Universidad de Guayaquil

Facultad de Ingeniería Química

Carrera de Ingeniería Química

Deber #2

Materia:

Biotecnología

Tema:
Producción de proteína recombinante con estrategia de clonación virtual.

Docente:
Ing. Cecilia Uzca MSc.

Integrantes:
Alvarez Angulo David Augusto
Morales Bustamante María Cristina
Moran Guin Víctor Javier
Perero Lucio Alfonso Salvador
Yumbillo García Dennisse Estefanía

Paralelo:
7-2

Fecha de entrega:
06/12/2018

Ciclo II
DESARROLLO
Paso 1: Figura/diagrama que muestre la secuencia de DNA (nucleótidos) de la proteína
de su elección y el cDNA (nucleótidos) de la proteína de su elección. Figura con
descripción.
Nuestra proteína como tal es la HAB1 (Hemoglobin Alpha Subunit 1) (NCBI, 18) que es
una de las tres perspectivas que posee la proteína de la hemoglobina y por ello nos
basamos en únicamente en esta.
Paso 2: Mapa con los sitios de enzimas de restricción en la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína que ha elegido

Paso 3: Mapa del plásmido seleccionado de acuerdo al huésped donde se lo pretende

utilizar (usar referencias). El mapa muestra los sitios de restricción específicos para la
clonación y los sitios relevantes para expresión.
Imagen 1. Referenciada de (Invitrogen, 2010)
Paso 4: Lista de enzimas empleadas para la digestión del plásmido, de la secuencia que
codifica la proteína y para insertar la secuencia de ADN en el plásmido. Use referencias
que soporten la selección de enzimas.
Muestra la secuencia del forward y reverse primer con extremos 5’ y 3’

Usamos el plasmido pBudCE4.1, el mismo que nos referencia en el manual de Thermo

Fisher – Invitrogen by life technologies, el cual nos indica los sitios de restricción para
dos diferentes enzimas, ya sean de mamíferos y bacterias, como la nuestra es de humanos
hicimos los sitios de restricción de lado izquierdo del plasmido, con las enzimas Pstl y
BamHl.

El primer Forward empleado fue:

5’ ggatcc ATGGTGCTGTCTCCTGCCGAC 3’

El primer Reverse empleado fue:

5’ ctgcag TTAACGGTATTTGGAGGTCAG 3’

Paso 5: Mapa del plásmido recombinante detallado con los sitios de restricción
relevantes, la localización del ADN de interés. Mencione los elementos importantes para
la expresión y purificación de su proteína.

Los sitios de restricción del plasmido son el Pstl y el BamHI, en el plasmido se encuentran
dos tags de purificación los cuales son el c-Myc tag y el 6His, el cual únicamente para la
purificación de la proteína se usa el c-Myc tag ya que el otro se usa para bacterias. Estos
son los mas importantes en el plasmido recombinante.
Se necesitará 5𝑥105 a 1𝑥106 células transferidas para la purificación de su proteína
en una columna proBond ™ de 2 mL (u otra columna quelante metálica). Se necesita
consultar las instrucciones del fabricante antes de intentar purificar la proteína.
Paso 6: Describe el procedimiento para realizar la clonación en laboratorio empleando
viñetas. Use referencias
Paso 1: Se abre el plásmido y pega el gen dentro. La enzima de restricción reconoce la
secuencia blanco-específica y corta el ADN en dos. Si dos moléculas tienen extremos de
cadena sencilla sobresaliente que se empatan (El fragmento del gen blanco, que tiene un
sitio de corte cerca de cada extremo), se pueden complementar sus bases y unirse. (Khan
Academy, 2016)
Paso 2: El fragmento de ADN se "pega" en un vector y los extremos del ADN se unen al
ADN del vector por ligadura.
Paso 3: El vector se introduce en una célula huésped, a menudo una bacteria o levadura
(como la E. coli que se usa en los laboratorios), mediante un proceso llamado
transformación.
Paso 4: Durante la transformación, las células bacterianas son sometidas a un shock
térmico es decir a altos cambios de temperatura que ayuda a incorporar ADN extraño.
(Thieman & Palladino, 2010)
Paso 5: Los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos, las bacterias que
incorporan al plásmido se colocan en placas de medio de cultivo que contenga el
antibiótico. Las bacterias sin plásmido mueren, mientras que cada bacteria con un
plásmido forma una colonia (Thieman & Palladino, 2010)
Paso 6: Durante la ligación, fragmentos de ADN no siempre se pegan para aquello
debemos recolectar ADN de varias colonias y observar si cada una contiene el plásmido
correcto, para aquello es usa el método de la digestión con enzimas de restricción.
Paso 7: Con el método PCR se revisa los plásmidos. (Thieman & Palladino, 2010)
Paso 8: Ya encontrado una colonia de bacterias con el plásmido correcto, se le da una
señal química que ordena generar la proteína blanco (queratina)
Paso 9: Se crece un cultivo de bacterias grande. Si nuestro plásmido contuviera el gen
codificante (queratina k81), las bacterias se inducen a expresar el gen y este comenzaría
a traducir el ARNm para producir moléculas de la proteína de la queratina. (Thieman &
Palladino, 2010)
Paso 10: Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas se rompen para
ser liberadas. La proteína blanca debe ser purificada o separada del resto del contenido de
las células con técnicas bioquímicas ya que existen otras proteínas sumergidas en las
bacterias. (Thieman & Palladino, 2010)
Paso 7: Describe el protocolo de purificación de la proteína expresada. Explique en
máximo 10 líneas porque se selecciona la estrategia de purificación. (Use referencias que
soportan la elección y explicación).
Existen dos sitios de purificación para la proteína expresada, uno de ellos es el 6HIS
siendo una etiqueta del plásmido en la cual se utiliza Cromatografía de Afinidad por Iones
Metálicos Inmovilizados (IMAC), en esta técnica, los iones del metal de transición se
inmovilizan en una matriz de resina usando un agente quelante tal como ácido
inminodiacetico. (Bio-Rad, 2018) El ion más común para la purificación de la etiqueta de
una proteína recombinante es Ni2 +, aunque CO2 +, Cu2 +, y Zn2 + también se utilizan.
Hay otra sección que del plásmido que es el c-Myc tag, el cual utiliza el proceso de
Inmunosupresión con respecto a la proteína de interés detectando y analizando la misma.
(Clon-Tech, 2012).

Bibliografía
Bio-Rad. (2018). His-Tag Purification. Obtenido de http://www.bio-
rad.com/featured/en/his-tag-purification.html
Clon-Tech. (2012). Protein Purification. Complete Solutions for All of Your Protein
Purification Applications. Obtenido de
https://www.takarabio.com/assets/documents/Brochures/Protein%20Purification
%20BrochureFolder%20633051%20IN.pdf
Invitrogen. (2010). pBudCE4.1. Nueva York: Corporate Headquarters.
Khan Academy. (2016). Obtenido de
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
NCBI. (2018 de 11 de 18). Obtenido de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3039
Thieman, W. J., & Palladino, M. A. (2010). Introducción a la Biotecnología (Segunda
Edicion ed.). Pearson.
Software
Serial Cloner http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html