CAS9, ENZIMA ENDONUCLEASA PARA TERAPIAS GÉNICAS.

Camilo Obando

Laura valdes

¿Qué es terapia génica? capacidad de cortar el ADN es lo que permite

modificar su secuencia, eliminando o
La terapia génica se ha desarrollado como un
insertando nuevo ADN.
método de acercamiento al tratamiento de
las enfermedades humanas basado en la Las siglas CRISPR/Cas9 provienen
transferencia de material genético a las de Clustered Regularly Interspaced Short
células de un individuo. Habitualmente la Palindromic Repeats, en español
finalidad de esta transferencia de material “Repeticiones Palindrómicas Cortas
genético es restablecer una función celular Agrupadas y Regularmente interespaciadas.”
que estaba abolida o defectuosa, introducir La segunda es el nombre de una serie de
una nueva función o bien interferir con una proteínas, principalmente unas nucleasas,
función existente. Así, las distintas estrategias que las llamaron así por CRISPR associated
de la terapia génica se basan en la system (es decir: «sistema asociado a
combinación de tres elementos clave, el CRISPR»).
material genético a transferir, el método de
RNA guía
transferencia y el tipo celular que incorporará
dicho material genético. Los ARN guías (también conocidos como
ARNg) son un tipo particular de moléculas de
ARN que guían la inserción o deleción de
residuos de uridina en las moléculas de ARN
mensajero mitocondrial en los protistas
kinetoplastideos, en un proceso conocido
como edición del ARN.

CRISPR
Enzimas endonucleasas
La tecnología CRISPR/Cas9 es una
herramienta molecular utilizada para “editar” Las endonucleasas son enzimas que catalizan
o “corregir” el genoma de cualquier célula. la ruptura de enlaces fosfodiéster en
Eso incluye, claro está, a las células humanas. diferentes regiones ubicadas en el interior de
Sería algo así como unas tijeras moleculares una cadena poli nucleotídica.
que son capaces de cortar cualquier molécula
de ADN haciéndolo además de una manera
muy precisa y totalmente controlada. Esa
  Enzimas de restricción Dominio o sitio activo

Las enzimas de restricción son endonucleasas El sitio o centro activo es la zona de la enzima
provenientes de procariotas que reconocen en la que se une el sustrato para ser
secuencias de ADN muy específicas. catalizado. La reacción específica que una
enzima controla depende de un área de su
Cas9
estructura terciaria. Dicha área se llama el
En 1987 cuando se publicó un artículo en el sitio activo y en ella ocurren las actividades
cual se describía cómo algunas bacterias con otras moléculas.
(Estreptococos pyogenes) se defendían de las
infecciones víricas. Estas bacterias tienen
unas enzimas que son capaces de distinguir
entre el material genético de la bacteria y el
del virus y, una vez hecha la distinción,
destruyen al material genético del virus. Cas9
es una enzima endonucleasa de ADN y ARN,
guía asociada con un sistema Estructura cas9
adaptivo CRISPR (Repeticiones Palindrómicas
Cortas Agrupadas y Regularmente
Interespaciadas). Cierto tipo de bacterias
utiliza Cas9 para memorizar y más tarde
interrogar y adherirse al ADN extranjero,
como el ADN de bacteriófagos invasores o el
ADN de plásmidos.

Posterior a esto El Dr. Francis Mojica,

investigador de la Universidad de Alicante,
descubrió en 1993 unas secuencias repetidas
a las que denominó CRISPR Cas9. Su artículo,
publicado en Molecular Microbiology.
Las proteínas Cas9 son capaces de escoger
una pequeña parte del ADN viral, modificarlo
e integrarlo dentro del conjunto de
secuencias CRISPR. De esa forma, si esa
bacteria (o su descendencia) se encuentra con
ese mismo virus, ahora inactivará de forma
mucho más eficiente al material genético
viral. Es, por lo tanto, un verdadero sistema
inmune de bacterias.
Cas9 presenta una arquitectura bi-lobulada
con el ARN guía situado entre el lóbulo alfa-
helicoidal (azul) y el lóbulo de la nucleasa
(cian, naranja y gris). Estos dos lóbulos están
conectados a través de una sola hélice de
puente. Existen dos dominios de nucleasa
situados en el lóbulo de nucleasa
multidominio, el RuvC (gris) que escinde la
cadena de ADN no diana y el dominio de
nucleasa HNH (cian) que escinde la cadena
diana de ADN. De manera interesante, el
dominio RuvC está codificado por sitios
secuencialmente dispares que interactúan en
la estructura terciaria para formar el dominio
de escisión RuvC.
Clasificación de cas9
Cas contiene dos dominios clave para su
actividad, un dominio de nucleasa (RuvC) y
otro de helicasa (HNH)
 Dominio nucleasa (RuvC) Cas9
La nucleasa (RuvC)Cas9 reconoce como
blanco a las moléculas de DNA exógeno
y lo desactive mediante la introducción
de cortes específicos
 Dominio Helicasa (HNH) Cas9
El dominio de helicasa (HNH) se encarga
de abrir la doble hebra del DNA, y el
dominio de nucleasa (RuvC) le confiere
la capacidad para cortar el DNA en la
región definida por los crRNA
Mecanismo
La proteína nucleasa Cas9 y el ARN guía
primero deben administrarse en la célula
diana. Esto se logra a menudo mediante la
transfección de plásmidos de expresión de
ADN, pero la administración de ARN también
es eficaz. El ARN guía dirige a Cas9 para que
se una a las secuencias "protoespaciadoras"
de ADN que coinciden con la secuencia
"espaciadora" dentro del ARN guía. Los
protoespaciales deben estar flanqueados por
un motivo protospacer-adyacente apropiado
(PAM), que es NGG para la proteína Cas9 más
comúnmente utilizada. Si el espaciador y el
protoespaciador son idénticos o solo tienen
algunos desajustes en el extremo 5 'del
espaciador, Cas9 cortará ambas cadenas de
ADN, creando una rotura de doble cadena con
extremos romos. Si se le suministra una
plantilla de reparación que contenga los
cambios deseados y la homología con las
secuencias a cada lado de la ruptura, la célula
puede usar una recombinación homóloga
para reparar la ruptura al incorporar la
plantilla de reparación en el cromosoma. De
lo contrario, la ruptura será reparada por una
unión de extremo no homóloga, lo que
resultará en la alteración del gen. El corte de
Cas9 es lo suficientemente eficiente para
alterar ambos cromosomas al mismo tiempo
y / o para editar múltiples genes a la vez. Si la
celda que se está editando es una célula de la
línea germinal que da lugar a óvulos o
espermatozoides, los cambios pueden ser
heredados por las generaciones futuras.
Aplicaciones.
Este mecanismo es útil para variables
situaciones y problemáticas mundiales, por
ejemplo:
Mejoramiento de alimentos vegetales y
animales
Terapia en genes somáticos para
enfermedades de alta mortalidad en
humanos.
Nuevos medicamentos
Estudios epigenéticos
Edición de genes germinales para mejoras
genéticas desde el ovocito
Posible cura del VIH
Las nuevas técnicas buscan inhibir o eliminar
la expresión de CCR5 usando el
silenciamiento génico de CCR5 mediante tres
tipos diferentes de enzimas: nucleasas de
dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras con
función activador de transcripción y
endonucleasas celulares como CRISPR-Cas9
Terapia génica para tratamiento del cáncer
Las pantallas CRISPR / Cas9 son una
poderosa herramienta de genómica
funcional para descubrir nuevos objetivos
para la terapia del cáncer. Para la detección
combinada con CRISPR / Cas9, se debe
generar una población celular con una
diversidad de genes inactivados
Limitaciones y riesgos
Muchas células editadas con CRISPR
sufrieron reorganizaciones con "borrados" e
"inserciones" no deseados de ADN, lo que
puede provocar que algunos genes clave se
"activen" o "desactiven".
¿Hasta dónde podemos llegar?
La bioética con respecto a la edición genética
tiene muchas perspectivas entre la terapia
génica o la cirugía plástica de genes lo que
conllevaría a un desbalance mundial.
Proyección a futuro
En el futuro, las pantallas CRISPR combinadas
proporcionarán un conjunto completo de
genes esenciales en la mayoría de las líneas
celulares de cáncer.
Diseñar genéticamente el genoma del tumor
para inhibir el crecimiento y la proliferación
de las células tumorales e inducir más
necrosis y apoptosis, o para aumentar la
sensibilidad de las células tumorales a la
radioterapia y algunos quimioterapéuticos.
Diseñar genéticamente el genoma de las
células inmunitarias para aumentar
la secreción de citoquinas tóxicas, o para
rescatar a las células inmunitarias de la
inhibición funcional.
Diseñar genéticamente células normales, por
ejemplo, células de la médula ósea, para
protegerlas de los efectos tóxicos de la
radioterapia y la quimioterapia.
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