NAMA : DIAN KEMALA PUTRI SALEH

NIM : 711345317011
TUGAS
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah
antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan
teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada
teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim
yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai
teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA
yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich,
dll.

1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen
yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan
sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel
pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang
antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah
ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter
untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke
dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat
dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat
dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana,
hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan
antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody
sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan
pada sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik
dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan
kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel
yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang platemikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,
karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.

3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH

Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen
yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan
ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu
dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan
antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka
teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi
antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti
polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody
penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat
sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut
untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari hasil pengujian, antara lain :
Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding
microtiter.
 Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu
ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya
yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua
jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector, kemampuannya menguji
sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki.
Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein
serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini
hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya
mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang
berbeda (epitopnya harus berbeda).
4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA
Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,
hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector
(antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut
dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin
yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody
streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin
kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.
5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian
secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) COMPETITIVE
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip
dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang
mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan
antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal,
sehingga antibody spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik bertaut
enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody
spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut
enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik.
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut
dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian
positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter.
Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim
signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang
dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim
signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.
Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut
dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian
positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antigen spesifik.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah
sinyal yang dihasilkan.

Contoh Pemeriksaan ELISA: Tes HIV :

Tes HIV ini mendeteksi antibodi untuk HIV-1 dan HIV-2 yang dilakukan dengan
ELISA (enzyme-linked immunisorbent assay) atau dikenal juga dengan EIA (enzyme
immunoassay).

Antibodi adalah protein yang dihasilkan oleh sistem kekebalan tubuh sebagai respon
terhadap kehadiran zat asing, seperti virus. Jika tes HIV Anda pada ELISA positif, dokter akan
menyarankan tes lanjutan dengan Western bolt untuk memastikan infeksi HIV.

Sampel darah diambil dari permukaan kulit Anda, dengan prosedur pengambilan darah
pada umumnya. Kemudian sampel darah dimasukkan ke dalam tabung khusus. Sampel darah
dikirim ke laboratorium untuk dianalisis. Untuk tes ELISA, sampel darah dimasukkan ke
cawan petri yang berisi antigen HIV. Antigen adalah zat asing, seperti virus, yang
menyebabkan sistem kekebalan tubuh merespon.Jika darah Anda mengandung antibodi
terhadap HIV, darah akan mengikat antigen. Kemudian ini akan diperiksa dengan
menambahkan enzim ke cawan petri tersebut, untuk membantu mempercepat reaksi kimia.

Setelah itu, akan terlihat bagaimana reaksi darah dan antigen Anda. Jika isi cawan petri
berubah warna, Anda mungkin terinfeksi HIV.Hasil dari tes HIV dengan ELISA biasanya
memakan waktu satu sampai tiga hari, tapi ini bervariasi tergantung pada tes, laboratorium,
dan apakah itu tes kesehatan di rumah.

Karena ada kemungkinan kecil bahwa antibodi seseorang akan salah menempel pada
protein non-HIV selama tes berlangsung, maka diperlukan tes kedua yang lebih spesifik.
Namun, tes kedua ini dilakukan jika tes yang awalnya positif. Tes ini disebut Western blot.
 Contoh Pemeriksaan ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG :
Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi, sel
telur akan bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah
plasenta akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic
gonadotropin (hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel
normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air
seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat
molekul total 39 kD. Subunit rantai identic dengan subunit rantai dari hLH (human
Luteinizing Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human
Thyreoidea Stimulating Hormone). Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul
hCG. Pengukuran hCG yang sempurna dan keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada
darah dan urin, tapi tidak pada subunit . Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama
trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml
sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan
haid, yaitu kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone
tersebut akan terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak
hari terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar
hormone hCG sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari.
Peningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang sering
dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan
hamper mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan
pada saat wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah
berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan
menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut
konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan yang
dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama, yait mendekati kadar
hCG. Namun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin
bertumbuh di dalam Rahim seorang ibu.