TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Microbiólogo Industrial
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
APROBADO
___________________________
Fernando Murcia, Microbiólogo.
Director
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
APROBADO
___________________________
Fernando Murcia, Microbiólogo.
Director
_____________________________ _______________________
María Clara Méndez, Microbióloga Adriana Páez, Microbióloga
Jurado Jurado
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
APROBADO
__________________________ _______________________
Angela Umaña Muñoz, M. Phil David Gómez Méndez, Msc
Decana Académica Director de carrera
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN 1
1. INTRODUCCIÓN 2
4. OBJETIVOS 29
4.1 Objetivo general 29
4.2 Objetivos específicos 29
5. MATERIALES Y METODOS 30
5.1 Control de calidad de los medios de cultivo 30
5.2 Verificación del control de equipos 32
5.3 Control de ambientes 32
5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 33
5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras 33
5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus 34
5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa
positiva 34
5.4.4 Evaluación de la validación 35
5.5 Informe de resultados 36
6. RESULTADOS Y DISCUSION 37
6.1 Control de calidad de los medios de cultivo 37
6.2 Verificación del control de equipos 43
6.3 Control de ambientes 44
6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 45
6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus 47
6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus 47
6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus 53
6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva 64
6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
64
6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
69
7. CONCLUSIONES 82
8. RECOMENDACIONES 84
9. REFERENCIAS 85
8.1 Recursos Electrónicos 89
10. ANEXOS 90
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio 39
Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio 40
Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio 41
Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio 41
Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido 51
Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus
cereus en muestra de albahaca 55
Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 56
Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas
(ensayo de reproducibilidad 1) 57
Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus
cereus en muestra de albahaca 61
Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 62
Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas
(ensayo de reproducibilidad 2) 63
Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 64
Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus
aureus en una muestra de leche cruda 67
Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida 68
Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes
horas (ensayo de reproducibilidad 1) 74
Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 79
Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes
analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 80
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Con el fin de brindar una mayor calidad a los consumidores, las empresas
productoras de alimentos deben realizar análisis microbiológicos y
fisicoquímicos para determinar la confiabilidad del producto y verificar si
aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos
puedan ser comercializados. Por esta razón, es necesario que los
laboratorios que llevan a cabo dichos análisis se comprometan a realizar
los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar
resultados altamente confiables, razón por la cual, el laboratorio debe
controlar y asegurar la calidad de sus resultados, lo cual radica
principalmente en la alineación con parámetros nacionales e
internacionales, para así poder garantizar un buen desarrollo del
procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se
ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de
las técnicas más utilizadas en el laboratorio.
1
1. INTRODUCCIÓN
2
personal, también debe incluir manuales de procedimientos y
documentación en general, para así poder garantizar un buen desarrollo
del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se
ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de
las técnicas más utilizadas en el laboratorio.
3
adecuadas; además ayuda a la regulación y el cumplimiento de la
normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio y
como requisito para dar cumplimiento a la norma NTC ISO/IEC 17025
“Requisitos Generales para la competencia de laboratorios de Prueba y
calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación
del laboratorio.
4
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
5
La calidad del producto puede garantizarse, mediante la identificación y
manejo de los diferentes puntos críticos de control que se dan en el
proceso, de una correcta manipulación que dependerá de las buenas
practicas de manufactura seguidas durante el proceso de producción, de
un adecuado proceso de envasado o empaquetado, del transporte y de
las características de almacenamiento del producto (Decreto 3075, 1997).
6
del laboratorio, sino también del correcto funcionamiento de los equipos
empleados (Lightfoot & Maier, 2002).
7
2.1.1 Validación
Planificación:
Se busca establecer programas temporales y listas de verificación,
protocolos de la validación con criterios de aceptación/rechazo,
necesidades de recursos, análisis de riesgos, etc. (European
Commission, 2001).
Calificación de la instalación:
La calificación de la instalación busca establecer por evidencia objetiva
que todos los aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de
8
sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones aprobadas del
fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el
correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este.
Además de esto, también se incluyen requisitos de calibración y
verificación de los materiales de construcción (European Commission,
2001).
Debe incluir:
(a) Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre
procesos, sistemas y equipos.
Calificación de desempeño:
La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas
satisfactoriamente la calificación de la instalación y de funcionamiento.
Esta proveerá evidencia documentada, bajo condiciones anticipadas, que
9
se produce de manera consistente un producto que cumpla con las
especificaciones y el criterio de diseño (European Commission, 2001).
10
2.1.3 Validación secundaria
11
posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda. Luego se
efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados
son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no
satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva
validación demuestre su carácter satisfactorio (European Commission,
2001).
12
información generada durante una implementación real del proceso. La
validación concurrente es muy utilizada cuando se ha variado alguna
etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y
corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua
del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto
o resultado final sea correcto (ISO 14000, 1996).
2.1.4.4 Revalidación
Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes
críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un
sistema o equipo o cambio en instalaciones. La revalidación periódica se
presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales
(European Commission, 2001).
13
2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o
método
2.1.5.1 Precisión
Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o
central, que puede ser expresada en términos de varianza, desviación
estándar o coeficiente de variación. La precisión puede ser considerada a
tres niveles: repetibilidad, reproducibilidad y solidez y robustez (OGA-016,
2005).
- Repetibilidad
Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones
sucesivas por el mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo
instrumento y condiciones de medición (precisión dentro del ensayo). Por
mediciones sucesivas se entiende aquellas mediciones repetidas dentro
de un corto periodo de tiempo (OGA-016, 2005), (WHO Technical Report
Series, No. 823, 1992).
- Reproducibilidad
Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo
analito realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración
válida de reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las
condiciones del análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el
principio en que se basa la medición, el método, analista/observador e
14
instrumento, material y patrones de referencia, ubicación, condiciones de
uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente
en términos de los parámetros de dispersión de los resultados (desviación
estándar, varianza, coeficiente de variación) (OGA-016, 2005). La
reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los
programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un
laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del
tiempo (Lightfoot & Maier, 2002).
- Solidez y robustez
Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones
deliberadas en parámetros del método. Examina el efecto que las
condiciones operacionales y del medio ambiente tienen sobre los
resultados del análisis (diferentes temperaturas y porcentaje de humedad,
analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos de diferentes
marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote
homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se
vea afectado por estas variaciones deliberadas (OGA-016, 2005).
2.1.5.2 Selectividad
Se define un método selectivo como aquel que produce resultados
exactos para todos los analitos de interés (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).
2.1.5.3 Especificidad
Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el
compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se
espera estén presentes en la matriz de la muestra (WHO Technical
Report Series, No. 823, 1992). La especificidad se puede estudiar
agregando a la muestra algunas sustancias que se sospecha que
reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y comparar
15
estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (OGA-016,
2005).
2.1.5.4 Linealidad
Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y
su respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o
indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito,
dentro de un intervalo determinado (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).
2.1.5.5 Exactitud
Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor
verdadero convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado
(OGA-016, 2005). Se conoce también como error sistemático o sesgo.
2.1.5.6 Estabilidad
La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa
calculada en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo,
no excede el 20% del valor correspondiente de la precisión del sistema
(WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
16
2.2 Microorganismos de estudio
17
emética, que causa vómito, es producida por las células que crecen en el
alimento. El arroz es el vehículo de intoxicación más común por este tipo
de toxina. Para ambos tipos de intoxicaciones, los alimentos implicados
usualmente han sido calentados, y las esporas sobrevivientes han sido la
fuente de la enfermedad. Carlin et al. (2006), evaluaron los riesgos de la
producción de la toxina emética en ciertos tipos de alimentos,
encontrando que la poca habilidad de crecer a bajas temperaturas
demuestra que las cepas de B. cereus productoras de la toxina emética
representan un bajo riesgo en alimentos refrigerados. Por el contrario, la
notable resistencia de sus esporas a altas temperaturas favorece su
crecimiento en alimentos calentados cuando estos son dejados a
temperatura ambiente por más de 2 horas.
18
arroz y las especias, están entre los alimentos que más frecuentemente
se contaminan con B. cereus.
19
debidas a Staphylococcus en alimentos (Doyle, 1997). Si en un alimento
asociado a un brote es identificado S. aureus, también se debe estudiar la
producción de enterotoxinas, lo cual incrementa la complejidad del
ensayo, ya que es usual que S. aureus produzca una o más toxinas
simultáneamente. Comúnmente, las SE han sido divididas en cinco
grandes clases serológicas (SE A, SE B, SE C, SE D, SE E) debido a sus
propiedades antigénicas, pero en los últimos años se han identificado
nueve clases más (SE G hasta SE O). Siendo la SE A la enterotoxina más
comúnmente recuperada de brotes de enfermedades transmitidas por
alimentos (Aznar et al., 2005).
20
S. aureus es uno de los patógenos humanos no esporoformador más
resistente, pues puede sobrevivir por extensos periodos de tiempo. Es por
esto que para algunos alimentos procesados o tratados, S. aureus es un
buen indicador del grado de contacto humano, o con alimentos naturales
no tratados de origen animal dentro de la fábrica de alimentos (ICMSF,
2000). Por tal razón, se debe realizar la búsqueda de S. aureus; pues su
presencia indica insuficiencia en los tratamientos con calor como
pasteurización de la leche o cocción de la carne y en el uso de agentes
químicos sanitizantes que generalmente destruyen a este microorganismo
(Ingham & Schoeller, 2001).
a) Refrigeración inadecuada.
b) Poca higiene personal (no lavar las manos o los instrumentos
apropiadamente o no usar tapabocas).
c) Cocción o calentamiento inadecuados de los alimentos.
d) Uso prolongado de platos para calentar cuando se sirven los alimentos,
una práctica que promueve el crecimiento del microorganismo y la
producción de enterotoxinas (Doyle, 1997).
21
adecuado plan de toma de muestras (Lightfoot & Maier, 2002). Los
criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento
porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de
cada tipo de alimento (Romero, 2005).
22
2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos
23
2.4 Recuento y siembra en placa por superficie
Recuento:
Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al
nivel de 2 diluciones sucesivas.
Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que
no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de
precipitado) (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).
24
Además de Bacillus cereus, otras especies dan reacciones positivas o
débilmente positivas en medios con yema de huevo. La actividad
hemolítica no es exclusiva de Bacillus cereus. Por estas razones, deben
someterse a confirmación colonias representativas procedentes del medio
(ICMSF, 2000).
Recuento:
Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias
características (de 1 a 1.5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y
convexas, rodeadas de una zona clara).
Incubar durante 24 h ± 2 h más.
Marcar las colonias características (de 1.5 a 2.5 mm de diámetro; parte de
la zona clara puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias),
y también las colonias no características (estas pueden no tener zona
clara).
Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150
colonias características y no características al nivel de dos diluciones
sucesivas (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).
25
A las colonias presuntivas de S. aureus, realizarles el test de confirmación
de coagulasa por medio del kit Slidex Staph plus, el cual es una prueba
para evidenciar la rápida combinación de látex y eritrocitos; desarrollado
para detectar el factor de aglutinamiento, proteína A y un inmunógeno
específico de superficie para S. aureus (Wichelhaus, 1999).
26
que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas. Este
tipo de control de los medios de cultivo se denomina ensayo ecométrico
(Doyle, et al., 1997).
27
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
28
4. OBJETIVOS
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
30
• Control de pH a 25° C: se tomó una muestra del medio de cultivo y
con un pH-metro se realizó una medición del medio a una
temperatura de 25° C. El valor de pH obtenido para los medios de
cultivo debe corresponder con el indicado en la ficha técnica del
medio, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert &
Escolá, 2002).
31
muestra sobre el medio de prueba, interferente y de control para
cada microorganismo (Lightfoot & Maier, 2002). Se realizaron dos
repeticiones del método ecométrico para evaluar los medios de
cultivo (mismos lotes), una al comienzo y otra al finalizar el estudio
32
5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en
superficie
33
5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
34
diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas
de una zona clara).
• Posteriormente se incubaron durante 24 h ± 2 h más.
• Se realizó el recuento de UFC/g o ml de la muestra (Holguín
et al., 1998).
• Se realizó una modificación a la técnica para evaluar S.
aureus coagulasa positiva, debido a que resulta ser más
práctica y además se encuentra validada por la AOAC; la
cual consiste en realizar la confirmación de S. aureus
coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Para llevar a
cabo esta prueba se debe depositar una gota del reactivo
anti - S. aureus y una gota del reactivo control sobre la
lámina. Luego, se deben tomar una o dos colonias
sospechosas y emulsificar en los reactivos. La aglutinación
(combinación de látex y células rojas sanguíneas) dentro de
30 segundos indica la presencia de S. aureus
(http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/sl
idex_staph.htm) (2006).
• Además de esto, se realizó una confirmación bioquímica por
medio del kit de bioquímicas rápidas BBL Crystal (Gram-
Positive ID System) a las colonias características.
35
5.5 Informe de resultados
36
6. RESULTADOS Y DISCUSION
37
caducidad y las condiciones de conservación forman parte de la
documentación que acompañe a la preparación de los medios de cultivo
(Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se revisó la fecha de caducidad de
los medios de cultivo utilizados, y después de la preparación, cada caja
con el medio se etiquetó adecuadamente y estas se almacenaron a 4° C
por periodos no mayores a 8 días.
38
selectivos, ICA = 0 – 2.5, medios medianamente selectivos, ICA > 2.5,
medios no selectivos (Tortora, 1993).
Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico Medio de cultivo Microorganismo ICA ICR
Prueba Agar Bacillus cereus Bacillus cereus 3.8
ATCC 11778
Interferente Agar Bacillus cereus Escherichia coli 0 0.95
ATCC 8739
Control Agar Tripticasa soya Bacillus cereus 4
ATCC 11778
Fuente: Autor
39
Como prueba complementaria, al finalizar el estudio se realizó una
evaluación de productividad y selectividad del mismo medio de cultivo, y
se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 2):
Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico Medio de cultivo Microorganismo ICA ICR
Prueba Agar Bacillus cereus Bacillus cereus 5
ATCC 11778
Interferente Agar Bacillus cereus Escherichia coli 0 1.0
ATCC 8739
Control Agar Tripticasa soya Bacillus cereus 5
ATCC 11778
Fuente: Autor
Figura 1.
Método ecométrico agar
Bacillus cereus Scharlau (Prueba).
Fuente: Autor
Figura 2.
Método ecométrico agar
Bacillus cereus Scharlau
(Interferente).
Fuente: Fuente: Autor
40
También se realizó la evaluación de productividad y selectividad mediante
método ecométrico para el medio de cultivo agar Baird Parker Oxoid lote
464615 y se obtuvieron los siguientes resultados al iniciar el estudio (tabla
3):
Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico Medio de cultivo Microorganismo ICA ICR
Prueba Agar Baird Parker Staphylococcus
aureus 4.6
ATCC 6538
Interferente Agar Baird Parker Escherichia coli 0 1.0
ATCC 8739
Control Agar Tripticasa soya Staphylococcus
aureus 4.6
ATCC 6538
Fuente: Autor
Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico Medio de cultivo Microorganismo ICA ICR
Prueba Agar Baird Parker Staphylococcus
aureus 5
ATCC 6538
Interferente Agar Baird Parker Escherichia coli 0 1.0
ATCC 8739
Control Agar Tripticasa soya Staphylococcus
aureus 5
ATCC 6538
Fuente: Autor
41
Figura 5. Método ecométrico
Agar Baird Parker Oxoid
(Interferente).
Fuente: Autor
42
Según los resultados obtenidos en el método ecométrico realizado al
iniciar el estudio, se encontró que el agar Baird Parker de Oxoid es un
medio de cultivo altamente productivo, pues presentó un ICA de 4.6. Así
mismo, este medio presentó un ICA de interferencia de 0, demostrando
que es altamente selectivo, ya que se logró la inhibición del
microorganismo aquí evaluado. De la misma manera, se obtuvo un ICR
de 1, valor que demuestra la capacidad que tiene este medio de recuperar
los microorganismos, además de demostrar que el microorganismo de
prueba no presenta ningún problema de crecimiento y la cepa resulta
viable para el estudio, dándole así validez a la prueba (Tortora, 1993).
43
en servicio con el fin de establecer si reúne los requisitos de las
especificaciones del laboratorio y si cumple las especificaciones de
normatividad pertinentes; plantear un programa de revisión periódica de
dichos equipos de conformidad con las disposiciones del laboratorio,
acorde con la normatividad vigente (Soler, 2006).
44
Tabla 5. Recuento del control de ambientes.
Recuento de Mesófilos en Recuento de Hongos y
Prueba realizada UFC / 15 min. de exposición levaduras
en UFC / 15 min. de exposición
Control de calidad de 0 0
medios de cultivo
Prueba de repetibilidad 3 0
Prueba de reproducibilidad
(diferentes horas)
8:00 a.m. 0 0
12:00 m 1 0
4:00 p.m. 4 1
Prueba de reproducibilidad
(diferentes analistas) 1 4
Fuente: Autor
45
grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del
mismo elemento, realizadas bajo las mismas condiciones (GTC 84, 2003).
Por otro lado, para realizar cada uno de los recuentos se usó lo estipulado
en la NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales.
Reglas generales para el análisis microbiológico (NTC 4092, 1997).
N= ∑C
V [(n1+0.1*n2)*d]
46
Donde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en todas las cajas de petri que
contienen dos diluciones sucesivas.
47
Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de albahaca.
Según
Repetición 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento NTC
4092
1 10 9 13 11 2 1 2 2 1121212 11 x 105
2 9 9 11 10 1 1 2 1 1000000 10 x 105
3 13 14 12 13 2 3 1 2 1363636 14 x 105
Fuente: Autor
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Num ero de repeticiones
48
En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus se obtuvo un
considerable crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una
muestra de albahaca sobre el agar Bacillus cereus, en donde se evidenció
la morfología típica de las colonias (figura 8), que luego fue confirmada
por medio de una coloración de Gram, en la cual se obtuvieron bacilos
Gram positivos, comprobando así la presencia de este microorganismo en
la muestra de albahaca analizada. Asimismo, se realizó una confirmación
bioquímica de estas colonias por medio del kit de identificación rápida de
microorganismos Gram positivos BBL Crystal, con el cual se confirmó, con
un 99% de confianza (anexo 4), de que se trataba de Bacillus cereus
(figura 9).
49
Por otra parte, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para este ensayo, y se obtuvieron los resultados
presentados en la tabla 7; además, se realizó un análisis de varianza en
donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95%
(tabla 8).
1 11 3 1121212 11 x 105
50
Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en
superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Variable 1 Variable 2
Media 11,11111111 1,666666667
Varianza 3,861111111 0,5
Observaciones 9 9
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 10
Estadístico t 13,56747704
P(T<=t) una cola 4,56821E-08
Valor crítico de t (una cola) 1,812461102
P(T<=t) dos colas 9,13642E-08
Valor crítico de t (dos colas) 2,228138842
Fuente: Autor
Según
Repetición 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
NTC 4092
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Fuente: Autor
51
Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de
repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en
superficie de B. cereus se realizó el ensayo con una muestra de arroz
cocido, en donde no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,
ya que este microorganismo no debe encontrarse en este alimento, pues
la presencia de B. cereus indica puntos críticos de contaminación que
pueden ir desde las materias primas que fueron utilizadas, errores de
manipulación durante el proceso de producción, hasta errores en el
proceso de cocción, un tratamiento térmico insuficiente o un
almacenamiento prolongado sin refrigeración, factores que pueden causar
intoxicaciones y otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano
(Hayes, 1993).
52
6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus
Según
Tiempo 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento
NTC 4092
Repetición 1
24 22 25 24 2 2 4 3 2393939 24 x 105
8:00 a.m.
Repetición 2
26 22 24 24 3 2 2 2 2393939 24 x 105
8:00 a.m.
Repetición 3
20 22 21 21 2 1 1 1 2030303 20 x 105
8:00 a.m.
Repetición 1
22 27 25 25 2 4 2 3 2484848 25 x 105
12:00 p.m.
Repetición 2
25 25 23 24 3 2 2 2 2424242 24 x 105
12:00 p.m.
Repetición 3
25 21 23 23 3 2 1 2 2272727 23 x 105
12:00 p.m.
Repetición 1
23 21 24 23 2 2 3 2 2272727 23 x 105
4:00 p.m.
Repetición 2
22 20 20 21 2 1 1 1 2000000 20 x 105
4:00 p.m.
Repetición 3
20 25 23 23 1 3 2 2 2242424 22 x 105
4:00 p.m.
Fuente: Autor
53
Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas
Bacillus cereus
3000000
2500000
1500000
1000000
500000
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Repeticiones
08:00 a.m. 12:00 m 04:00 p.m.
54
prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados
en la tabla 13.
Repetición 1
25 3 2484848 25 x 105
12:00 p.m.
Repetición 2 24 x 105
24 2 2424242 3,5 109259,02 4,56398514 24 x 105
12:00 p.m.
Repetición 3
23 2 2272727 23 x 105
12:00 p.m.
Repetición 1
23 2 2272727 23 x 105
4:00 p.m.
Repetición 2 22 x 105
21 1 2000000 3,5 149481,149 6,88308603 20 x 105
4:00 p.m.
Repetición 3
23 2 2242424 22 x 105
4:00 p.m.
Fuente: Autor
Repeticiones Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 11
8:00 a.m. Estadístico t 28,68449058
P(T<=t) una cola 5,43E-12
Valor crítico de t (una cola) 1,795884814
55
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 11
12:00 m. Estadístico t 31,52963125
P(T<=t) una cola 1,94019E-12
Valor crítico de t (una cola) 1,795884814
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 11
4:00 p.m. Estadístico t 29,7562167
P(T<=t) una cola 3,64281E-12
Valor crítico de t (una cola) 1,795884814
Fuente: Autor
Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
56
Total
Cuenta 9 9
Suma 213 23
Promedio 23,6666667 2,55555556
Varianza 3,5 0,77777778
Fuente: Autor
Según
Tiempo 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
NTC 4092
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Fuente: Autor
57
En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,
pues, como se mencionó anteriormente, este microorganismo no debe
encontrarse en este alimento porque puede causar graves intoxicaciones.
58
Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una
muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Según
1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento
4092
Analista 1
18 16 15 16 2 1 1 1 1606060 16 x 105
Repetición 1
Analista 1
15 17 15 16 1 2 1 1 1545454 15 x 105
Repetición 2
Analista 1
10 14 16 13 1 1 2 1 1333333 13 x 105
Repetición 3
Analista 2
12 14 9 12 1 2 2 2 1212121 12 x 105
Repetición 1
Analista 2
11 10 14 12 1 1 2 1 1181818 12 x 105
Repetición 2
Analista 2
15 16 10 14 1 2 1 1 1363636 14 x 105
Repetición 3
Analista 3
13 14 10 12 1 2 1 1 1242424 12 x 105
Repetición 1
Analista 3
12 13 15 13 1 3 2 2 1393939 14 x 105
Repetición 2
Analista 3
18 15 12 15 2 2 1 2 1515151 15 x 105
Repetición 3
Fuente: Autor
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Repeticiones
59
En el ensayo de reproducibilidad 2 se observó el crecimiento de Bacillus
cereus, aislado a partir de una muestra de albahaca, en donde se logró
evidenciar la morfología típica de sus colonias (figura 15), las cuales
fueron sometidas a coloración de Gram, y se confirmó la presencia de
este microorganismo, pues se observaron bacilos Gram positivos.
Analista 2
12 2 1212121 12 x 105
Repetición 1
Analista 2
12 1 1181818 12 x 105 6,25 97410,5163 7,7771315 12 x 105
Repetición 2
Analista 2
14 1 1363636 14 x 105
Repetición 3
60
Analista 3
12 1 1242424 12 x 105
Repetición 1
Analista 3
13 2 1393939 14 x 105 5,27777778 136643,795 9,8742624 14 x 105
Repetición 2
Analista 3
15 2 1515151 15 x 105
Repetición 3
Fuente: Autor
Analistas Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 9
1 Estadístico t 17,85143062
P(T<=t) una cola 1,23394E-08
Valor crítico de t (una cola) 1,833112923
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 9
2 Estadístico t 12,78563023
P(T<=t) una cola 2,23918E-07
Valor crítico de t (una cola) 1,833112923
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 10
3 Estadístico t 14,83823025
P(T<=t) una cola 1,94005E-08
Valor crítico de t (una cola) 1,812461102
Fuente: Autor
61
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005),
aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que
existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en
placa en superficie de Bacillus cereus.
Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
62
Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes
analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Según
1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
4092
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2 0
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Fuente: Autor
63
6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa
positiva
Según
Repetición 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento
NTC 4092
1 5 6 8 6 1 0 0 0 60606 60 x 103
2 5 5 7 6 0 1 1 1 57575 57 x 103
3 4 5 6 5 1 0 2 1 54545 54 x 103
Fuente: Autor
64
Dispersión prueba repetibilidad
Staphylococcus aureus
63000
62000
61000
60000
UFC / g-ml
59000
58000
57000
56000
55000
54000
53000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Num ero de repeticiones
65
Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de
leche cruda en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor
66
Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación
prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en
leche cruda.
1 6 0 60606 60 x 103
Variable 1 Variable 2
Media 5,666666667 0,666666667
Varianza 1,5 0,5
Observaciones 9 9
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 13
Estadístico t 10,60660172
P(T<=t) una cola 4,52372E-08
Valor crítico de t (una cola) 1,770933383
P(T<=t) dos colas 9,04745E-08
Valor crítico de t (dos colas) 2,160368652
Fuente: Autor
67
En la anterior tabla se presenta el valor de t (4,52372 x 10-8), en la cual se
puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la
prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) (P =
4,52372 x 10-8), aceptando así la hipótesis alternativa, para concluir que
se presenta repetibilidad para la técnica de recuento en placa en
superficie de Staphylococcus aureus.
Según
Repetición 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
NTC 4092
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Fuente: Autor
68
debilidad general, que comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después
de consumido el alimento (ICMSF, 2000).
Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la
obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 21) y un
resultado de <100 UFC / g de Staphylococcus aureus a causa de las
diluciones trabajadas.
69
Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una
muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1).
Según
Tiempo 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento
NTC 4092
Repetición 1
4 3 5 4 1 1 0 1 42424 42 x 103
8:00 a.m.
Repetición 2
5 6 4 5 1 1 1 1 54545 54 x 103
8:00 a.m.
Repetición 3
3 5 2 3 1 1 1 1 39393 40 x 103
8:00 a.m.
Repetición 1
4 3 7 5 0 2 1 1 51515 51 x 103
12:00 p.m.
Repetición 2
3 3 5 4 1 1 1 1 42424 42 x 103
12:00 p.m.
Repetición 3
6 5 4 5 1 0 0 0 48484 48 x 103
12:00 p.m.
Repetición 1
5 3 5 4 1 0 1 1 45454 45 x 103
4:00 p.m.
Repetición 2
4 6 5 5 1 2 0 1 54545 54 x 103
4:00 p.m.
Repetición 3
7 3 6 5 0 1 0 0 51515 51 x 103
4:00 p.m.
Fuente: Autor
60000
50000
Recuento UFC / g-ml
40000
30000
20000
10000
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Repeticiones
70
En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de
Staphylococcus aureus, el cual fue aislado a partir de una muestra de
leche cruda y se evidenció la conformación típica de las colonias de este
microorganismo (figura 23). Posteriormente se realizó una coloración de
Gram a las colonias características de S. aureus, obteniendo cocos Gram
positivos agrupados en racimos, lo que confirma así la morfología del
microorganismo aislado.
Repetición 1
5 1 51515 51 x 103
12:00 p.m.
Repetición 2 47 x 103
4 1 42424 2,02777778 4628,8379 9,75019043 42 x 103
12:00 p.m.
Repetición 3
5 0 48484 48 x 103
12:00 p.m.
71
Repetición 1
4 1 45454 45 x 103
4:00 p.m.
Repetición 2 50 x 103
5 1 54545 1,86111111 4628,947 9,16538472 54 x 103
4:00 p.m.
Repetición 3
5 0 51515 51 x 103
4:00 p.m.
Fuente: Autor
Repeticiones Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 9
8:00 a.m. Estadístico t 7,36600737
P(T<=t) una cola 2,1271E-05
Valor crítico de t (una cola) 1,83311292
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 11
12:00 m. Estadístico t 6,99598601
P(T<=t) una cola 1,1408E-05
Valor crítico de t (una cola) 1,79588481
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 12
4:00 p.m. Estadístico t 8,2433574
P(T<=t) una cola 1,3815E-06
Valor crítico de t (una cola) 1,78228755
Fuente: Autor
72
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad a las 8:00 a.m. (2,1271 x 10-5), a las 12 m. (1,1408 x 10-5)
y a las 4:00 p.m. (1,3815 x 10-6), en donde se puede deducir que el
análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el
promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de
los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) aceptando así la hipótesis
alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad
para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus
aureus.
Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
73
• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra
que presenta un bajo recuento (carne cocida) en diferentes tiempos
(ensayo de reproducibilidad 1).
Según
Tiempo 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
NTC 4092
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
8:00 a.m.
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
12:00 p.m.
Repetición
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Repetición
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Repetición
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
4:00 p.m.
Fuente: Autor
74
Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada
prueba 0 UFC en la muestra (figura 24) y un resultado de <100 UFC / g de
S. aureus.
75
Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus
en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
Según
1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento
NTC 4092
Analista 1
3 4 5 4 1 1 1 1 45454 45 x 103
Repetición 1
Analista 1
4 4 3 4 1 1 0 1 39393 40 x 103
Repetición 2
Analista 1
4 5 5 5 0 1 2 1 51515 51 x 103
Repetición 3
Analista 2
5 6 5 5 1 1 1 1 57575 57 x 103
Repetición 1
Analista 2
4 4 6 5 1 1 1 1 51515 51 x 103
Repetición 2
Analista 2
4 3 5 4 1 2 1 1 48484 48 x 103
Repetición 3
Analista 3
3 5 6 5 1 0 1 1 48484 48 x 103
Repetición 1
Analista 3
5 7 6 6 1 1 1 1 54545 54 x 103
Repetición 2
Analista 3
5 5 3 4 2 1 1 1 51515 51 x 103
Repetición 3
Fuente: Autor
70000
60000
Recuentos UFC / g-ml
50000
40000
30000
20000
10000
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Repeticiones
76
Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de
Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor
77
Analista 2
5 1 57575 57 x 103
Repetición 1
Analista 2
5 1 51515 52 x 103 1 4628,8379 8,81269353 51 x 103
Repetición 2
Analista 2
4 1 48484 48 x 103
Repetición 3
Analista 3
5 1 48484 48 x 103
Repetición 1
Analista 3
6 1 54545 51 x 103 1,75 3030,50001 5,88279069 54 x 103
Repetición 2
Analista 3
4 1 51515 51 x 103
Repetición 3
Fuente: Autor
Analistas Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 15
1 Estadístico t 9,803789355
P(T<=t) una cola 3,24058E-08
Valor crítico de t (una cola) 1,753050325
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 10
2 Estadístico t 10,11928851
P(T<=t) una cola 7,12846E-07
Valor crítico de t (una cola) 1,812461102
Variable 1
Observaciones 9
Grados de libertad 10
Estadístico t 8,485281374
3 P(T<=t) una cola 3,50212E-06
Valor crítico de t (una cola) 1,812461102
Fuente: Autor
78
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (3,24058 x 10-8),
analista 2 (7,12846 x 10-7) y analista 3 (3,50212 x 10-6), en donde se
puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la
prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005),
aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que
existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en
placa en superficie de Staphylococcus aureus.
Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
79
• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra
de carne cocida, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Según
1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento
NTC 4092
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2
Analista 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2
Analista 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 1
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 2
Analista 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100
Repetición 3
Fuente: Autor
80
Se presentaron datos iguales para las pruebas realizadas y la evaluación
de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0
UFC en la muestra (figura 27) y un resultado de <100 UFC / g de S.
aureus.
81
7. CONCLUSIONES
82
• El análisis estadístico permitió corroborar que las técnicas de
recuento en placa en superficie tanto para el análisis de Bacillus
cereus como para Staphylococcus aureus en muestras de
alimentos son repetibles y reproducibles.
83
8. RECOMENDACIONES
84
9. REFERENCIAS
Carlin, F., Fricker, M., Pielaat, A., Heisterkamp, S., Shaheen, R.,
Salonen, M. S., Svensson, B., Nguyen-the, C., Ehling-Schulz, M. 2006.
Emetic toxin-producing strains of Bacillus cereus show distinct
characteristics within the Bacillus cereus group. International Journal of
Food Microbiology (109) 132–138.
Holguín, M. S., Higuera, M. I., Rubio, B. L., Vargas, M., Muñoz, A. I.,
Díaz, G. 1998. Manual de técnicas de análisis para control de calidad
microbiológico de alimentos para consumo humano. Instituto Nacional de
Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. División laboratorio de alimentos
85
y bebidas alcohólicas. Sección de microbiología de alimentos INVIMA.
Bogotá, Colombia.
86
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y
CERTIFICACIÓN. 2001. NTC ISO/IEC 17025. Requisitos Generales de
Competencia de Laboratorios de Ensayos y Calibración. Bogotá,
Colombia: Icontec.
Pinto, B., Chenoll, E., Aznar, R. 2005. Identification and typing of food-
borne Staphylococcus aureus by PCR-based techniques. Systematic and
Applied Microbiology (28) 340–352.
87
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia.
88
8.1 Recursos Electrónicos
• http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/slidex_staph
.htm (2006) [Consulta: 14 febrero 2007. Hora 7 pm].
89
10. ANEXOS