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ARTIGO

Atividade antiinflamatória da Arnica montana1

Anti-inflammatory activity of Arnica montana


Fabricio Yui2
Maria Conceição Barbosa Linarelli'
Paulo Mário Zelante4
I

RESUMO

Devido a quase inexistência de estudos com relação a Amica ao nível sistêmico, este estudo visa compro-
var a atividade allliinflamatória da Amica mOlltalla. A solução de Amica mOlltalla utilizada neste expe-
rimento foi obtida a partir da tintura de Arnica. Foram utilizados 88 ratos Wistar, adultos (150-200g), e
foram divididos em três grupos recebendo, por via oral o volume de 0,2ml/100g, para o grupo controle:
água destilada com Tween, utilizado na diluição da solução de Amica; 110grupo experimelllal: solução
de Amica mOlltalla( IOmg/ml) na dose de 20mg/kg; no grupo colllrole positivo: corticóide (Betametazona)
na dose lmg/kg. Após 60 minutos de tratamento foi medido o deslocamento da coluna de mercúrio,
provocado pela imersão da pata posterior direita do rato até o maléolo lateral. A formação do edema,
provocado pela administração de O,lml de formol foi avaliada também por deslocamento da coluna de
mercúrio, nos tempos: 30, 60, 120, 180 e 240 minlllOS após a injeção do agente flogístico. Os resultados
foram expressos como as diferenças de volume deslocado entre o tempo zero e os tempos subseqÜentes. A
Amica mOl/talla mostrou atividade antiinflamatória qual/do provocou redução do edema da pata do rato
provocado pelo formol em relação ao grupo controle da ordem de 49,2; 40,6; 37.5; 37,9 e 33,7% aos 30,
60, 120, 180 e 240 minutos respectivamente após a indução do edema. Esta ação foi menor do que a do
corticóide, na primeira hora (73%) e praticamellle igual nas horas subseqÜentes (9/,97 e 90%). Pôde-se
observar ainda, que os animais apresentaram WII comportamento semelhante ao grupo controle, não
demonstrando efeitos tóxicos da Amica na dose utilizada..
Unitermos: arnica montana, antiinflamatórios, extratos vegetais, plantas medicinais.

ABSTRACT

A researchwasconducted to confirmthe allli-inflamatoryactivity ofAmica mOlltalla.TheArnica mOl/tana


sollllion used was obtained from Amica tincture. This stud)' used 88 Wistar rats, male and adu/ts (/50-
-200g), which were separated in three groups. Each group received oraU)'0.2m//100g (volume by rat
weight); the control group received distiUed water with Tween (used to dilute the Amica solution); the
experimental group received Amica mOlltalla sollllion (100mg/ml) in the dose of 20mg/kg; the positive
I
control group received corticoid (betamethasone) in the dose of lmg/kg. The dislocation ofthe mercury
column, caused by the immersion of the right posterior foot of the rat until the lateralmaUeolus, was
measured after 60 minutes of treatment. The edema caused by the administration ofO.l ml offormaldehyde
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Coordenadoria de Estudos e Apoio à Pesquisa (CEAP) - PUC-Campi-
(I) Trabalho apresentado na 1Il Jornada Paulista de Plantas Medicinais na nas.
UNICAMP, em outubro de 1997.
(I, Professora Adjunta, Coordenadora do Laboratório de Farmacologia
'" Acadêmico do 4" ano do curso de Medicina, Monitor da Disciplina de da Faculdade de Ciências Médicas da Puc-Campinas.
Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas, Bolsista da (4)Pesquisador convidado pela Disciplina de Farmacologia.

ReI'. Ciênc. Méd., Campinas, 7( 1), 21-26, janeiro/abril 1998


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22 F YUI <I. aI.

lVas evaluared by mereury dislo('(llion aI lhe fol/owing limes: 30, 60, 120, 180 and 240 minUles afler
formaldehyde injeeliol1. The resull.\' lI'ere expressed by lhe dijferenee ofvolume disloeation belween zero
lime and subsequenl limes. The Amica mOlltalla showed anli-inflamalory aelivilY, eausing reduelion of
lhe ral fool edema produeed by formaldehyde. in relalion 10 eonlrol group: 49.2, 40.6. 37.5. 37.9 and
33.7% aI 30, 60. /20, /80 and 240 minllle.f respeelively after lhe edema induelion. Comparison afler one
hour showed lha I eorlicoid Irealmenl lVas belter Ihan lha I lVilhArllica mOlltalla (73%). IVhereas afler Ihis
period lhe effeel observed was similar (9/, 97 and 90%). /1 was also ob.ferved Ihal lhe animais sllOlVed a
behavior similar 10 lhe eonlrol group. No loxie effeel.f of Amica. in lhe dose used, were deleeled.
Keywords: amiea monlana, anli-inflamalory age/lIs, piam eXlraels. medicinal planls.

INTRODUÇÃO sinônimos científicos são: Caltha alpina. Chl}'santhemlll/


latif.. Ptamica montana4.fi.9.
o uso de plantas para curar doenças e alterar a mente
data de longo tempo. O papirus de Ebers ( 1500 a.c.) registrou Em estudos recentes encontram-se referências a
mais de 700 prescrições para várias doenças e, algumas dessas composição do extrato preparado a partir de rizomas ou flores,
substâncias, depois de longos estudos, tiveram seus princípios e as ações que estas substâncias possam ter isoladamente,,,.x.l?
ativos isolados e utilizados na terapêutica. Normalmente estes Como é o caso dos f1avonóides que parecem interferir nas
estudos iniciam-se com base em informações históricas e propriedades funcionais em células de mamíferos como por
populares, e é de fundamental importância tanto na descoberta exemplo: mastócito, basófilo. linfócito, músculo liso e
de novos medicamentos (isolando-se os princípios ativos), plaquetasll. Alguns autores crêem que, com base nestas
como também no aspecto que envolve o consumo de interferências, estes compostos possam apresentar atividades
"remédios" caseiros. Este consumo é uma realidade e vem antiinflamatórias, antialérgicas, antivirais e
crescendo e segundo dados da Organização Mundial de anticarcinogênicas13.15.2l.
Saúde, 80% da população de países em desenvolvimento se Devido a quase inexistência de estudos em relação a
tratam com técnicas de medicina popular, e desse total, 85% arnica em nível sistêmico, este estudo tem como objetivo
usam extrato de plantas medicinais. No Brasil existem mais avaliar a eficácia antiinflamatória do extrato da Arnica
de 127 mil espécies diferentes de plantas sendo que algumas monfana, por meio de um estudo comparativo com a
são utilizadas para fins medicinais na cura de certos males Betametazona, um corticóide de ação prolongada com
através de chás, pós e raízes. Para evitar o uso irresponsável capacidade de reduzir acentuadamente ou suprimir os sinais
e sem controle, pois folhas e raízes também têm efeitos típicos do processo inflamatório, quando administrado por
colaterais e toxicidade, a pesquisa de plantas com potencial via orallo.l4.22.
terapêutico pode respaldar ou desaconselhar este uso que
poderá apresentar vantagens sobre os fármacos utilizados na
terapêutica. CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO
A A mica montana tem sido empregada na terapêutica DE ARNICA MONTANA
para distensões, hematomas, inchação dolorosa, entorses e
ferimentos em geral; para estes propósitos os extratos das
Identificaram-se diversos dos seus constituintes:
flores e outras partes da planta tem sido empregada
inulina, glicose, taninos, resinas, ceras, um óleo do qual se
topicamente ou na forma de tintura2.9.Embora considerada
isolaram os ácidos linoléico, linolénico, mirístico e palmítico;
um remédio popular, aAmica do campo demonstrou ter maior
hidrocarbonetos parafínicos, ácidos diversos (fórmico,
efeito cicatrizante que outras plantas quando comparada
angélico, málico, caféico, gálhico); um princípio amargo e
experimentalmente. Uma ação estimulante, que justifica seu
acre, cristalino e não azatado, conhecido por arnicina, mais
emprego no tratamento das paralisias conseqüentes de lesão
abundante nas flores do que nos rizomas; colona, vários
cerebral ou medular e mesmo para combater a fadiga e a
estafa que sobrevêm depois dos exercícios físicos, também carotenóides: isolaram-se dois dióis triterpenóides do grupo
já foi descritaL9. taraxastano, insaturados, isoméricos pela posição das duplas
ligações e pela epimeria dos hidroxilos, o arnidiol (ou
A Amica montana L. é uma planta herbácea perene, arnisterina e arnidendiol) e o faradiol (ou isso-arnidendiol),
que pertence à Família das Compostas Tunifloras'H. É uma extraídos depois de muitas outras compostas de flores
planta vivaz que se constitui de rizama; haste simples; folhas amarelas (Tllssilago faifara L., Taraxacllm officinale Weber.
ovais, de cor verde claro, reunidas em rosetas na base da Calendula officinalis L., e outros); também foi encontrada a
haste e flores em inflorescência, solitárias, amarelas. Seus sitosterina e uma outra detona-esterina desconhecida.

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ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA ARNICA MONTANA
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Isolaram-se, por cromatografia em papel, três b) Preparação da solução experimental


heterósidos flavonílicos, a isoquercitrina, o quercetol-3
glucogalacturónido e a astragalina (campferol-3-glicósido)
e alguns derivados de núcleo cromona ou benzo-g-pirona, A solução de Arnica mOl/fana utilizada neste
como a eugenina (2-metil-5-hidroxi-7-metoxicromona) e experimento foi obtida a partir da tintura de Arnica
outros com estruturas semelhantes. (Laboratório Catarinense S.A. ). Após pesar um bécker seco,
pipetou-se 40ml da tintura de arnica (descrição acima) sem
Finalmente, possuem essência, em proporção diversa,
tocar no bécker, sendo este deixado por 12 horas em estufa
mais abundante nos rizomas (0,5 a 1,5%) do que nas flores
40°C para secagem. O extrato seco, cuja massa foi avaliada
(0,04 a 0,14%). A das flores, ainda pouco estudada, contém
ésteres metílicos dos ácidos fórmico, butírico, valeriânico, através de nova pesagem do bécker, foi diluído com água
laurico, palmítico, acético e isobutírico e a dimetiltimo- destilada e 4 gotas de Twenn (solvente ) em solução contendo
-hidroquinona. Lembrando que na flor foram achados também IOmg/ml.
d
arnicina, glucose, amisterina, arnicaína (alcalóide), fitosterina,
ácidos málico e tâmico. A essência dos rizomas, melhor
conhecida, encerra também o éter dimetílico da timo- Procedimento experimental
.~
-hidroquinona, cerca de 80%, e o éster isoburírico do florol,
cerca de 20%; ainda em quantidades muito pequenas, o éter
Para este ensaio foram utilizados 88 ratos Wistar,
metílico do tlorol. Também formam constituintes como a
adultos, pesando entre 150 e 200g, obtidos nos biotérios da
inulina, ácido acético, málico e tânico e matérias resinosas.
Puc-Campinas e da USP.
Do rizoma da arnica isolaram, há pouco, por
Os animais foram divididos em três grupos: o grupo
cromatografia em colunas de óxido de alumínio, o timol e
controle recebeu por via oral (Y.O.) o volume deO,2mVIOOg
alguns dos seus éteres, como o metil-timol. o éter dimetílico
do 6-hidroxitimol e o seu Ds(~)-desidroderivado; ainda, o 3- de rato do veículo (água destilada com Tween) utilizado na
-etil-fenol e um outro fenol desconhecido. E entre os diluição da solução de Arnica; o grupo controle positivo
compostos característicos da Compostas referem-se: recebeu, por Y.O., o mesmo volume/peso de Betametazona
trideca-l-eno-3,5,7 ,9, I I-penta-ino, trideca-3,5,7 ,9, I 1,- (solução de 0,5mg/ml) na dose de Img/kg; e o grupo
-penta-ino-2-ona e trideca-I, II-dieno-3,5,7,9-tetra-inofi.lx.2o. experimental recebeu, também por Y.O., o mesmo volume/
peso da solução de Amica monfana (IOmg/ml) na dose de
20mg/kg. Após 60 minutos do tratamento, foi medido o
MATERIAL E MÉTODOS deslocamento da coluna de mercúrio, provocado pela imersão
da pata posterior direita do rato até o maléolo lateral, em um
Preparação da Arnica montana recipiente maior com graduação por ml, contendo mercúrio,
conectado por um sistema de vasos comunicantes a um outro
a) Obtenção da tintura de Arnica recipiente menor com graduação de O,Iml. Depois de
adequado o volume de mercúrio do recipiente maior, na
Arnica, flores, em pó (I) (200g) mesma graduação anterior a imersão, foi medido o
Álcool diluído (Q.S.) deslocamento no menor, registrando o volume exato da pata
Para obter 1000cmJ. do rato. Após esta medição foi injetado na região subplantar
da pata posterior direita O,Iml de formalina 5% (um agente
Umedeça a planta com 500cmJ do álcool diluído, flogístico) e medido o deslocamento imediatamente após esta
introduza-a num percolador e, sem comprimir, bem tampado, administração (tempo zero). A formação do edema provocado
deixe em repouso, durante 24 horas; comprima então foi avaliada também por deslocamento da coluna de mercúrio,
moderadamente e proceda vagarosamente à percolação, registrando as variações de volume mediante a imersão das
adicionando mais álcool diluído; quando o percolato medir patas dos animais no recipiente maior nos seguintes tempos:
250cmJ suspenda o escoamento, faça macerar a planta mais 30; 60; 120; 180 e 240 minutos após a injeção do agente
12 horas e depois recolha mais 250cmJ de percolato; faça flogístico. Os resultados foram expressos com as diferenças
mais uma vez macerar a planta durante 12 horas e continue de volume deslocado, pela pata, entre o tempo zero
vagarosamente a percolação adicionado mais álcool diluído, (imediatamente após a administração de formalina na região
até obter IOOOcmJde tinturafi. subplantar da pata) e os tempos subseqüentes19.

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RESULTADOS do agente flogístico: na presença (experimental e controle


positivo) ou não (controle) das substâncias administradas
o sistema de deslocamento da coluna de mercúrio,
previamente (60 minutos antes). Portanto, considerou-se os
registrou as variações do volume ocupado pela imersão da
resultados obtidos nos animais controles como uma reação
pata do animal (sempre a mesma). No experimento, o tempo
inflamatória normal à formalina (diferença entre a pata normal
zero foi considerado imediatamente após a injeção subplantar
e a pata com inflamação em diferentes tempos), e os resultados
de formalina,já que a diferença obtida antes da administração
apresentados com os animais do controle positivo
de formal e após a administração de formol foi de O,Iml
(Betametasona) e experimental (Amica) como o resultado
(volume injetado), considerando, portanto, a ausência de
entre a agressão. do agente flogístico, e a ação das substâncias
reações ao agente neste tempo.
administrada previamente.
Os deslocamentos provocados pela pata nos tempos
subseqüentes: 30; 60; 120; 180 e 240, foram considerados Os resultados apresentados na Tabela I e na Figura I
como o edema resultante, na pata do animal, pela agressão abaixo, demostram que este edema foi menor na presença do

Tabela 1. Médias de descolamenlo da coluna de mercúrio em em', obtidas a partir do deslocamento provocado pelo edema formado na pata do rato.
(diferenças de volume deslocado, pela pata, entre o tempo zero: imediatamente após a administração de formalina na região subplantar da pata,
e os tempos subseqüentes),

Tempo (em minutos) Zero 30 60 120 180 240


Controle O 0,4426 0,6796 0.9185 1.0259 1,0519
Arnica O 0,2250 0,4039 0.5737 0.6368 0,6974
Corticóide O 0,1478 0,3065 0.5435 0,6261 0.6522

Tabela 2. Porcentagem de redução do edema da pata de rato em relação ao grupo controle.

Tempo (em minutos) Zero 30 60 120 180 240


Arnica o 49,16 40.56 37.54 37,92 33.70
Corticóide O 66,60 54,89 40,82 38.97 37.99

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O 0.5 2 3 4

tempo (h)

Figura 1. Curva comparativa do grupo AmiclI IIwlllllllll com os grupos controle e corticóide (dados da tabela I).

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corticóide e na presença da Arnica montana, em relação ao sugere que a ação antiinflamatória possa estar relacionada a
controle, ou seja, o edema formado no animal controle foi diferentes mecanismos ou mesmo a diferentes mediadores.
significativamente maior que nos grupos controle positivo e
experimental. Na Tabela 2, observou-se a porcentagem de
· As substâncias responsáveis pelas ações
antiinflamatórias foram eficientemente absorvidas por via
redução do edema provocados pela Arnica e pela
oral, já que na dose administrada observou-se eficácia
Betametazona em relação ao grupo controle, ou seja, quanto
antiinflamatória inclusive nos tempos iniciais.
menor foi (em porcentagem) o edema formado nos animais
controle positivo e experimental em relação aos animais
controle.
· A dose de Arnica empregada não provocou efeitos
tóxicos (nem excitação, nem depressão do Sistema Nervoso
Central) já que os animais apresentaram, durante todo o
Observou-se ainda que estes animais, administrados
experimento, um comportamento normal, semelhante ao do
com Arnica, apresentaram, durante todo o experimento, um
grupo controle.
.,
comportamento semelhante ao apresentado pelo grupo
controle e controle positivo, não demonstrando alterações
comportamentais, e macroscopicamente não foram
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
observadas alterações fisiológicas que não as provocadas pelo
...
estresse (manipulação) e que foram semelhante às observadas I. ACCORSI, WR., BARROS, M.A.A., ROCHELLE,
nos dois grupos controles. L.A. Apontamentos sobre plantas tóxicas e
medicinais.Piracicaba, 1982.p.96. Promovidopelo
Departamento de BotânicaJESALQ/USP.
DISCUSSÃO\
2. ARNICA montana dans les traumat de Ia face.Anuário
O processo inflamatório envolve um grande número Oto-Laryng, Paris, n.I-2, p.94. 1976.(Seance Du).
de mediadores químicos e cada aspecto da resposta
(vasodilatação, aumento da permeabilidade, acúmulo de
3. BUSSE, WW, KOPP, D.E., MIDDLETON IR, E.
células, etc.) pode ser produzido por um mecanismo diferente. Flavonoid modulation of human neurotrophil
Os corticóides inibem as manifestações tanto iniciais quanto function. J Allergy Clin Immunol, St. Louis, v.73,
tardias do processo, reduzindo todos os tipos de resposta à
p.801-809, 1984.
inflamação,inclusivepor estímulosquímico11>.22, sendo 4. CAIRO, N. Guia de medicina homeopatica.21.ed.São
portanto um bom padrão de comparação para os estudos Paulo: Livraria Teixeira, 1988. p.168-172.
iniciais sobre a atividade antiinflamatória daArnica montana.
5. COCHET, C. et aI. Selective inhibition of a cyclic
A Arnica tem na sua composição química flavonóides nucleotide independent protein kinase (G type
como demonstrado por cromatografia em papel. Flavonóides caseinkinase)by quercetinandrelatedpolyphenols.
podem alterar as propriedades funcionais de certas células Biochem Pharmacol, Oxford, v.31, p.1357-1361,
como: mastócitos, basófilos, músculo liso ou plaquetas7. Estas 1982.
alterações ocorrem através da interferência com um grande
6. COSTA,A.E Farmacognosia.5.ed. Lisboa: Fundação
número de sistemas enzimáticos, principalmente nas enzimas
Calouste Gulbnkian, 1994. v.l, p.752-755.
que participam da formação dos mediadores do processo
inflamatório, como é o caso da Fosfolipase A2, Fosfolipase 7. CRAKER, L., SIMON, E., LANES E. Herbs, spices,
C, lipo e ciclooxigenase1ó.17. and medicinal plants: recent advances in botany,
horticulture, and pharmacology. New York : Orix
Estes resultados sugerem para o extrato de Arnica
Press, 1988. v.3, p.103-144.
uma atividade antiinflamatória e nos permite as seguintes
conclusões: 8. DAVIS, EB., MIDDLETON IR., E., DAVIS, P.J.,
· O uso da Arnica montana mostrou eficácia BLAS, S.D. Inhibition by quercetin of thyroid
hormone stimulation in vitro of human red blood
antiinflamatória, reduzindo o edema de pata de rato
provocado pela administração de formalina em relação ao celI Ca2+-ATPaseactivity. Cell Calcium,Edinburg,
grupo controle. Este efeito comparado ao do corticóide vA, p.71-81, 1983.
(betametasona) foi menor, mas não significativamente 9. DOMINGO NETO, A.L. Efeitos cicatrizantes e
diferente. antimicrobianos das plantas medicinais.
· O efeito supressor da Arnica se manteve durante
todo o experimento(semelhanteà ação do corticóide)o que
Piracicaba: UNICAMP, 1991.p.31,80. Dissertação
(Mestrado em Odontologia)-Unicamp, 1991.

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26 F. YUI <I. aI.

10. GOODMAN, L.S., GlLMAM, A.G. As bases 17. LEE, T.P.,MATIELIANO, M.L., MIDDLETON JR.
farmacológicas da terapêutica. São Paulo: E. Effectof quercetinon human polymorphonuc1ear
McGraw-Hill do Brasil, 1997. p.1086-1099. leukocyte Iysosomal enzyme release and
I\. GRYGLEWSKI, R.J., ROBAK, 1., SWIES, J. phospholipid metabolism. Life Sei, Oxford, v.20,
p.2765-2774, 1982.
Flavonoids lipoxygenases: platelet aggregation.
NATOAdvancedStudies lnstitutes. v.95,p.149-166, 18. MORGAN, R. Enciclopédia das ervas e plantas
1985. (Serie A). medicinais. São Paulo: Hemus, 1995. pA7.
12. HACKETT, A.M. Plant fIavonoids in biology and 19. PELEGATTI, I. et a\. Novo método para ensaio da
medicine: biochemical, pharmacological, and atividadede drogascom ação anti-inflamatória.Rev
structure-activity relationships. New York : Alan Farm Bioquim USP,São Paulo, v.8,n.2, p.I77-182,
R. Liss 1986. p.I77-194. 1970.
13. KATO,R.et a\. Inhibitionof2-0 etradecanoylphorbol- 20. SCHRODER, H. et a!. Helenalin and lia, 13-
-13-acetate-induced tumor promotion and rnithine -Didrohelenalin, two constituents from Arnica
decarboxylase activityby quercetin: possible Montana L., Inhibit Haman Platelet Function Via
involvement of lipoxygenase inhibition. Thiol: dependent path ways. ThrombosisResearch,
Carcinogenesis,New York,vA, p.130 1-1305,1983. Elmsford, v.57, p.838-845, 1990.
14. KATZUNG-BERTTRAN,G. Farmacologia básica e 21. WELTON, A.F. et a!. Effect of fIavonoids on
clínica. 5.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, arachidonic acid metabolism. In: CODY, VE.,
1994. p.198-208. MIDDLETON JR., E., HARBORNE, J.B. (Eds.).
Plant flavonoids in biology and medicine:
15. KAZIRO, G.S.N. Metromidazolie (fIagyl) and arnica
biochemical, pharmacological, and structure-
montana is the prevention of post-sugical
activity relationships, New York : Alan R. Liss,
complications a comparative placebo controlled
1986. p.23 1-242.
c1inicaltrial. Br J Oral Maxil-Fa Surg, Edinburg,
v.22, pA2-49, 1984. 22. ZANINI, O. Guia de medicamento. São Paulo:
Atheneu, 1995. p.104-108.
16. LANNI, c., BECKER, E.L. Inhibition of neutrophil
phospholipaseA2 by p-bromophenylacylbromide,
nordihydroguaiaretic acid, 5,8,11,14-
eicosatetrayenoic acid and quercetin. Inter Arch
Allergy Appllmmunal, Basel, v.76, p.214-217, Recebido para publicação em 31 de outubro de 1997 e
1985. aceito em 5 de maio de 1998.

Rev. Ciênc. Méd., Campinas, 7(1), 21-26,janeiro/abril 1998