Escuela de Bioquímica y Farmacia

PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA I Marzo 2019 - Julio 2019

Dr. Galo Insuasti

CROMATOGRAFIA ASCENDENTE EN PAPEL DE AZUCARES

 Utilizando guantes, recortar el papel cromatográfico de dimensión acorde con la cuba que se disponga.
 Marcar el papel haciendo una línea horizontal a 2 cm del margen inferior.
 Aplicar sobre la línea marcada, una o dos gotas de cada uno de los estándares y la muestra problema con la ayuda de microjeringa
o un capilar de vidrio.
 Secar el papel a la temperatura ambiente.
 Asegurar el papel en el soporte y colocar en la cuba que contendrá el sistema de solvente recomendado, de modo que la línea a
lápiz, quede un poco más arriba del nivel del solvente.
 Cerrar la cuba y esperar a que el solvente corra hasta llegar a 3 cm del margen superior.
 Cuando ha llegado al nivel esperado el frente de solvente saque el papel con cuidado y marcar la línea de llegada del solvente
y esperar a que se seque el papel.
 Revelar pulverizando el papel con algún revelador de los que constan a continuación hasta que asomen manchas de algún color,
para esto siga las instrucciones en cada revelador.
 Identificar los diferentes azúcares por el cálculo del Rf

Eluyentes: Butanol-ácido acético-éter-agua (45:35:5:15).

Butanol, piridina, agua (6:4:3)

Sobre el revelador, seleccione uno de los cuatro para su utilización

Revelador 1: Disolver 0.33 g de difenilamina en 16.6 ml de acetona, adicionar 0.32 ml de anilina y finalmente 1.6ml de ácido
fosfórico. Agitar para disolver el precipitado que pudiera producir.
Revelador 2: Sumergir el cromatograma en una solución de AgNO3 0,5 % en acetona y dejar secar al aire libre. A
continuación sumergir el papel cromatograma en una solución de KOH5 % en etanol, hasta que aparezcan
manchas y lavar con agua. Posteriormente sumergir el papel cromatograma en solución de NH 3 3 % y lavar
con agua, por último sumergir el cromatograma en una solución de tiosulfato de sodio 3 % y dejar secar al
medio ambiente.
Revelador 3. Ftalato de anilina; disuélvase 0,9 g de anilina y 1,6 g de ácido ftálico en 100 ml de n-butanol saturado con
agua (para rociar). También para TLC
Revelador 4 Fluoroglucina; disuelva 0,2 g de fluoroglucinol en 80 ml de etanol al 90% y mézclese con 20 ml de ácido
tricloroacético al 25 % (para rociar). También para TLC
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PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA I Marzo 2019 - Julio 2019
Dr. Galo Insuasti

HIDROLISIS ACIDA DE UNA PROTEINA

Y CROMATOGRAFIA EN PAPEL (ascendente) DE AMINOACIDOS DEL HIDROLIZADO PROTEICO

Preparación de muestras.

Separe gluten de la harina de trigo o caseína de la leche. (**) Proceda a hidrolizar una cantidad suficiente para unos 30 ml de HCl 6 M
bajo un reflujo de 16 h. Separe en un tubo unos 2 ml de hidrolizado y déjelo ligeramente ácido usando Carbonato de sodio sólido hasta
que deje de hacer efervescencia. La muestra en esta condición se aplicará para la cromatografía en papel de aminoácidos resultantes
de la hidrólisis.

Procedimiento:

 Utilizando guantes, recortar el papel cromatográfico de dimensión apta para la cuba que se tenga.
 Marcar posiciones para estándares y el hidrolizado en el papel, haciendo una línea horizontal a 2 cm de uno de los bordes del
papel.
 Aplicar sobre las marcas, una o dos gotas de cada uno de los estándares y muestra hidrolizada con el auxilio de la microjeringa
o capilar.
 Secar el papel a la temperatura ambiente.
 Asegurar el papel en el soporte y colocar en la cuba, de modo que la línea de lápiz, quede un poco más arriba del nivel del
solvente que está en la cuba
 Cerrar la cuba y esperar a que el solvente corra hasta llegar a 3 cm del margen superior. Marcar la línea de llegada del solvente
y esperar a que se seque el papel.
 Revelar pulverizando la solución de ninhidrina y colocando en una estufa a 110 °C, hasta coloración rosa (violeta).
 Identificar los diferentes aminoácidos por el cálculo del Rf.


Eluyente:

AMINOACIDOS: Para CP descendente Butanol-ácido acético-agua (55:25:20). Para CCF o papel ascendente (25:6:25)

Revelador:

NINHIDRINA: Solución de ninhidrina al 0.2 % en acetona

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** OBTENCIÓN DE GLUTEN DE TRIGO (PROTEINA DEL TRIGO)

1. Disponer de dos puñados de harina de trigo

2. Adicionar agua suficiente para conseguir una masa
3. Amase unos 4 minutos
4. Deje en reposo la masa unos 10 min
5. Proceda a amasar bajo el chorro de agua en un grifo de agua potable hasta que deje de salir agua blanquizca de almidón
6. Cuando se tenga agua transparente usted quedara en su mano con una masa elástica que constituye el gluten de trigo (proteína
del trigo) (o entregara el gluten al grupo encargado de la hidrolisis)
7. El gluten obtenido es el que se procederá a hidrolizar con HCl 6 M. por 16 Horas
8. Luego de las 16 horas realizará de esta muestra (hidrolizado) una cromatografía de aminoácidos con la técnica anterior
correspondiente