiologi. Karena hampir semua metode penelitian dari penghitungan jumlah sel mikroba
menggunakan teknik ini, seperti: TPC (Total Plate Counter)(Aini, 2010).

Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara yaitu:

1. Cara Penggoresan
2. Penuangan

3. Pengenceran

4. Penyebaran (Agar Sebar)

Inokulasi Bakteri Escherichia coli

Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptik ke dalam media steril baik
pada media padat maupun media cair. Inokula adalah bahan yang mengandung mikroba baik
dalam keadaan cair maupun padat. Tujuan inokulasi adalah untuk memurnikan,
mengidentifikasi, meremajakan, dan menyimpan mikroba. Biakan murni dilakukan untuk
keperluan diagnostik, karakterisasi mikroorganisme, industri farmasi dan kegiatan lain yang
berkaitan dengan mikroorganisme. Nutrisi dan lingkungan yang menunjang pertumbuhan
mikroorganisme serta suatu teknik kerja aseptis yang dapat mencegah adanya kontaminan
dalam biakan diperlukan untuk mendapatkan kultur yang murni.

Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies
utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich
ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada manusia seperti diare,
muntaber, dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi
rekayasa genetika, biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang
diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan
mudah dalam penanganannya.

B. Prosedur Kerja
Pembuatan plat agar, agar miring, agar tegak, dan media cair dalam tabung :
– Bunsen dinyalakan, nyala api diatur hingga berwarna biru. Dibiarkan menyala selama
10 menit.
– Tabung reaksi steril disiapkan dan diletakkan pada rak tabung reaksi.
– Cawan steril diletakkan diantara dua api Bunsen.

• Pembuatan Plat Agar


– 20 ml media cair nutrien agar 50 ℃ dipipet.
– Dimasukkan cawan petri steril.
– Dibiarkan memadat.

• Pembuatan Agar Miring


– 5 ml media cair nutrien agar 50 ℃ dipipet.
– Tabung reaksi steril, diletakkan miring pada papan miring.
– Dibiarkan memadat.

• Pembuatan Agar Tegak


– 10 ml media cair nutrien agar 50 ℃ dipipet.
– Tabung reaksi steril, diletakkan tegak pada rak tabung.
– Dibiarkan memadat.
• Pembuatan Media Cair dalam Tabung
– 10 ml media nutrien broth bersuhu kamar dipipet
– Tabung reaksi steril

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Gastroenteritis adalah kondisi medis yang ditandai dengan peradangan ("-


itis") pada saluran pencernaan yang melibatkan lambung ("gastro"-) dan usus kecil
("entero"-), sehingga mengakibatkan kombinasi diare, muntah dan sakit serta kejang
perut Gastroenteritis juga sering disebut sebagai gastro, stomach bug, dan stomach
virus. Walaupun tidak berkaitan dengan influenza penyakit ini juga sering disebut flu
perut dan flu lambung.

Secara global, sebagian besar kasus pada anak-anak disebabkan oleh rotavirus
Pada orang dewasa, norovirus dan Campylobacter menjadi penyebab yang lebih
umum. Penyebab lain yang lebih jarang ditemukan yakni bakteri lain (atau racun
bakteri) dan parasit. Penularannya bisa terjadi karena konsumsi makanan yang
dimasak secara tidak benar atau air yang terkontaminasi atau melalui persinggungan
langsung dengan orang yang terinfeksi yang paling utama dalam penanganan penyakit
ini adalah hidrasi yang cukup. Untuk kasus ringan atau sedang, ini bisa dilakukan
melalui pemberian larutan rehidrasi oral Untuk kasus yang lebih berat, pemberian
cairan melalui infus mungkin diperlukan. Gastroenteritis paling banyak terjadi pada
anak-anak dan masyarakat di negara berkembang.

Di negara maju Campylobacter jejuni menjadi penyebab utama gastroenteritis


bakteri, dimana separuh dari kasus ini terkait dengan pajanan terhadap unggas Pada
anak-anak, bakteri merupakan penyebab dari sekira 15% kasus, dengan jenis yang
paling umum meliputi spesies Escherichia coli, Salmonella,Shigella, dan
Campylobacter. Bila makanan terkontaminasi dengan bakteri dan berada pada suhu
ruangan selama beberapa jam, bakteri berkembang biak dan meningkatkan risiko
infeksi pada orang-orang yang mengonsumsi makanan tersebut. Beberapa makanan
yang umum dikaitkan dengan penyakit ini yakni daging mentah atau daging yang
kurang matang, ayam, makanan laut, dan telur; kecambah mentah; susu yang belum
dipasteurisasi dan keju lunak; serta jus jeruk dan sayuran Di negara berkembang,
khususnya Afrika subwilayah Sahara dan Asia, kolera adalah penyebab umum
gastroenteritis. Infeksi ini biasanya ditularkan melalui air atau makanan yang
terkontaminasi

Clostridium difficile toksigenik adalah penyebab utama diare yang lebih sering
terjadi pada manusia berusia lanjut. Bayi dapat menjadi pembawa bakteri ini namun
tidak berlanjut ke arah munculnya gejala. Ini adalah penyebab diare yang umum pada
mereka yang dirawat inap dan sering dikaitkan dengan penggunaan antibiotik. Diare
infeksi Staphylococcus aureus juga mungkin terjadi pada mereka yang menggunakan
antibiotik."Traveler’s diarrhea" biasanya merupakan jenis gastroenteritis bakteri. Obat
penekan asam tampaknya meningkatkan risiko infeksi secara signifikan setelah
terpajan sejumlah organisme, termasuk spesies Clostridium difficile, Salmonella, dan
Campylobacter. Risiko ini lebih tinggi bagi mereka yang menggunakan penghambat
pompa proton dibandingkan dengan mereka yang menggunakan antagonis H

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pendahuluan
Mikrobiologi ialah telah mengenai organisme hidup yang berukuran
mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme : bakteri,
protozoa, virus, serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam bidang mikrobiologi
kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini (juga dinamakan
mikrobe atau protista); dimana ciri-cirinya, kekerabatan antara sesamanya seperti juga
dengan kelompok organisme lainnya, pengendaliannya, dan peranannya dalam
kesehatan serta kesejahteraan kita.Bakteri adalah salah satu golongan organisme
prokariotik ( tidak mempunyai selubung inti ) bakteri sebagai makhlu hidup tentu
memiliki informasi genetic berupa DNA,tapi tidak terlokaloisasi dalam tempat khusus
( Nukleus ) dan tidak ada membrane inti.
Salmonella sp termasuk dalam familyEnterobacteriacea yaitu bakteri patogen
bagi manusia dan hewan. Infeksi Salmonella sp terjadi pada saluran cerna dan
terkadang menyebar lewat peredaran darah ke seluruh organ tubuh.
Infeksi Salmonella sp pada manusia bervariasi, yaitu dapat berupa infeksi yang dapat
sembuh sendiri (gastroenteritis) , tetapi dapat juga menjadi kasus yang serius apabila
terjadi penyebaran sistemik ( demam enterik ).
B. Klasifikasi Salmonella sp
Adapun Taksonomi dari bakteri Salmonella sp. yaitu
Phylum : Bacteria (Eubacteria)
Class : Prateobacteria
Ordo : Eubacteriales
Family : Enterobacteriae
Genus : Salmonella
Spesies : Salmonella sp.

C. Morfologi Salmonella sp
Salmonella sp adalah jenis Gram negatif, berbentuk batang, tidak membentuk
spora, motil (bergerak dengan flagel peritrik) serta mempunyai tipe metabolisme yang
bersifat fakultatif anaerob.Termasuk kelompok bakteri Enterobacteriacea. Ukurannya
2 - 4 mikrometer x 0,5 – 0,8 mikrometer. Sifat Salmonella antara lain : dapat
bergerak, tumbuh pada suasana aerob dan anerob fakultatif, memberikan hasil positif
pada reaksi fermentasi manitol dan sorbitol dan memberikan hasil negatif pada reaksi
indol, DNAse , fenilalanin deaminase, urease, voges proskauer, dan reaksi fermentasi
sukrosa dan laktosa.
Perkembangan bakteri Salmonella sp terbilang sangat cepat dan menakjubkan,
setiap selnya mampu membelah diri setiap 20 menit sekali pada suhu hangat dan pada
media tumbuh yang mengandung protein tinggi. Bisa dibayangkan, satu sel bakteri
bisa berkembang menjadi 90.000 hanya dalam waktu 6 jam.
Bakteri ini tersebar luas di dalam tubuh hewan, terutama unggas dan babi.
Lingkungan yang menjadi sumber organisme ini antara lain air, tanah, serangga,
permukaan pabrik, permukaan dapur, kotoran hewan, daging mentah, daging unggas
mentah, dan makanan laut mentah. Salmonella typhi merupakan bakteri yang
menginfeksi manusia dan menyebabkan demam typhoid dan Salmonella paratyphi
yang menyebabakan demam paratyhoid
Salmonella sp sebenarnya selalu masuk melalui mulut, biasanya dengan
makanan dan minuman yang terkontaminasi Salmonella sp. Sebagian kuman mati
oleh asam lambung tetapi yang lolos masuk ke usus halus dan berkembang biak di
illeum. Disini terjadi fagositosis oleh sel kelenjar getah bening yang kemudian
menyebar ke aliran darah, kelenjar getah bening dan ke usus.
Dosis infektif bagi manusia adalah 105-108 Salmonella sp. Diantara faktor-
faktor tuan rumah yang menyebabkan resisten terhadap infeksi Salmonella sp adalah
keasaman lambung, jasad renik flora normal usus, dan daya tahan usus setempat. Dua
tipe Salmonella sp. yaitu S. enteriditis dan S. typhimurium merupakan penyebab kira-
kira setengah dari seluruh infeksi pada manusia.

D. Patogenesis (Perjalanan penyakit)


Bakteri salmonella adalah di dalam alat pencernaan manusia, hewan, dan
bangsa burung. Oleh karena itu cara penularannya adalah melalui mulut karena
makan/minum bahan yang tercemar oleh keluaran alat pencernaan penderita.
Salmonella akan berkambang biak di dalam alat pencernaan penderita, sehingga
terjadi radang usus (enteritis). Radang usus serta penghancuran lamina propria alat
pencernaan oleh penyususpan (proliferasi) salmonella inilah yang menimbulkan diare,
karena salmonella menghasilkan racun yang disebut cytotoxin dan enterotoxin.
Salmonella mungkin terdapat pada makanan dalam jumlah tinggi, tetapi tidak selalu
menimbulkan perubahan-perubahan dalam hal warna, bau maupun rasa dari makanan
tersebut.

E. Penyebab
Salmonella. Terdapat 2200 jenis Salmonella, termasuk jenis yang
menyebabkan demam tifoid. Setiap jenis bisa menyebabkan gangguan pencernaan,
demam enterik dan infeksi tertentu yang terlokalisir.
Salmonella banyak ditemukan pada daging yang terinfeksi, unggas, susu
mentah, telur dan hasil olahan telur. Salmonella juga bisa ditemukan pada binatang
melata yang dipelihara, pewarna merah tua atau marijuana yang terkontaminasi.

F. Gejala
Infeksi Salmonella bisa menyebabkan gangguan saluran pencernaan atau
demam enterik; kadang-kadang infeksinya hanya mengenai suatu bagian tertentu.
Beberapa orang yang terinfeksi bisa tidak memiliki gejala, tetapi mereka berperan
sebagai karier (pembawa) dari bakteri ini.
Gangguan saluran pencernaan biasanya mulai timbul dalam waktu 12-48 jam
setelah terinfeksi bakteri Salmonella. Gejala awalnya adalah mual dan nyeri perut
kram yang segera diikuti oleh diare, demam, dan terkadang muntah. Biasanya diare
sangat encer, tetapi kadang bisa berupa tinja setengah padat. Gangguan ini biasanya
bersifat ringan dan berlangsung 1-4 hari, tetapi bisa berlangsung lebih lama lagi.
Diagnosis diperkuat dengan membiakkan bakteri pada contoh tinja atau apusan
rektum penderita.
Demam enterik terjadi jika Salmonella masuk ke dalam darah. Demam
menyebabkan kelelahan yang luar biasa. Bakteri bisa hidup dan berkembangbiak di
dalam saluran pencernaan, pembuluh darah, katup jantung, selaput otak dan sumsum
tulang belakang, paru-paru, persendian, tulang saluran kemih, otot atau organ lainnya.
Kadang-kadang bakteri menginfeksi tumor, sehingga terbentuk suatu abses yang
selanjutnya bisa menyebabkan infeksi darah.
Seorang karier (pembawa) tidak menunjukkan gejala-gejala tetapi akan terus
mengeluarkan bakteri dalam tinjanya. Kurang dari 1% penderita yang kemudian
menjadi pembawa bakteri selama setahun atau lebih.

G. Diagnosa Laboratorium
Diagnosis ditegakkan berdasarkan gejala-gejalanya dan diperkuat dengan
ditemukannya bakteri pada biakan yang diambil dari contoh tinja atau apusan dubur
penderita.
1. Spesimen
Darah untuk biakan harus diambil berulang kali. Pada demam enteric dan septi
kimia, biakan darah sering positif dalam minggu pertama penyakit. Biakan
sumsum tulang dapat bermanfaat. Biakan urine dapat positif dalam minggu kedua.
Specimen feses juga harus diambil berulang-ulang. Pada demem enteric, feses
akan memberikan hasil positif mulai minggu kedua atau ketiga, pada entero colitis
selama minggu pertama. Biakan positif dari drainase duodenum menunjukkan
adanya salmonella di traktus billiard pada orang carrier.

2. Metode bakteriologi untuk isolasi Salmonella


Biakan pada medium diferensial: Medium EMB, Mac Conkey atau
deoksikolat memungkinkan deteksi cepat organisme yang tidak memfermentasi
laktosa. Organisme Gram positif sedikit dihambat. Medium Bismuth sulfit
memungkinkan deteksi cepat Salmonella yang membentuk koloni hitam karena
produksi H2S.
Biakan pada medium selektif: bahan ditanam pada lempeng agar SS
(Salmonella-Shigella). Agar Hektoen atau agar deoksikolat sitrat, merupakan
tempat Salmonella dan Shigella akan tumbuh subur, melebihi organism
Enterobacteriaceae lainnya.
Biakan pada medium diperkaya: bahan (biasanyatinja) diletakkan kedalam
kaldu selenit F atau kaldu tetrationat, keduanya menghambat bakteri usus normal
dan memungkinkan perkembangbiakan Salmonella. Setelah pengeraman selama
1-2 hari, biakan ini ditanami pada perbenihan diferensial dan selektif.
Identifikasi Akhir: koloni pada perbenihan padat yang dicurigai diidentifikasi
dengan tes biokimia dan tes aglutinasi dengan serum spesifik.

3. MetodeSerologi
Teknik serologi digunakan untuk mengidentifikasi biakan yang tidak diketahui
dengan serum yang diketahui, dan dapat juga dipergunakan untuk menentukan
titer antibody pada penderita yang tidak diketahui penyakitnya, meskipun yang
belakangan ini tidak begitu bermanfaat dalam diagnosis infeksi Salmonella.
Tes aglutinasi mikroskopik cepat: dalam tes ini, serum yang diketahui
dicampur dengan biakan yang tidak diketahui pada kaca objek. Penggumpalan,
bila ini terjadi dapat dilihat dalam beberapa menit.Tes ini khususnya bermanfaat
untuk identifikasi pendahuluan biakan secara cepat.
Tes aglutinasi pengenceran tabung (teswidal): Aglutinin serum meningkat
dengan cepat selama minggu kedua dan ketiga pada infeksi Salmonella. Sekurang-
kurangnya diperlukan dua bahan serum, yang diperoleh dengan selang waktu 7-10
hari untuk membuktikan adanya kenaikan titer antibody. Serum yang tidak
dikenal diencerkan berturut-turut (dua kali lipat) lalu dites terhadap antigen
Salmonella. Hasilnya ditafsirkan sebagai berikut :
a. Titer O yang tinggi atau kenaikan titer O (≥ 1:160) menunjukkan adanya
infeksi aktif.
b. Titer H yang tinggi (≥ 1:160) menunjukkan bahwa penderita itu pernah
divaksinasi atau pernah terinfeksi.
c. Titer Vi yang tinggi terdapat pada beberapa pembawa bakteri.

Hasil tes serologic untuk penderita Salmonella harus diinterprestasikan secara


hati-hati. Kemungkinan adanya antibody reaksi silang membatasi penggunaan
serologi dalam diagnosis infeksi Salmonella.

H. Pengobatan
Gangguan saluran pencernaan diiobati dengan cairan dan makanan lunak.
Antibiotik akan memperpanjang pengeluaran bakteri dalam tinja sehingga tidak
dianjurkan diberikan kepada orang-orang yang memiliki keluhan saluran pencernaan.
Tetapi bayi, pegawai rumah sakit, dan penderita infeksi HIV diobati dengan antibiotik
karena mereka memiliki resiko tinggi untuk terjadinya komplikasi.
Pada pembawa bakteri yang tidak menunjukkan gejala, infeksi biasanya bisa
diatasi sendiri dan jarang diperlukan antibiotik.
Jika diperlukan antibiotik, yang efektif adalah ampisilin, amoksisilin atau
siprofloksasin. Antibiotik diberikan selama 3-5 hari, tetapi penderita nfeksi HIV
memerlukan pengobatan yang lebih lama untuk mencegah terjadinya kekambuhan.
Seseorang yang memiliki bakteri Salmonella di dalam darahnya harus
mendapatkan antibiotik selama 4-6 minggu. Abses diobati melalui pembedahan
drainase (pengeringan, pengeluaran nanah) dan pemberian antibiotik selama 4
minggu. Antibiotik jangka panjang dan pembedahan biasanya perlu diberikan kepada
penderita infeksi pembuluh darah atau katup jantung.

I. Cara Isolasi dan Identifikasi


1. Isolasi
Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari
tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai specimen dan menumbuhkan
dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkunganinvitro). Ketika bakteri
tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa
mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri
sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya. Keberhasilan
pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan
lingkungan yang dibutuhkan oleh bakteri pathogen tersebut. Karena pada
lingkungan in vivo bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolic dan jalur
fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian
secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di
laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi
yang dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri.

Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menuru tjenisnya,


tetapi terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan
bakteri pathogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat
diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu
cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni
yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.
2. Inkubasi

Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi:

a. Inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-


37⁰C) dan kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%
b. Untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan
inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium
bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan
menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternative dapat juga dilakukan
inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%.

3. Identifikasi
a. Hari I
1. Siapkan alat dan bahan yang di gunakan
2. Setelah ose di sterilkan ambillah biakan bakteri
3. Kemudian masukkan kedalam media BHIB
4. Di lakukan pewarnaan gram
5. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x
di atas api Bunsen.
6. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin),
biarkan selama 2- 3 menit.
7. Cuci dengan air mengalir
8. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan
selama kira-kira 1-2 menit.
9. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai
warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur
lagi).tunggu 20 – 40 detik
10. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup
(counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.
11. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan
mikroskop
12. Kemudian masukkan ke dalam inkubator pada media BHIBdan inkubasi
selama 24 Jam dengan suhu 37 °c
b. Hari II
1. Biakan yang tumbuh pada media BHIB di waranai dengan pada
pengecetan gram.
2. Selain itu biakan juga di Tanami pada media BAP, Macconcey.
EMBA.dan endo agar.
3. Media yang telah di Tanami kemudian di inkubasi pada suhu 37°C selama
24 jam didalam incubator.

c. Hari III
Pewarnaan gram
1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x
di atas api Bunsen.
2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin),
biarkan selama 2- 3 menit.
3. Cucidengan air mengalir
4. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan
selama kira-kira 1-2 menit.
5. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai
warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur
lagi).tunggu 20 – 40 detik.
6. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup
(counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.
7. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan
mikroskop

Media TSIA
Setelah di sterilkan ambil bakteri pada media ( emba ) dan tusukkan \pada
media TSIA setelah di tusuk goreskan pada permukaan media dari bawah
keatas fiksasi pada mulut tabung dan tutup dengan kapas steril dan inkubasi
selama 24 Jam dengan suhu 37 °c

d. Hari IV
1. Dilakukan pembacaan pada media SCA, SIM, MrVP, dan gula-gula.
2. Hasil pembacaan di catat kemudian dicocokkan dengan table identifikasi
bakteri.

C. Tes Uji biokimia


 Buatlah suspense bakteri dari coloni bakteri yang sebelumnya telah di tanam pada
media EMBA yang di ambil adalah coloni yang menunjukkan cirri koloni bakteri
proteus
 Ambil satu matanal suspense bakteri dan tanam pada tiap media dengan cara:
1. Media SCA
 Goreskan perlahan secara zig-zag matanal (yang sudah suspensinya) dari
bagian dalam permukaan media miring sampai keluar.
 Sterilkan pada mulut tabung dan tutup dengan menggunakan kapas steril
Pada media SCA, tidak perlu di tusuk dengan nal.
 Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c
2. Media SIM
 Tusukkan nal yang sudah suspense bakterinya ketengah-tengah media agar,
jangan sampai menyentuh permukaan tabung/mendekati.
 Tutup dengan kapas steril yang sebelumnya sudah di fiksasi pada mulut
media
 Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c
3. Media MR-VP dangula-gula ( laktosa, maltosa, glukosa, sukrosa, manitol )
 Ambil satu ose suspense bakteri, masukkan dalam media cair, aduk-aduk
agar suspense bakteri dan agarnya tercampur yang di dalamnya ada tabung
durham.
 Tutup kembali dengan kapas steril.
 Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c
4. Media Urea
 Goreskan perlahan secara zig-zag matanal (yang sudah suspensinya) dari
bagian dalam permukaan media miring sampai keluar.
 Sterilkan pada mulut tabung dan tutup dengan menggunakan kapas steril.
 Pada media Urea, tidak perlu di tusuk dengan nal.
 Inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c.
Morfologi Bakteri Corynebacterium diptheriae
Merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang, panjang atau pendek, besar atau
kecil, polymorph, tidak berspora, tidak berkapsul, tidak bergerak, bergranula yang terletak di
salah satu atau kedua ujung badan bacteri. Pada pewarnaan menurut Neisser, tubuh bakteri
berwarna kuning atau coklat muda sedangkan granulanya berwarna biru violet ( meta
chromatis ). Preparat yang dibuat langsung dari specimen yang baru diambil dari pasien,
letaknya bakteri seperti huruf – huruf L, V, W, atau tangan yang jarinya terbuka atau sering
di kenal sebagain susunan sejajar,paralel , palisade atau sudut tajam huruf V, L, Y.

Diameter 0,5 – 1 µm dan panjangnya 1 – 8 µm, menggembung pada satu ujungnya


berbentuk ganda “club shape”, berisi granula metakromatik. Babas berisi granula
metakromatik , babes-ernest dengan pewarnaan neisser / metilen blue loeffler, tidak punya
spora, non motil basil, Gram positif , pleiomorfik, tidak tahan asam. Dinding sel mengandung
asam meso diaminopimelik, arabinosa, galaktosa, asam mikolik.

. Isolasi dan identifikasi Corynebacterium diptheriae


1. Tujuan : Melakukan isolasi dan identifikasi bakteri penyebab infeksi saluran
pernapasan bagian atas pada penderita dan pada carier.
2. Peralatan : Inkubator, kaca objek, kaca penutup, lampu spiritus, mikroskop,
sengkelit, sungkup lilin.
3. Media & Reagen :
 Agar darah
 Agar Loeffler
 Agar Tellurite Agar Darah
 Pewarnaan Gran
 Pewarnaan Neisser
 Pewarnaan Albert
4. Prosedur Pemeriksaan

Hapus tenggorokan, hapus hidung atau dari tempat lain yng mencurigakan Identifikasi
berdasarkan atas :

1. Pemeriksaan mikroskopik

2. Pembiakan

3. Uji biokimia

4. Uji virulensi
5. Pemeriksaan Mikroskopis dengan pewarnaan gram dan neisser
a. Cara Neisser.

Pada pewarnaan ini diperlukan 3 macam larutan pulas yang masing-masing lazimnya disebut
: Neisser A, Neisser B dan Neisser C. Ketiga larutan pulas ini disimpan dalam botol yang
tersendiri.

Larutan Neisser A :

Susunan :

Methylen biru : 1 gram.

Alkohol 70% : 20 ml.

Asam acetat glaciale : 50 ml.

Aquadest : 95 ml.

Larutan Neisser B

Susunan :

Gentian violet : 1 gram.

Alkohol absolut : 10 ml.

Aquadest : 300 ml.

Pemakaian :

2 bagian larutan Neisser A + 1 bagian larutan Neisser B.

Campuran ini dibuat mendadak dan disebut juga Neisser I.

Larutan Neisser C (Neisser II).

Susunan :

Chrysoidin : 1 gram

Alkohol panas : 300 ml.

Atau

Bismark brown : 1 gram.

Aquadest panas : 500 ml.

6. Cara pewarnaan :
1. Sediaan yang direkatkan digenangi dengan larutan Neisser I selama kira-kira 20 detik.
2. Sediaan dicuci pada pancuran air kran pelan-pelan.
3. Bubuhi larutan Neisser II selama 30 detik.
4. Larutan pulas pada objek gelas dibuang saja tanpa dicuci dengan air, kemudian preparat
dikeringkan dengan kertas saring.
5. Periksa dengan mikroskop, hasil pewarnaan:
6. Badan bakteri (seperti batang) : cokelat-muda.
7. Granula pada kedua ujungnya : biru-hitam.

b. Cara Albert.

Diperlukan 2 macam larutan pulas.

Larutan I.

Susunan :

Toluidin biru : 0,15 gram.

Malachit hijau (Methyl hijau) : 0,20 gram.

Asam asetat glacial : 1 ml.

Alkohol 95% : 2 ml.

Aquadest : 100 ml.

Zat warna dilarutkan dulu dalam alkohol, kemudian tambah air dan akhirnya asam asetat
glacial. Biarkan 24 jam, saring dan baru dapat dipakai.

Larutan II.

Susunan :

Jodium : 2 gram.

Kalium Jodida : 3 gram.

Aquadest : 300 ml.

(Pada modifikasi Jensen, larutan II ini diganti dengan susunan larutan sbb : Jod 1 gram + KJ
2 gram dan aquadest 100 ml). Simpan dalam botol yang sawo matang.

Cara pewarnaan :
1. Buat sediaan dan sesudah direkatkan, bubuhi dengan larutan I, biarkan kira-kira 3-5
menit.
2. Cuci dengan air kran, kemudian dibubuhi dengan larutan II, biarkan kira-kira 1 menit.
3. Larutan pulas pada objek gelas dibuang, keringkan dengan kertas saring.
4. Periksa dengan mikroskop dan hasil pewarnaan:
 Bakteri (seperti batang) : hijau.
 Granula atau kutubnya : hitam kebiru-biruan.

7. Pemeriksaan Biakan
Dengan menggunakan Media antara ain : Media Loeffler Agar, agar tellurite, agar
darah, gula-gula, tellurite cair, Blood Tellurite Agar.

1. Loeffler : gunanya untuk menyuburkan bakteri sehingga bila dibuat preparatakan tampak
granula yang jelas.
2. Blood Tellurite Agar : Media selektif differensial.
3. Agar tellurit : gunanya untuk isolasi koloni-koloni Corynebacterium diphtheriae yang
selanjutnya ditanam pada gula-gula untuk difteri.
4. Telurit cair : berguna sebagai media pengaya.
5. Agar darah : gunanya untuk membiak kuman-kuman lainnya seperti Streptococcus
haemolyticus dan Staphylococcus aerus
6. Gula-gula untuk difteri : glukosa serum dan sakarosa serum untuk membedakan C.
diptheri dengan kuman sejenis

Adapun proses pemeriksaan bakterinya adalah sebagai berikut :

1. Inokulasi

a) Dari media Transport maupun secara langsung specimen ditanam pada :

a. Agar darah untuk isolasi Corynebacterium diptheriae

b. Agar Loeffler untuk isolasi Corynebacterium diptheriae

c. Tellurite Blood Agar untuk isolasi Corynebacterium diptheriae

b) Inkubasi

Agar darah pada suhu 35 – 370C dalam sungkup lilin selama 24 – 48 jam.

Agar Cysttin Tellurite dan Agar Loeffler pada suhu 35 – 370C selama 24 – 48 jam
c) Amati Pertumbuhan koloni pada media isolasi : Koloni yang tumbuh dilakukan
pewarnaan Neisser, bila dijumpai adanya granula dilanjutkan dengan uji identifikasi tes
biokimia dan tes virulensi.

8. Tes biokimia
Koloni tersangka yang berwarna abu-abu hitam pada agar telurit ditanam pada glukosa
serum dan sakarosa serum (atau bisa pula ditambahkan amylum), kemudian dieram pad suhu
370C selama 1 malam. Hasil pengamatan adalah sebagai berikut :

Glukosa Sakarosa Amylum

C. diphteriae + – +/-

C. Xerosis +++

C. hofmanii –--

9. Tes virulensi
Tes ini digunakan untuk mengetahui bakteri Corynobacterium diptheriae yang diisolasi
adalah virulen arena menghasilkan eksotoksin, yang dilakukan dengan dua cara, yakni :

In vivo : Intrakutan dan tes subkutan dengan menggunakan hewan percobaan yaitu
Guinea Pig

In vitro : Tes elek-Ouchterlony (gel difusi gel dari elek)

Caranya pada medium gel yang mengandung serum, sebelum mengeras diletakan 1
strip kertas yang telah dijenuhi dengan antitoksin pada tengah-tengah medium dan ditekan
perlahan ke bawah permukaan dengan pingset steril.Kemudian medium dibiarkan
mengeras.Setelah itu biakan dari bakteri difteri yang dicurigai digoreskan menyilang dengan
tegak lurus pada strip kertas.Perlu juga digoreskan biakan bakteri sebagai control positif
maupun negative.Setelah diinkubasi pada suhu 370C seama 24 – 48 jam, dilihat ada tidaknya
garis presipitasi yang terjadi pada bakteri tes.

10. Pembacaan dan Interpretasi hasil


Pemeriksaan Mikroskopis dengan pewarnaan Gram

Gram Positif Batang, Panjang Pendek, Besar Kecil, polymorph, tidak berspora, tidak
berkapsul, ada pool korrel pada salah satu atau kedua ujungnya.

Biakan

Koloni tersangka yang tumbuh pada media sebagai berikut :


1. Blood Agar Plate : Koloni kecil-kecil,putih keruh,smooth, cembung,haemolytis atau
anhaemolytis
2. Tellurite blood agar : Koloni kecil-kecil,abu-abu tengahnya hitam,hitam kelabu atau
hitam seluruhnya,mengkilat,smooth,cembung
3. Loeffler Serum : Koloni subur, smooth,putih cream, sedikit cembung

C. Pasca analitik

Melakukan sterilisasi terhadap berbagai alat-alat yang telah digunakan agar dapat steril
dan tidak mengkontaminasi benda-benda yang lain dengan dimasukan ke dalam autoklaf

Terhadap Media atau bahan-bahan hasil pemeriksaan yang infeksius dilakukan


pemusnahan dengan pembakaran panas tinggi , dengan menggunakan incinerator.

Mencuci tangan dengan sabun setelah memeriksa agar steril dari zat-zat yang infeksius

SKEMA PEMERIKSAAN ISOLASI DAN IDENTIFIKASI

HARI 1 :

 Spesimen ditanam pada Blood agar plate dan Tellurite Blood agar plate
 Masuk incubator 370C selama 24 jam

HARI 2 :

Koloni yang tersangka Corynobacterium diptheriae dibuat 2 preparat :

1. Satu dicat Gram : untuk melihat adanya Gram (+) batang


2. Satu dicat Neisser atau Albert’s Stain : untuk melihat adanya granula bakteri ditanam
Subcultur di media Loeffler Serum blood agar atau BHI agar.

HARI 3
Koloni yang tumbuh di Loeffler Serum atau Blood agar atau BHI agar, di buat smear
dicat menurut Neisser atau Albert’s stain untuk melihat ada tidaknya granula/poalkorrel.
Selain itu juga di tanam di dalam media gula-gula dan media identifikasi yang lain. Masuk
Inkubator 370C selama 24 jam.

HARI 4
Dibaca dan dicatat pertumbuhan media gula dan media identifikasi. Setelah dilakukan
tes kimia kemudian dicocokan dengan sifat-sifat Culturil dan Biochemisnya, serta
Morphologisnya untuk menentukan diagnosisnya.

PENANGANAN

1. Pencegahan
a. Isolasi Penderita

Penderita difteria harus di isolasi dan baru dapat dipulangkan setelah pemeriksaan sediaan
langsung menunjukkan tidak terdapat lagi Corynebacterium diphtheriae.

b. Imunisasi

Pencegahan dilakukan dengan memberikan imunisasi DPT (difteria, pertusis, dan tetanus)
pada bayi, dan vaksin DT (difteria, tetanus) pada anak-anak usia sekolah dasar.

c. Pencarian dan kemudian mengobati karier difteria

Dilakukan dengan uji Schick, yaitu bila hasil uji negatif (mungkin penderita karier pernah
mendapat imunisasi), maka harus diiakukan hapusan tenggorok. Jika ternyata
ditemukanCorynebacterium diphtheriae, penderita harus diobati dan bila perlu dilakukan
tonsilektomi.

2. Pengobatan

Tujuan pengobatan penderita difteria adalah menginaktivasi toksin yang belum terikat
secepatnya, mencegah dan mengusahakan agar penyulit yang terjadi minimal, mengeliminasi
C. diptheriae untuk mencegah penularan serta mengobati infeksi penyerta dan penyulit
difteria.

a. Pengobatan Umum
Pasien diisolasi sampai masa akut terlampaui dan biakan hapusan tenggorok negatif 2
kali berturut-turut. Pada umumnya pasien tetap diisolasi selama 2-3 minggu. Istirahat tirah
baring selama kurang lebih 2-3 minggu, pemberian cairan serta diet yang adekuat. Khusus
pada difteria laring dijaga agar nafas tetap bebas serta dijaga kelembaban udara dengan
menggunakan humidifier.

b. Pengobatan Khusus

Antitoksin : Anti Diptheriar Serum (ADS)


Antitoksin harus diberikan segera setelah dibuat diagnosis difteria. Dengan pemberian
antitoksin pada hari pertama, angka kematian pada penderita kurang dari 1%. Namun dengan
penundaan lebih dari hari ke-6 menyebabkan angka kematian ini bisa meningkat sampai
30%. Sebelum pemberian ADS harus dilakukan uji kulit ( Shick Test )atau uji mata terlebih
dahulu. Uji Shick test bertujuan untuk mendeteksi kerentanan tubuh terhadap penyakit difteri.

Antibiotik
Antibiotik diberikan bukan sebagai pengganti antitoksin, melainkan untuk membunuh
bakteri dan menghentikan produksi toksin. Pengobatan untuk difteria digunakan
eritromisin , Penisilin, kristal aqueous pensilin G, atau Penisilin prokain.

Kortikosteroid
Dianjurkan pemberian kortikosteroid pada kasus difteria yang disertai gejala.

c. Pengobatan Penyulit

Pengobatan terutama ditujukan untuk menjaga agar hemodinamika tetap baik.


Penyulit yang disebabkan oleh toksin umumnya reversibel. Bila tampak kegelisahan,
iritabilitas serta gangguan pernafasan yang progresif merupakan indikasi tindakan
trakeostomi.

d. Pengobatan Kontak

Pada anak yang kontak dengan pasien sebaiknya diisolasi sampai tindakan berikut
terlaksana, yaitu biakan hidung dan tenggorok serta gejala klinis diikuti setiap hari sampai
masa tunas terlampaui, pemeriksaan serologi dan observasi harian. Anak yang telah
mendapat imunisasi dasar diberikan booster toksoid difteria.

e. Pengobatan Karier

Karier adalah mereka yang tidak menunjukkan keluhan, mempunyai uji Schick negatif
tetapi mengandung basil difteria dalam nasofaringnya. Pengobatan yang dapat diberikan
adalah penisilin 100 mg/kgBB/hari oral/suntikan, atau eritromisin 40 mg/kgBB/hari selama
satu minggu. Mungkin diperlukan tindakan tonsilektomi/adenoidektomi.

Anda mungkin juga menyukai