ELISA Reader

1. nyalakan stavolt

2. nyalakan UPS

3. Hubungkan pembaca ELISA ke sumber listrik UPS, dan hubungkan pembaca

ELISA ke notebook yang berisi perangkat lunak pembaca ELISA (Gen 5)

4. nyalakan pembaca ELISA dengan menghidupkan tombol daya di bagian kiri

bawah mesin

5. Tunggu hingga pembaca ELISA menampilkan "READY" pada tampilan

6. Buka penutup ruang sampel dan tempatkan pelat ELISA di ruang sampel,
dengan benar

7. Tutup penutup ruang sampel

8. Buka perangkat lunak Gen5 pada notebook yang telah terhubung ke mesin

9. Sesuaikan panjang gelombang, dan parameter lain yang akan digunakan

untuk membaca

10. Klik ok

11. Tunggu hingga mesin selesai membaca dan nilai absorbansi masing-masing
sampel sumur muncul pada notebook yang terhubung

12. Simpan hasil bacaan di dalam folder dokumen

13. Tutup perangkat lunak Gen 5

14. Buka penutup ruang sampel, ambil pelat ELISA dan tutup ruang sampel
penutup
 15. Matikan pembaca elisa dengan mematikan tombol power

16. Matikan UPS

17. Pergantian Stavolt

Referensi : http://biosystem.mipa.ub.ac.id/wp-content/uploads/2017/11/SOP-ELISA-
Reader.pdf

Antigen-Coated-Plate ELISA (ACP-ELISA)

1. Ekstrak sampel 1/20 (w / v) dalam buffer lapisan yang baru disiapkan + 0,05
M DIECA. Tambahkan 200 µl aliquot dari sampel uji untuk menduplikasi
sumur.

2. Tutupi piring dan menetaskan malam pada suhu 4 ° C.

3. Cuci piring dengan PBS-Tween menggunakan botol cuci, rendam selama

beberapa menit dan ulangi mencuci dua kali. Blot piring dengan menekan
terbalik di atas kertas tisu.

4. Tambahkan 200 µl susu skim 2% di PBS-Tween ke setiap sumur

(memblokir). Tutupi piring dan inkubasi selama 30 menit pada 37 ° C

5. Hapus solusi pemblokiran dan ketuk kering.

6. Tambahkan MAb dalam pengenceran yang sesuai (lihat catatan pengiriman

atau tabung) di buffer konjugat; yaitu 20μl dalam 20 ml buffer pada
pengenceran yang direkomendasikan 1: 1000 atau 40μl dalam 20 ml buffer
pada pengenceran yang direkomendasikan 1: 500. Tambahkan 200μl ke
masing-masing piring mikrotiter

7. Tutupi piring dan inkubasi pada 37 ° C selama 2-4 jam.

8. Cuci tiga kali seperti pada langkah 3.

9. Encerkan RAM-AP 1: 1000 dalam buffer konjugasi, yaitu, 20μl dalam buffer
20 ml. Tambahkan 200 µl ke setiap sumur.

10. Tutupi piring dan inkubasi pada 37 ° C selama 1 jam.

11. Cuci tiga kali seperti pada langkah 3.

12. Tambahkan 200 µl aliquots dari substrat yang baru disiapkan (1 mg / ml

para-nitrophenyl-phosphate dalam buffer substrat) ke setiap sumur.

13. Tutupi piring dan inkubasi pada 37 ° C selama 30-60 menit, atau selama
diperlukan untuk mendapatkan reaksi yang jelas

14. Menilai hasil dengan:

a) Pengamatan visual

b) Pengukuran spektrofotometri absorbansi pada 405 nm

Nomor Alat : ELISA Plate Shaker

Merek : Wina Ikaku

Arus : 220 V

Kapasitas : 1 plate

Fungsi : Homogenasi pada saat proses ELISA II.

Cara Kerja Prosedur :

1. Colokkan stop kontak

2. Letakkan plate pada tempat yang disediakan

3. Tekan tombol ON

4. Putar kecepatan sesuai yang diinginkan

5. Tekan tombol OFF jika selesai digunakan Catatan: Pada saat mengambil plate
harap berhati-hati, karena tempat plate kurang kokoh.

Nomor Alat : ELISA Reader

Merek : Awareness

Arus : 220 V

Kapasitas: 1 plate

Fungsi : Membaca Absorbansi sampel

Cara Kerja Prosedur :

 1. Sambungkan steker

2. Tekan tombol Power untuk menyalakan

3. Masukkan plate ke tempat yang disediakan

4. Pilih absorbansi yang diinginkan, 405nm, 450nm, 492nm, 605nm

5. Tekan start untuk memulai pembacan

6. Ambil plate setelah selesai pembacaan

7. Tekan tombol power untuk mematikan

Referensi : http://fk.ub.ac.id/labfaal/wp-content/uploads/2013/10/IK-Alat.pdf
A. Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya
ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut
akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel
dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva
standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari
suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum
albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua
lubang platemikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena
protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan
sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam
buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar.
Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen
standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang
diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat
antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein
serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi
pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan
berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa
dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang
tidak terikat.
 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan
sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau
alat optik/ elektrokimia lainnya.
B. Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik
dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang
akan berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat
dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
C. Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan
dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/
permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh
antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti
larutan susu bubuk).
 4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan
membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada
antibody yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia
yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan
berikatan secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna
yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi,
maka makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah
dimurnikandimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen
menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh
antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti
larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan
antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
 7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat
spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga
terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna
yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang
terdeteki, maka makin besar kadarantigen spesifi dalam sampel.
Referensi : https://www.academia.edu/30429543/KELOMPOK_ELISA_terbaru
96-WELL MICROTITRE PLATES, ELISA PLATE WASHER , ELISA
READER

1. Desain tata letak percobaan dalam format 96-well. Semua tes serum harus
muncul dua kali di piring yang sama. Termasuk di setiap lempeng harus
duplikasi sumur yang mengandung

a) pereaksi sendiri dan

b) kontrol sera negatif yang diketahui

2. Tambahkan 100 µL antigen yang dibuat hingga konsentrasi yang diinginkan

(biasanya 0 • 5 µg / mL - Ag spesifik) di Coating Buffer. Tambahkan 100 µL
per piring mikrotiter sampai 96-baik. Tutup tumpukan ~ 10 piring dengan
pelat penutup (piring lama di laci lab). Tempatkan tumpukan piring pada dua
jaringan yang dibasahi dan bungkus dalam clingfilm, kemudian inkubasi pada
4˚C semalam.

3. Hapus antigen tak terikat dengan mencuci piring 4x dengan mencuci buffer
menggunakan mesin cuci Skatron. Blot kering (lembut) pada handuk kertas
(Kimberley Clark 3 lapis handuk tangan, Cat No. 6771) dan tambahkan 200
µL buffer pemblokiran (1% bubuk susu tanpa lemak * di Cuci Buffer).
Inkubasi pada suhu kamar selama 5 jam. * Kami menggunakan susu bubuk
tanpa lemak bernama Marvel di Inggris. Anda perlu menguji kumpulan bubuk
terlebih dahulu untuk memastikan pembacaan latar belakang tidak
terpengaruh. Sumber alternatif untuk memblokir protein adalah BSA (tidak
selalu kompatibel), gelatin terhidrolisis (ikan atau bovin) dan kasein. Susu
tidak baik untuk tes ELISA antibodi biotinylated karena ada biotin berlimpah
dalam susu bubuk.

4. Buat pengenceran serum di Buffer Pemblokir. Setelah 5 jam, cuci piring 4x

dengan buffer Cuci dan tambahkan 100 µL serum / antibodi (diencerkan di
 Buffer Pemblokiran) ke setiap sumur duplikat dan inkubasi (dilembabkan
seperti 2) di atas) semalam pada 4 ° C.

5. Cuci piring 4x, keringkan blot dan tambahkan 100 µl pengenceran antibodi
sekunder yang sesuai dalam Buffer Cuci (misalnya 1/5000 pengenceran
horseradish peroxidase antibodi IgG antibodi kelinci terkonjugasi; 1/1000
pengenceran horseradish peroksidase kelinci konjugasi anti- antibodi IgG
tikus (Dako Ltd) atau 1/1000 kelinci anti IgG1 / IgG3 manusia (Binding Site,
Inggris) dan menetaskan selama 3 jam pada suhu kamar.

6. Hapus antibodi sekunder yang tidak terikat dengan mencuci piring 4x dengan
pencuci. Blot kering.

7. Kembangkan reaksi dengan 100 µl buffer substrat pada suhu kamar selama
10-15 menit. Baca pelat kontrol positif tanpa henti di 450nm - A450nm dari
0,7-0,8 setara dengan A492nm yang berhenti dari 2,5-3,0.

8. Hentikan reaksi dengan menambahkan 25 µL 2.0M H2SO4 per sumur.

9. Baca optical density (OD) pada 492nm menggunakan pembaca plat mikrotitre
Labsystems Multiskan Ascent atau Pembaca ELISA Plate yang serupa.

Referensi:http://www.malariaresearch.eu/eumalar/sites/sbsweb2.bio.ed.ac.uk.eumalar
/files/pdfs/SOP%20ELISA%20Edinburgh.pdf