ÍNDICE:

1 INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

2 MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O

PAUTA) DE LECTURA [“FRAMESHIFTS”]

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)

2.4 INVERSIONES

2.5 TRANSLOCACIONES

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS

TRANSPONIBLES

2.8 REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES

BACTERIANOS

3 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

4 TASA DE MUTACIÓN

5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS

INTRAGÉNICAS

5.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS

INTERGÉNICAS

5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt

MUTANTES

6 AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

6.1 AGENTES FÍSICOS

6.1.1 RADIACIÓN UV

6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

6.2 AGENTES QUÍMICOS

6.2.1 ANÁLOGOS DE BASES

6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

6.2.3 AGENTES ALQUILANTES

6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES

6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE

BASES

7 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS

Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS (TEST DE AMES)

8 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS

COLONIAS

8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS

FUENTES DE C Y ENERGÍA

9 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS SIGUIENTES TEMAS: VARIACIONES

BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO

Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo

de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que
esencialmente pueden ser de dos tipos:

mutaciones. A pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y

 tiende a la conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las
mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son
transmitidos a las generaciones siguientes.
recombinaciones subsiguientes a intercambio genético. En la mayoría de
los eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de
una misma población. En los fenómenos de sexualidad se origina una variedad
casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin necesidad del aporte de
nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede
actuar la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con
el paso del tiempo, en función de presiones ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se

reproducen rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes
poblaciones. Por supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo que
las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones. Estudiaremos la
mutación (y los modos posibles de su eliminación) en el presente capítulo.
Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias.
Aunque los procariotas carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen
variaciones genéticas asociadas a la adquisición por una bacteria de parte del
material genético de otra bacteria o de un bacteriófago. Los posibles
mecanismos de transferencia de información genética entre bacterias son:

transformación (que estudiaremos en el capítulo 17);

conjugación (ver capítulo 18);
transducción (ver capítulo 19).

Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia serán abordados en

la primera parte del capítulo 17.

1 INTRODUCCIÓN A LAS
VARIACIONES HEREDITARIAS NO
ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE
MATERIAL GENÉTICO
Definiciones básicas:

Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y

espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite
hereditariamente a la progenie.
 Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos
plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico: Mutación es
cualquier alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un
gen o a un locus (sea éste transcribible o no), aun cuando esta alteración no se refleje en
forma de cambio fenotípico observable o detectable.

Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.

alelo silvestre: “forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su

hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la
existencia de polimorfismo:existen diversos alelos silvestres diferentes
para un mismo locus.
alelos mutantes: las distintas “formas” (secuencias) que resultan de
mutaciones del alelo silvestre.

Una pareja de conceptos que también conviene incluir aquí es la diferenciación entre
mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas:

Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o

de sus interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en
los procesos de replicación, reparación o recombinación del ADN. (O sea, para
abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de forma experimental).
Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental
del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o
químicos denominados mutágenos.

2 MUTACIONES ESPONTÁNEAS.
Los principales tipos son:

1) Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

a) transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py  Pu:Py;

b) transversiones: cambio de una pareja Pu:Py  Py:Pu.

2) Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de

lectura [“frameshift”]. Se deben a:

a) eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;

b) incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.

3) Grandes delecciones (o borraduras)

4) Inversiones

5) Traslocaciones

6) Duplicaciones en tándem

7) Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.

Los estudiaremos a continuación, comentando algo sobre su base molecular.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra
purina:pirimidina:

A:T  G:C

Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una pirimida:purina (o

viceversa):

A:T  T:A

G:C  C:G

2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1.1 Base molecular de las transiciones

Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de formas

raras tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los desplazamientos tautoméricos del protón
cambian las propiedades de formación de puentes de H, de tal modo que:

forma tautomérica Se comporta como

A* (imino) G
G* (enol) A
C* (imino) T
T* (enol) C

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:

A* : C

C* : A

T* : G
 G* : T

2.1.1.2 Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las

formas sin y anti)

El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases dependerá

de:

constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-
5);

frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-
2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones

puntuales:

frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5

frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7 (para la
A)

Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más

bajas (del orden de 10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los
emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad
correctora de pruebas (“editing”): cada paso de elongación es seguido inmediatamente
por una comprobación del emparejamiento. Si este emparejamiento es erróneo, la
polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'5'para elimininar la base mal emparejada, y
a continuación vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su actividad polimerasa 5'3').

Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino, que se
empareja con la adenina:

1) C  Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)

2) Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…

3) C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)

4) La actividad exonucleasa 3'5' elimina la A recién incorporada

5) Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'3', que incorpora G

6) El resultado final es el emparejamiento correcto C  G

 De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente
equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.

Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia
una frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado
biológico es que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación, pero
con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar innovaciones sobre
las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite evolución.

Puntos calientes de mutación (“hot-spots”): son puntos o zonas dentro del genomio donde
se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al
azar.

Ejemplo: en el gen lacI hay una zona especialmente “caliente” cerca de la base 200,
donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la
secuencia de ADN de ese gen.

Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia, son

modificadas químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una
metilasa), y ello provoca una mayor susceptibilidad a la aparición de mutaciones
puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

CCAGG

GGTCC

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos citosinas
dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta
espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de manera que se
produce finalmente una transición: C:G  5-metil-C:G  T:G (emparejamiento
anómalo) T:A

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN

polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y
no se produce la expresión de los genes del operón.
En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el
promotor del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que la
expresión a alto nivel requiera el concurso de la proteína CAP activa. Pues bien,
por medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica
adquiera las características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o
 similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se
vuelve independiente de la proteína CAP para su expresión eficiente: el operón
se hará independiente de la represión catabólica.
En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el
operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor).
El efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se
expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no
reconoce al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un codón. Las

consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

1) Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la sinonimia
o “degeneración” del código genético, que afecta sobre todo a la tercera base del codón)
se origina una mutación neutra, que es “silenciosa” (no hay ningún cambio en el
fenotipo).

2) Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias

posibilidades:

a) mutaciones de sentido erróneo o alterado (“missense”):

i) si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir una

función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también
una mutación silenciosa por sustitución de aa.

ii) En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que puede
reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible
a efectores alostéricos. La proteína termosensible es funcional a temperaturas
moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente altas, a las cuales la
correspondiente proteína silvestre es activa. La proteína criosensible es
funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es activa. La proteína más
susceptible a efectores alostéricos es aquella que se inhibe por efectores de
forma más acusada. En esta categoría entran también las proteínas con actividad
residual.

iii) Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad
biológica debido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la
estructura secundaria y terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición por
mutación de una prolina en mitad de una -hélice destruye esta estructura, y
puede originar inactivación de la función.

iv) La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o parcial.
NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente
la capacidad funcional de la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa
 proteína alterada está presente en la célula? La proteína se puede identificar por
medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la proteína silvestre. Si ponemos
en contacto estos Ac con un extracto de las células mutantes, se producirá una
reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas de esta
manera se suelen denominar como “CRM” iniciales de “cross-reactive material”
(material que da reacción cruzada respecto de la proteína silvestre).

b) mutaciones “sin sentido” (“nonsense”), o sea, aquellas que cambian un codón

original a una de las tres tripletas que significan “señal de parada” de la
traducción:UAG (codón “ámbar”), UAA (codón “ocre”), UGA (codón “ópalo”).
Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es producir la detención de la
lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce una proteína
truncada, que suele ser inactiva.

Si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón policistrónico, y si esa

mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras secundarias en
horquilla, aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno de
polaridad, debido a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no
transcripción de la región situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea,
no habrá transcripción de los genes distales del operón.

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA

FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA
[“FRAMESHIFTS”]
Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no
sea 3 o múltiplo de 3)

Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este tipo
de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos
alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.

Ejemplo:

GTCCGTCCGTCCGTCC

CAGGCAGGCAGGCACC

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de la
mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al cambiar la
pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin sentido).

Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a una

zona importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga actividad
biológica.
2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)
Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior escisión de

dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a delecionar existen
secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algún
fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del material (bucle) intercalado
entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.

2.4 INVERSIONES
Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a
emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en los
extremos del material que sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que simplemente se

ha invertido el orden de los genes del segmento invertido en relación al resto del
genoma.[1] A diferencia de las deleciones, las inversiones suelen revertir, precisamente
por un nuevo proceso de recombinación entre las secuencias inversamente repetidas.

2.5 TRANSLOCACIONES
Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la
localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre
secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las dos
moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la otra se queda con
una delección).

Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a

inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una mezcla
de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en el mutante).

Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es su

inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro del
segmento duplicado.
 A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante en la
evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno o varios
genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir evolucionando e
incluso adquirir una nueva función.

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS

GENÉTICOS TRANSPONIBLES
La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de un
gen origina la inactivación insercional, debida a:

desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan

frecuentes señales de fin de traducción;
terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares (debido a
que las IS llevan frecuentes señales de terminación compleja de la
transcripción, dependiente de ).

Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse
ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a veces
también delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión imprecisa del
IS o Tn).

Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta distancia
una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se pueden
producir:

inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.

2.8 REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL

TRABAJO CON MUTANTES BACTERIANOS
Repasemos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común en
muchos estudios de genética:

Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico, y

según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la siguiente
manera:

mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;

mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:

letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;

condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el mutante
 pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.
mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la merma de
alguna función que no sea esencial para la viabilidad del organismo. Dentro
de ellos están los mutantes condicionales (su fenotipo alterado se
manifiesta en determinadas circunstancias).

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy

útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay que
distinguir dos tipos de condiciones:

condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas

condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su
fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación
pierde su actividad biológica.
condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen
mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las

siglas ts. El producto del gen mutado es más sensible al calor que el producto
silvestre
mutantes de biosíntesis sensible al calor;
mutantes sensibles al frío (criosensibles)
mutantes sensibles a efectores alostéricos
mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt
supresores, mutantes);
mutantes dependientes de estreptomicina;
mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas
concentraciones de sales).

En principio, y “por definición”, es imposible obtener mutantes letales estrictos de

genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-polimerasa,
ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes
condicionalmente letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un
tratamiento mutagénico sembramos células de Escherichia coli en placas y las cultivamos a
30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las colonias “ausentes” en
estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la placa matriz candidatas a
mutantes termosensibles.

Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos con
mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin sentido,
se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene simultáneamente una
segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se
puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).
3 CARACTERIZACIÓN DE LAS
MUTACIONES
Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo de
mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.

Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación
(ver más adelante, en este mismo capítulo).
Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.[2]
Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material
insertado.
Las delecciones no pueden revertir.
Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos transponibles
no aumentan su frecuencia por tratamiento con agentes mutagénicos, mientras
que el resto sí lo hacen.

4 TASA DE MUTACIÓN
En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un determinado
fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un determinado
intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de tiempo unitario
el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario
para completar una ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de

divisiones ocurridas en ese tiempo t.

Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas tasas de
crecimiento

En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de determinar el
número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que
el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:

T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan fácil como
ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de eventos de mutación en un
lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil
que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en ese cantidad medida se incluyen los
descendientes de eventos más o menos antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m
hay que recurrir a ciertos métodos estadísticos.
Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución de Poisson.
Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la
estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N0 sea 5.6X108;
imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes
al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener
cero (0) mutaciones en un cultivo sería:

P0 = m0·e-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P0 = 11/20 = 1·e-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos calcular la tasa
de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9

NOTA 2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa que
aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que
dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano
(cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7, mientras que la tasa de mutación a resistencia
a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es
de sólo 10-10 o 10-11.

5 REVERSIBILIDAD DE LAS
MUTACIONES BACTERIANAS
Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son
transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste
es permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente las
grandes delecciones son irreversibles).

La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación que

restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y varios
subtipos:

1) Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a
una retromutación (“back-mutation”).

2) Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el genotipo

original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos mutaciones.
La supresión se clasifica a su vez en:

a) Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª

mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:
 i) Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª mutación.

ii) El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de la primera.

iii) Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el producto

alterado de la primera mutación vuelva a ser funcional.

b) Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen mutado.

Puede ser de dos tipos principales:

i) Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen donde ocurrió

la primera.

ii) Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora afecta a otro

gen, que suele ser uno de los genes implicados en la maquinaria de
traducción del ARNm: ARNt y proteínas ribosómicas.

5.1 BASES MOLECULARES DE LAS

SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS
1. Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación  restauración
de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de lectura
(“frameshift”). La única zona alterada tras la mutación supresora sería la que queda
entre ella y la 1ª mutación. Si esta zona es corta y no es esencial para la actividad
biológica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.

2. Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo

que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer
mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión se la
denomina también pseudorreversión.

3. Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera

mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura
tridimensional y/o el centro activo de la proteína.

5.2 BASES MOLECULARES DE LAS

SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS
1) Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)

a) supresores de mutaciones que introducen codones de parada de lectura (o sea,

de codones “sin sentido, nonsense”): son ARNt mutados en el anticodón, de
modo que este anticodón mutado puede emparejarse con alguno de los tres tipos de
codones “sin sentido”, insertando ahora los aa. correspondientes que transportan;
 por lo tanto, impiden la terminación prematura de la traducción. Ejemplos: El codón
sin sentido UAG (“ámbar”) puede ser suprimido por versiones mutantes
(supresoras) de los siguientes ARNt:

Tipo de ARNt supresor Normalmente reconoce

ARNtSer UCG
ARNtGln CAG
ARNtTyr UC
ARNtLys AAG

(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación supresora).

b) El codón sin sentido UAA (“ocre”) puede ser suprimido por una versión mutante de
ARNtGly  GAA

c) Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido erróneo

(“missense”): Ejemplo: El ARNtGlycuyo anticodón es UCC, por mutación se
convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es UCU, que entonces reconoce al
codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor inserta Gly frente a cada codón
AGA.

d) supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes que

tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3 habituales.Ejemplo: Existe
un ARNtPhe que tiene un anticodón que reconoce la secuencia UUUC.

2) Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración por

mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación cambiada, de
modo que reconocen tripletas de forma errónea. Al introducir aminoácidos cambiados
en codones que a su vez proceden de mutaciones, pueden restaurar la funcionalidad de
algunas proteínas mutantes.Ejemplos:

a) mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S del

ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran variedad de mutaciones sin
sentido y por desfases. (El nombre de ram corresponde a las iniciales
deribosomas ambiguos).

b) Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que las
mutaciones sin sentido sean menos defectuosas (“leaky” = débiles).

5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES

SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES
Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja en la
proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma normal (en
lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:
 la concentración del ARNt supresor en la célula;
afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;
afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de
terminación de traducción que reconocen el mismo codón “sin sentido” (de
parada de lectura).

La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de crecimiento de la

bacteria, debido a que, aparte de su capacidad supresora, introduce errores de lectura en los
ARNm normales.

Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer que la
célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm normales
(es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el aminoácido correcto).
Pero por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes como para poder introducir
aminoácidos en codones mutantes con la frecuencia adecuada para suprimir la mutación
primaria. Normalmente, los supresores típicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la
mayoría de las veces se introduce el aa. correcto frente al codón correcto.

6 AGENTES MUTAGÉNICOS E
INDUCCIÓN DE MUTACIONES
Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones concretas
(p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes). Ahora bien, lo
que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa global de
aparición de mutaciones.

Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o

interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia de
aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de “mutaciones inducidas”). A
dichos agentes se les llama mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en última
instancia, los mutágenos causan alguna alteración en el ADN que

bien no puede ser reparada convenientemente,

o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos
celulares normales de reparación (consultar en el tema 13 el apartado sobre
“Mecanismos de Reparación de los daños al ADN”).

6.1 AGENTES FÍSICOS

6.1.1 RADIACIÓN UV

Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones en

las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar dímeros
de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos Py
consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:

50% T-T
40% T-C
10% C-C

Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo

posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor
frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.

6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil manejo,
por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños reparables por el
sistema SOS.

Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos ) provocan labilizaciones en el ADN, que
terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster), que
finalmente pueden conducir a delecciones.

6.2 AGENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

1) Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.

2) Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.

3) Agentes alquilantes.

4) Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares de
bases consecutivas.

5) Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

6.2.1 ANÁLOGOS DE BASES

Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los
ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos tenemos:

5-bromouracilo (5-BrU)
2-aminopurina (2AP).
 Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes
“dNTP”, de modo que su estructura les permite ser incorporados durante la replicación del
ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A G:C debido a que

experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:

BUceto:ABUenol:G

Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa

introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la mutación se
pueden resumir así:

A:T  (la primera replicación incorpora BU) A:BUceto (tautomerización y 2ª

replicación)  G:BUenol  (3ª replicación) G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:T C:G debido a sus

frecuentes tautomerizaciones (APamino APimino). Veamos el proceso:

A:T  (primera replicación)  APamino:T  (tautemerización y 2ª

replicación)  APimino:C  (3ª replicación)  G:C

6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

Alteran las Pu o las Py, de modo que:

causan errores en el emparejamiento, o bien

labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican
químicamente con gran frecuencia.

1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que

origina transiciones

sobre C  dU, que se empareja con la A.

sobre A (6-aminopurina)  hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma
ceto se empareja con la citosina: A:T HXceto:C  G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay

mutación: G  xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole un

hidroxilo a su grupo -NH2.

6.2.3 AGENTES ALQUILANTES

 Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o
en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y mutagénicos.

Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 (“Acción de los agentes

químicos”).
Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la
G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:

Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.
etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3
etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3
nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina.

Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG
sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del ADN. La
NTG es uno de los mutágenos más potentes que se conocen, pero es un agente “sucio”, en
el sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS
propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones y desfases del marco original
del lectura.

Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal

consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran distorsión en la doble
hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C  A:T.

Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar las
lesiones de la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

1) La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico entre

la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio
apurínico (sitio AP).

2) El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que rompe el

enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.

3) Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño nº de nucleótidos,

pero si el daño es muy grande se produce una situación SOS que tiende a ser reparada
por el sistema propenso a error ya estudiado, lo que provoca introducción de errores,
que conducen a transiciones y transversiones.

6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES

Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o
ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de lectura del
mensaje genético). Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados,
que presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden
incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de
bases consecutivas, con lo que provocan distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

derivados de la acridina, como el naranja de acridina

bromuro de etidio (ver nota[3])
derivados de la flavina (como la proflavina).

Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la recombinación del

ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir tumores

cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la malaria.

6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL

EMPAREJAMIENTO DE BASES

Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

benzo-a-pireno
aflatoxina-B1

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el sistema

SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error. Las aflatoxinas
son unas micotoxinas (producidas por hongos, comoAspergillus).

7 LAS BACTERIAS COMO

INDICADORAS DE SUSTANCIAS
MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE
CARCINOGÉNICAS
Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como consecuencia
de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son también mutágenos.

Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una prueba rápida,
sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como posibles
carcinógenos. Su base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a bacterias (es
decir, se comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en
cuestión, aumenta la tasa de aparición de mutantes.
TEST DE AMES

Usa una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a
nivel genético-molecular.

1) Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en placas Petri que
llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .

2) A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel de filtro

impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las placas se incuban
en estufa a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37oC).

3) Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las colonias
surgidas en cada placa, comparándolas con las colonias de una placa control que no
llevaba la sustancia. Las colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que
hayan experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversión en el alelo
original his-- restituye el fenotipo silvestre His+, y por lo tanto capacita a la bacteria a
crecer y dividirse en el medio mínimo.

Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de mutación

sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea también carcinógeno,
por lo que habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El 90% de los compuestos que
dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames

En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o adaptarla a
situaciones especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:

uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--, uvrC--, etc).

En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total
eficiencia. Esto hace que estas cepas sean más sensibles frente a sustancias
con menor potencial carcinogénico.
Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su “activación”
metabólica por el hígado, pero son inactivas por sí mismas. Para detectar a
estas sustancias, el test de Ames puede modificarse incorporando un extracto
microsomal estéril (fracción libre de células de hígado animal o de cultivos de
tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos a partir
de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo epóxido los
que verifican la acción mutagénica.
Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria debido al
efecto de barrera de la membrana externa de la pared celular. Para solventar
esto, se recurre a emplear mutantes LPS-- de Salmonella (o sea, mutantes
alterados en el lipopolisacárido, LPS), que facilitan la entrada de moléculas
hidrofóbicas.
8 ALGUNOS MUTANTES
BACTERIANOS EMPLEADOS EN
LABORATORIO
8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES
EMPLEADOS EN LABORATORIO
8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS
DE LAS COLONIAS:

Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en
placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de las
colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir brevemente
tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:

colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas

(plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua,
dando suspensiones homogéneas.
colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más agudas;
textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra un “moco”).
colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado;
son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan bien
en agua, dando grumos más o menos gruesos.

Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos de

disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran moléculas
de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, de la
cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:

En algunas bacterias se puede observar una disociación M  S, que se suele

deber a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S  R se debe a pérdida de
la cápsula.
En bacterias Gram-negativas, las disociación S  R se debe a menudo a la
pérdida de la capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del
LPS (antígeno somático “O”).
 Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en bacterias
patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de propiedades de
virulencia y de especificidad antigénica.

8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS

NUTRICIONALES

En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es

muy habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos (es decir, mutantes afectados en
algún gen de alguna ruta biosintética -de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por
supuesto, estos mutantes presentan interés por sí mismos, ya que su estudio permite
“diseccionar” la base genética de las vías metabólicas.

Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes

bacterianos auxotrofos:

1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):

cultivo original  tratar con mutágeno  lavar siembra placas de medio mínimo (MM)+
suplementos nutricionales réplica a MM

Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales)

con las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de suplementos). La
ausencia de colonia en la placa de réplica en una posición en la que existe colonia en la
placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no tiene “gemela” en la réplica es
un mutante auxotrófico.

Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que
determinar qué requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o
compuestos no puede sintetizar debido a la mutación). Para ello se realiza una sencilla
prueba en placas de Petri, denominada auxonograma.

Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la

frecuencia de aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja. Esto
significa que en el experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar numerosas
placas con grandes números de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad
para detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se suele recurrir a
una modificación del método anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el
cultivo tratado con el mutágeno:

2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes

auxotróficos (resumen de un protocolo):

cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)


 tratamiento con el mutágeno

mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) + bacterias vivas, entre ellas
unos pocos mutantes de diversos tipos

el cultivo se transfiere a un medio líquido rico, para permitir la recuperación y la expresión

fenotípica (lag fenotípico)

incubar unas cuantas horas

el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo

añadir penicilina e incubar

la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren, porque no crecen
en MM (muerte selectiva de los parentales prototrofos)

plaquear en medio sólido rico

hacer réplica a medio sólido mímino

identificar los auxotrofos (no crecen en MM)

recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos (hacer auxonograma)

8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

 Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos, entre
los que se encuentran:

alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;
alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores de la

superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para “marcar” cepas bacterianas
en experimentos de genética (especialmente los que implican algún proceso de
transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra receptora). Estos
marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa que los porte añadiendo al
medio de cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o fago), que obviamente
mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.

8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U

OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero

pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos
casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que cambian de
color en función del uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos en Agar Mac
Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes, mientras que el fenotipo silvestre
Lac+ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de sales biliares (recordar el
uso de este medio en las prácticas).

9 VARIACIONES BACTERIANAS POR

CURACIÓN DE PLÁSMIDOS
Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que se
replican independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son
indispensables para la viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos que
no dan ningún fenotipo detectable (función desconocida), pero existen muchos plásmidos
que codifican funciones como resistencia a antibióticos o a metales pesados, virulencia a
plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, etc.

Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar

mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar otro
tipo de variaciones genotípicas heredables: la curación, consistente en la pérdida del
plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida concomitante de las funciones y fenotipos
codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la bacteria.
Métodos de curación de plásmidos:

Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la

temperatura máxima);
Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN,
interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células
hijas (bromuro de etido, naranja de acridina, etc.).