LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA (Ekstraksi DNA Genom dan DNA Elektroforesis)

Disusun Oleh
Kelompok 2:
Nama NIM
1. Mantin Estomyhi Tindoan A41190076
2. Dodi Julianto Pakpahan A41190071
3. Ucok Petrus Mangampu Gultom A41190069

TEKNIK PRODUKSI BENIH

POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2019
 BAB 1. PENDAHULUAN

1. Latar belakang
DNA merupakan materi yang membentuk kromosom-kromosom dan juga
merupakan informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh makhluk hidup.
Informasi genetik ini pada dasarnya merupakan kumpulan instruksi/perintah yang
mengatur sel untuk bisa melakukan hal-hal tertentu. DNA singkatan
darideoxyribonucleic acid, atau dalam Bahasa Indonesia disebut dengan Asam
Deoksiribosa Nukleat atau ADN. Kata deoxyrybo mengacu pada nama gula yang
terkandung dalam DNA, yaitu deoxyrybose (deoksiribosa).
Teknik isolasi DNA sangat penting untuk mendapatkan DNA murni sampel.
Isolasi atau pengambilan DNA terdiri dari tahap penghancuran sel, penghilangan
RNA dan protein serta pemurniannya, dan pengendapan DNA. RAPD merupakan
suatu penanda khusus dalam analisis keragaman genetik tanpa mengetahui
Informasi DNA sampel yang diteliti, analisis genetik dengan penanda RAPD
menggunakan primer khusus dalam proses pengerjaannya untuk mengetahui
polimorfisme DNA hasil amplifikasi dan keragaman genetik dari sampel.
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA
dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA adalah proses
pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan
dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada
tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008;
Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA
tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan
bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran berat molekul dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan adalah agarosa. Molekul DNA sendiri bermuatan negatif yang
dipengaruhi oleh gugus fosfat- sehingga DNA akan bermigrasi menuju ke kutub
positif melalui matriks gel agarosa. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan
dibawah paparan sinar ultraviolet yang sebelumnya diberi gel dan ditambahkan
larutan etidium bromida.
 Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan seperti Etidium Bromida

yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium
Bromida (EtBr) dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat
terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk
memantau kecepatan molekul DNA pada gel.

2. Tujuan
Tujuan praktikum ini adalah agar :
1. Mahasiswa mengetahui prinsip kerja dan terampil melakukan isolasi DNA
2. Mahasiswa mengetahui faktor yang mempengaruhi konsentrasi dan
kemurnian DNA
3. Mahasiswa mengetahui prinsip kerja alat elektrofisis

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Struktur DNA

Susunan kimia DNA adalah polimer berupa rantai panjang dari
nukleotida. Perlu Kamu ingat bahwa satu nukleotida terdiri dari satu gugus
fosfat, satu komponen gula pentosa (5-karbon), dan satu basa nitrogen. Satu-
satunya pembeda tiap nukleotida ialah basa nitrogen. Hanya ada 4
kemungkinan basa yang terdapat pada tiap satu nukloetida DNA, yaitu adenine
(A), guanine (G), thymine (T), ataucytosine (C). Variasi urutan dari keempat
basa-basa tersebut membentuk suatu kode genetik pada sel. Mungkin hal ini
dirasa aneh, hanya dengan 4 huruf yang terdapat pada DNA, suatu informasi
genetik yang berbeda-beda dapat diwariskan pada keturunan makhluk hidup.
Itu sebenarnya wajar saja, karena pada kromosom terdapat berjuta-juta
nukleotida, maka sangat banyak kombinasi yang berbeda meskipun hanya
berasal dari 4 huruf tersebut. James Watson dan Francis Crick memenangkan
Nobel di tahun 1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama
dengan Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa
struktur DNA merupakan dua untaian nukleotida yang disebut dengan double
helix, dimana untaian tersebut tersusun secara spiral dengan posisi gula dan
gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa nitrogen saling berpasangan di
sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut).

2.2 Metode Isolasi DNA Tumbuhan

DNA genom dapat diisolasi dengan berbagai macam teknik. Pada
prinsipnya, sel harus dipecah terlebih dahulu menggunakan beberapa agensia,
baik secara fisik maupun kimiawi. Senyawa yang sering digunakan untuk
memecah sel pada isolasi DNA genom adalah CTAB. Senyawa CTAB
biasanya digunakan untuk isolasi DNA dari jaringan tanaman. Setelah sel
dipecah selanjutnya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Sel diperlakukan
dengan pemaparan senyawa kimiawi yang mempengaruhi dinding sel. Metode
kimiawi lebih banyak digunakan untuk preparasi DNA. Sedangkan dengan
mekanik atau fisik dengan menghaluskan sel dengan ditumbuk dengan mortar.

2.3 Tahap Lanjut Isolasi Gen

Tahapan umum pengisolasian DNA pada tahap awal menggunakan
nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel,
selanjutnya ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan
EDTA. Namun dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan
menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65 °C.
Bahan detergen seperti Sodium Dodecil Sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB
dapat digunakan untuk proses lisis. Penggunaan buffer CTAB sebagai
pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang
berkualitas dengan keinginan dan rancangan yang sesuai.
RAPD metode yang cepat dan efisien dalam produksi dan menyediakan
karakteristik fingerprints dari genom kompleks tanpa informasi sekuen
sebelumnya yang efektif dalam menyajikan informasi genetik dalam bentuk
pola pita karakteristik. Untuk proses evaluasi variabilitas dengan ketepatan
yang baik. Sebagian besar pita DNA informatif pada RAPD biasanya berjarak
300-3000 bp. Metode RAPD telah digunakan dalam proses genetika
fingerprinting, menyajikan peta hubungan kekerabatan, menemukan gen
ketahanan penyakit, identifikasi penanda spesifik kromosom dan karakterisasi
hibrida somatik. Metode RAPD sangat penting dalam bidang pemuliaan
tanaman untuk menganalisis keragaman genetik dari tumbuhan.

2.4 Tahap Lanjut Isolasi Gen

Tahapan umum pengisolasian DNA pada tahap awal menggunakan
nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel,
selanjutnya ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan
EDTA. Namun dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan
menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65 °C.
Bahan detergen seperti Sodium Dodecil Sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB
dapat digunakan untuk proses lisis. Penggunaan buffer CTAB sebagai
pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang
berkualitas dengan keinginan dan rancangan yang sesuai.
RAPD metode yang cepat dan efisien dalam produksi dan menyediakan
karakteristik fingerprints dari genom kompleks tanpa informasi sekuen
sebelumnya yang efektif dalam menyajikan informasi genetik dalam bentuk
pola pita karakteristik.
Untuk proses evaluasi variabilitas dengan ketepatan yang baik. Sebagian
besar pita DNA informatif pada RAPD biasanya berjarak 300-3000 bp. Metode
RAPD telah digunakan dalam proses genetika fingerprinting, menyajikan peta
hubungan kekerabatan, menemukan gen ketahanan penyakit, identifikasi
penanda spesifik kromosom dan karakterisasi hibrida somatik. Metode RAPD
sangat penting dalam bidang pemuliaan tanaman untuk menganalisis
keragaman genetik dari tumbuhan.

BAB 3. METODOLOGI

3.1 Alat dan bahan Ekstraksi DNA Genom

3.1.1 Alat
 Mortar dan Pastle
 Micropipette
 Tips
 Eppendrof tube
 DNA Elektroforesis
 Vortex
 Sentrifuge

3.1.2 Bahan
 Jaringan tanaman (Daun padi)
 N2 cair
 Buuffer ekstraksi
 PCL (Phenol, Choloform, Isoamylalcohol)
 Alcohol 70%
 Buffer TE
3.2 Alat dan bahan DNA Elektroforesis
3.2.1 Alat
 Micropipette
 Blue & Yellow Tips
 Eppendrof tube
 Timbangan dengan ketelitian 0.0001 gr
 Pippet 10 ml
 Beacker glass
 Erlenmeyer
 Microwave
 DNA Electrophoresis System

3.2.2 Bahan
 Gel loading buffer (0.25 % bromophenol blue, 0.25 % xylene cyanol
FF, 40 % sucrose dalam air).
 Agarose powder
 5 X TBE Buffer (Konsentrasi larutan stock per liter) : 54 g Trizma
base, 27.5 g Boric acid, 0.6183 gr EDTA (pH 8.0)
 Ethidium bromide 10 mg / ml.
 DNA yang sudah diisolasi
 Aquades (ddH2O)

3.3 Tempat dan waktu

Kegiatan praktikum dilakukan di laboratorium Bio-sains Politeknik
Negeri Jember. Kegiatan Ekstraksi DNA Genom dilakukan pada tanggal 15
April 2019 dan DNA Elektroforesis pada tanggal 22 April 2019.

3.4 Prosedur Kerja Ekstraksi DNA Genom

 Alat dan bahan dipersiapkan
 Jaringan tanaman (daun) ditimbang ± 0.5 gr lalu dituangkan kedalam
pastle.
 Daun diekstraksi dengan menambahkan Nitrogen (N2) cair dengan
suhu -180 0C untuk memudahkan ekstraksi organ tanaman (daun), lalu
digiling menggunakan mortar hingga bahan berbentuk powder
(bubuk).
 Bahan organik yang berbentuk powder dituangkan kedalam eppendorf
tube lalu ditambahkan 1 ml buffer ekstraksi yang telah dipersiapkan
sebelumnya (SDS 20 % + β.mercapthoethanol) untuk merusak dinding
sel, setela itu divortex ±1 menit agar larutan homogen.
  Larutan didalam eppendorf tube dipindahkan ke sentrifuge lalu
dilakukan sentrifugasi I dengan kecepatan 12 000 rpm selama 10
menit dengan suhu 40C untuk memisahkan supernatan (cairan) dengan
pellet (bahan padatan).
 Supernatan – karbohidrat, DNA, dan lemak terlarut berbentuk (bahan
cairan) dipisahkan lalu dipindahkan ke eppendorf tube yanng baru
setelah itu ditambahkan Isopropanol 625 ml lalu divortex ± 1 menit,
setelah itu kembali di sentrifugasi II dengan kecepatan 12 000 rpm
selama 10 menit dengan suhu 40C untuk membuat DNA tidak larut
mengendap menjadi bahan padatan, sementara itu bahan padatan hasil
sentrifugasi pertama dibilas untuk dibuang.
 Supernatan (bahan berbentuk cairan) dibuang lalu pellet (bahan
berbentuk padatan) ditambahkan TE 500 ml + PCI 500 ml +
Cloroform 500 ml lalu divortex ± 1 menit setelah itu disentrifugasi III
dengan kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit dengan suhu 40C
untuk memisahkan larutan menjadi supernatan (bahan cairan) dan
pellet (bahan padatan).
 Supernatan (bahan berbentuk cairan) dimbil sebanyak 400 µl
menggunakan micropippet lalu di tuangkan ke eppendorf tubeyang
baru lalu ditambahkan Isopropanol 320 µl + Na Ac 80 µl, setelah itu
disentrifugasi IV dengan kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit
dengan suhu 40C untuk membuat DNA tidak terlarut mengendap
menjadi pellet (bahan padatan).
 Pellet (bahan padatan) didalam eppendorf tubeditambahkan Ethanol
70% sebanyak 800 µl lalu disentrifugasi V dengan kecepatan 12 000
rpm selama 10 menit dengan suhu 40C setelah itu pellet + TE 30 ml
lalu disimpan dalam lemari pendingin ± 1 minggu.

3.5 Prosedur Kerja DNA Elektroforesis

 Agarose powder ditimbang dan ditimbang dalam tabung erlenmeyer
(1 % gel agarose; 0.25 g agarose dalam 25 ml TBE).
 Sejumlah larutan TBE ditambahkan ke dalam flask, kemudian
dipanaskan dalam microwave sampai agarose terlarut.
 Larutan didinginkan hingga 600C lalu ditambahkan EtBr dengan
konsentrasi akhir 0.5 ug/ml. ( 10 mg / ml larutan stock) setelah itu
dihomogenkan.
 Larutan agarose dituangkan pada gel tray, lalu sisir gel ditancapkan
dengan sempurna tanpa gelembung udara, setelah gel memadat
sempurna (± 30 menit pada suhu ruang) sisir gel dilepaskan lalu gel
ditempatkan pada electrophoresis tank.
  Running buffer dituangkan pada electrophoresis tank sampai agarose
gel terendam 1 mm dibawah buffer.
 DNA dari dalam eppendorf tube diambil ± 5 µl ke dalam cuvet lalu
ditambahkan aquades 2 ml setelah itu dimasukkan ke dalam
spektrometer untuk diketahui konsentrasi dan kemurnian DNA.
 DNA yang masih tersisa di dalam eppendorf tube ditambahkan gel
loading buffer lalu DNA di tuangkan ke lubang gel agarose yang
sudah disiapkan sebelumnya menggunakan micropippet.
 Setelah itu electrophoresis tank dialirkan listrik dengan tegangan 100
volt selama ± 30 menit atau sampai DNA keluar dari lubang gel
agarose dari posisi muatan negatif ke muatan positif.
 Electrophoresis tank dimatikan lalu gel agarose diangkat setelah itu
gel agarose divisualisai dengan memindahkan gel agarose ke Biodoc-
eluminnation yang dilengkapi sinar UV.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA dihitung menggunakan rumus :
Abs ∝260−Blanko ∝260
Konsentrasi = 𝑥 30 (konstanta)
Sampel µl

Kelompok Kode Sampel (organ daun (ABS 260 - Konsentrasi µg

padi) Blanko 280) / 5 / µl
µl x 30
1 06 (0.451-0) / 5 µl x 2.706 µg / µl
30
2 43 (0.008-0) / 5 µl x 0.0048 µg / µl
30
3 23 (0.417-0) / 5 µl x 2.5 µg / µl
30
4 08 (0.375-0) / 5 µl x 2.25 µg / µl
30
 4.1.2 Kemurnian DNA
Kemurnian DNA dihitung menggunakan rumus :

Abs ∝ 260 − Blanko ∝ 260

Kemurnian =
Abs ∝ 280 − Blanko ∝ 280

Kelompok Kode Sampel (organ (ABS 260 - Kemurnian

daun padi) Blanko 260) /
(Abs ∝ 280 −
Blanko ∝ 280)
1 06 (0.451 - 0) / (0.209 2.157
- 0)
2 43 (0.008 - 0) / (0.004 2
- 0)
3 23 (0.417 - 0) / (0.194 2.149
- 0)
4 08 (0.375 - 0) / (0.170 2.20
- 0)
*Kemurnian yang bagus berkisar antara 1.8 sampai dengan 2.

4.1.3 Foto Running DNA hasil visualisasi menggunakan electrophoresis

dengan Biodoc-elumination.
4.2 Pembahasan
4.2.1 Konsentrasi DNA
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat diketahui
Kemurnian DNA pada setiap kelompok berbeda-beda, kelompok 1 dengan
kode sampel 06 mendapatkan Konsentrasi yang paling tinggi mencapai 2.706
µg / µl. hal tersebut dibuktikan berdasarkan hasil visualisasi DNA dimana
sampel dari kelompok 1 berpendar sangat terang dimana tingkat pendaran ini
dipengaruhi oleh tingkat konsentrasi suatu bahan, sementara itu kelompok 2
dengan kode sampel 43 mendapatkan bahan dengan tingkat konsentrasi
paling rendah yaitu sebanyak 0,0048 µg / µl hal tersebut dibuktikan
berdasarkan hasil visualisasi DNA dimana sampel dari kelompok 2 tidak
terlalu berpendar yang menunjukkan bahwa konsentrasi bahan dari kelompok
2 rendah.
Perbedaan konsentrasi pada setiap bahan dapat diakibatkan oleh
kurangnya bahan pelarut TE, PCI, maupun cloroform pada saat proses
purifikasi sehingga sewaktu pengambilan supernatan setelah proses purifikasi
tidak semua bahan dilarutkan dengan sempurna.

4.2.2 Kemurnian DNA

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat diketahui
Kemurnian DNA pada setiap kelompok berbeda-beda, kelompok 2 dengan
kode sampel 43 mendapatkan kemurnian gen DNA yang paling baik dengan
nilai 2 (kemurnian yang paling baik bernilai 1.8-2) hal tersebut dibuktikan
berdasarkan hasil visualisasi DNA dimana sampel dari kelompok 2 tidak
memiliki garis panjang pada pengujian running DNA yang megindikasikan
bahwa bahan yang diuji adalah murni, sementara itu kelompok 4 dengan kode
sampel 08 mendapatkan bahan dengan kemurnian yang paling sedikit atau
tercampur dengan bahan lain dengan nilai kemurnian 2.20 hal tersebut
dibuktikan berdasarkan hasil visualisasi DNA dimana sampel dari kelompok
4 memiliki garis panjang pada pengujian running DNA yang megindikasikan
bahwa bahan yang diuji tercampur dengan bahan lain selain DNA.
Perbedaan tingkat kemurnian bahan dapat diakibatkan adanya
perbedaan ketelitian penggunaan micropippet pada saat pengambilan bahan
cairan (supernatan) yang mengandung gen DNA setelah proses purifikasi
tercampur dengan bahan padatan (pellet) yang berada di bawah supernatan
yang mengandung bahan selain gen DNA seperti karbohidrat.
 BAB 5. PENUTUP

1. Kesimpulan
Hasil praktikum Ekstraksi DNA Genom dapat disimpukan bahwa hasil
konsentrasi dan kemurnian pada isolasi gen DNA dapat dipengaruhi oleh tindakan
teknis penggunaan alat dan bahan pelarut.
Pengujian electroforesis DNA digunakan untuk melihat tingkat konsentasi
dan kemurnian gen DNA yang sudah diisolasi dengan tambahan EtBr sebagai
pewarna dan pemberat dan diberi tegangan listrik sehingga sewaktu gen bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif dapat dilihat menggunakan alat Biodoc-
eluminnation yang dilengkapi dengan sinar UV.

2. Saran
Setiap praktikan sebaiknya memperhatikan dan melakukan rangkaian tahapan
sesuai dengan panduan praktikum agar mahasiswa memiliki kemampuan
mengisolasi dan memvisiulisasi DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using
Fitriya, R. T., Muslimin, I., dan Lisa, L. 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA
Kit dan CTAB/NaCL Yang Dimodifikasi Pada Staphylococcus aureus dan
Shigella dysentriae. Lenterabio. 4(1) : 87–92.
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada
tanggal 2 Juli 2015, pada pukul 23.00 WIB.
Wirajana, I N., Darma, A. Y., dan Ketut, R. 2013. Isolasi DNA Metagenomik dari
Tanah Hutan Mangrove Pantai Suwung Bali. Jurnal Kimia. 7(1) : 19-24.