BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara
vegetative dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta
menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang
kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya
sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi
tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan
tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media
buatan yang dilakukan di tempat steril (Soenarryowinoto, 1996).
Sebelum melakukan kegiatan praktikum kultur jaringan dalam laboratorium
tentu saja kita harus mengenal nama-nama, kegunaan, dan perawatan peralatan
yang ada di laboratorium kultur jaringan. Karena dalam praktikum kita banyak
menggunakan peralatan yang ada dalam laboratorium baik alat-alat gelas,
nongelas maupun peralatan mekanik. Berdasarkan hal tersebut di atas, perlu di
lakukan pengenalan alat-alat dalam kegiatan kultur jaringan. Dalam sebuah
praktikum keberhasilan dalam percobaaan pengamatan di tentukan oleh
kebersihan dan kesterilan alat yang kita gunakan, hal tersebut bertujuan
menghindari kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan penelitian yang
dilakukan dilaboratorium maupun untuk kejelasan dan ketetapan pengamatan.
Dalam sebuah praktikum, praktikan diwajibkan mengenal dan memahami cara
kerja serta fungsi dan alat-alat di laboratorium. Selain untuk menghindari
kecelakaan dan bahaya, dengan memahami cara kerja dan fungsi dari masing-
masing alat, praktikan dapat melaksanakan praktikum dengan sempurna
(Sulaiman, 2013).
Teknik kultur jaringan akan berhasil bilamana memenuhi persyaratan dalam
kultur jaringan yaitu media yang cocok, kondisi lingkungan yang sesuai dan
dalam kondisi aspetis atau steril. Dari persyaratan tersebut maka diperlukan
sterilisasi dalam melakukan kegiatan kultur jaringan. Menurut
Moeso Suryowinoto (2000) Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung
pada keadaan aseptic atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang

1
meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang digunakan,
pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur
jaringan.
Seluruh kegiatan kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Artinya,
seluruh bahan dan alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu.
Termasuk ruangan laboratoriumnya dan pekerja yang melakukan. Sterilisasi
ruangan biasanya dilakukan dengan menyalakan lampu UV selama beberapa
menit dan menyemprotkan alkohol 70 . Sementara itu alat dan bahan yang
digunakan disterilkan dengan memanaskan dalam autoclave atau direndam larutan
sodium hipoklorit (kloroks). Bagi para pekerja, sebelum melakukan aktivitas di
dalam laboratorium seluruh permukaan tubuhnya disemprot dengan alkohol 70%
(Ir.Sentot,2008 ).
Berdasarkan pemaparan tersebut, dapat diketahui bahwa pengenalan alat dan
sterilisasi sangatlah penting dalam kegiatan perkembangbiakan secara in vitro atau
melalui kultur jaringan. Hal tersebutlah yang mendasari mengapa praktikum
pengenalan alat dan sterilisasi peralatan ini dilakukan.

1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui dan
melaksanakan teknik sterilisasi alat yang benar untuk kegiatan in vitro.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Kultur Jaringan

Kultur in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman
seperti protoplasma, sel, jaringan, atau organ yang steril, ditumbuhkan pada
medium buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang
aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan
beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Secara teori, perbanyakan tanaman
melalui kultur in vitro dapat dibedakan menjadi dua, yaitu Organogenesis atau
perbanyakan melalui tunas-tunas baru dari tunas axilar, serta secara
Embriogenesis somatik, yaitu pembentukan tunas adventif dan embrio somatic
adventif. Pembentukan tunas adventif maupun embrio somatik dapat melalui cara
morfogenesis langsung maupun tidak langsung (Nisa dan Rodinah, 2005).
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara
vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara
mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-
bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat
pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian
tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap.
Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan
menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang
dilakukan di tempat steril (Soenaryowinoto, 1996).
Dalam kultur jaringan terdapat beberapa aspek yang berpengaruh terhadap
keberhasilan perbanyakan tanaman, antara lain keseimbangan zat pengatur
tumbuh yang terkandung dalam media. Keseimbangan zat pengatur tumbuh yang
terkandung dalam media menentukan arah suatu kultur. Auksin dan sitokinin
merupakan zat pengatur tumbuh yang sering digunakan dalam kultur jaringan.
Auksin dan sitokinin dalam keseimbangan yang tepat berpengaruh terhadap
organogenesis (Winarsih dan Priyono, 2000). Selain faktor dalam yang
mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan, faktor luar juga sangat berpengaruh,
seperti yang dikatakan Widiastoety et al., (2004) bahwa keberhasilan

3
pertumbuhan sel, jaringan dan organ pada kultur in vitro sangat dipengaruhi oleh
hubungan timbal balik antara tanaman dan faktor lingkungan, seperti komposisi
dan pH media, cahaya, suhu, kelembaban, dan kadar oksigen, selain itu,
ketekunan pengalaman dan keahlian serta sarana yang memadai dapat
meningkatkan persentase jaringan yang tumbuh.
Perbanyakan secara in vitro dapat menghasilkan tanaman dengan sifat sama
seperti induknya, pembiakan ini termasuk pembiakan secara vegetatif, yaitu
individu baru terjadi dari bagian tubuh suatu induk. Oleh karena itu, individu yang
baru terbentuk mempunyai sifat yang sama dengan induknya. Perbanyakan
tanaman dengan teknik ini membuat tanaman bebas dari penyakit karena
dilakukan secara aseptik. Beberapa keuntungan yang lain dari perbanyakan kultur
in vitro antara lain: perbanyakan generatif dan vegetatif yang cepat dan efisien,
mempermudah seleksi mutan, menghindari sterilitas yang menghambat
hibridisasi, produksi tanaman bebas pathogen dan sebagai pelestarian plasma
nutfah (Widiastoety et al, 2004 ).

2.2 Pengenalan Laboratorium Kultur Jaringan

Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari ruangan-ruangan yang
dipisahkan berdasarkan fungsinya, yaitu ruang persiapan (preparation area), ruang
penanaman (transfer area), ruang pertumbuhan (growing area). Seberapapun
luasnya laboratorium, ketiga ruang tersebut harus ada. Ketiga ruang di atas juga
harus terpisah dari kebun bibit dan green house untuk menghindari masuknya
kontaminasi ke dalam ruang kultur. Kebersihan lantai, meja dan kursi harus terus
dijaga secara intensif (Hartman dkk, 1997).
1. Ruang Persiapan (preparation area)
Ruang persiapan merupakan ruangan yang mempunyai 3 fungsi dasar
yaitu untuk membersihkan alat-alat (alat-alat gelas seperti petri, botol, dll),
persiapan dan sterilisasi media, dan penyimpanan alat-alat gelas. Sebuah bak
untuk mencuci yang dilengkapi dengan kran untuk aliran air mengalir juga
diperlukan untuk membersihkan alat-alat berbahan gelas. Selain itu diperlukan
meja yang permukaanya dilapisi dengan bahan yang mudah dibersihkan.
Peralatan selanjutnya yang digunakan dalam ruang preparasi adalah lemari es

4
 untuk menyimpan larutan stok dan beberapa media, timbangan analitik,
autoclave, pH meter, magnetic stirrer, destilator (Hartmann dkk., 1997). Selain
alat di atas, ruangan ini juga dilengkapi dengan alat-alat seperti Hot
plate dengan magnetic stirer,Oven, pH meter , kompor gas, labu takar, gelas
piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur,
pisau scalpel
2. Ruangi Penanaman (Transfer area)
Ruang penanaman merupakan ruang yang digunakan untuk isolasi,
inokulasi dan subkultur (penjarangan) pada kondisi steril yang di dalamnya
terdapat lemari kaca atau kabinet yang disebut Laminar
Airflow (LAF). Laminar Airflow ini digunakan untuk pemotongan eksplan,
melakukan penanaman dan subkultur. Akan tetapi jika tidak ada LAF yang
memadai, tahap isolasi (pemotongan eksplan) dapat dilakukan di antara kertas
saring steril. Sangat dianjurkan untuk menggunakan jas laboratorium yang
bersih selama tahap persiapan dan mensterilkan tangan dengan alkohol 96%
(Pierik, 1987). Alat-alat seperti scalpel, gunting dan alat-alat inokulasi lainnya
harus disterilkan dengan alkohol 96% dan dilanjutkan dengan pemanasan di
atas api bunsen. Lampu ultraviolet (UV) juga digunakan untuk mensterilkan
ruang, sebelum LAF digunakan. Pemotongan eksplan juga dilakukan di dalam
LAF yang kemudian dilanjutkan dengan beberapa tahapan sterilisasi sebelum
ditanam pada media kultur.
3. Ruang pertumbuhan atau Inkubasi (Growing area)
Growing area merupakan ruang pertumbuhan atau ruang penyimpanan hasil
kultur pada kondisi cahaya dan temperatur yang terkontrol. Ruang
pertumbuhan ini terdiri dari rak-rak yang biasanya terbuat dari kaca dan
digunakan untuk meletakkan botol-botol kultur setelah proses penanamanan
pada ruang isolasi di dalam LAF. Rak-rak yang digunakan untuk inkubasi
dilengkapi dengan lampu neon di atasnya sebagai sumber cahaya. Sedangkan
ruang pertumbuhan dalam kultur jaringan dilengkapi dengan Air
conditioner (AC) untuk mengontrol suhu ruang (Hartmann dkk., 1997).

5
2.3 Peralatan dalam Kultur Jaringan
Alat-alat yang diperlukan dalam metode kultur jaringan tumbuhan diantaranya
: Gelas ukur, erlenmeyer, petridish, hotplate, timbangan analitik, botol-botol gelas,
oven, magnetic stirrer, destilator, autoclave, lemari es, laminar airflow,
pinset, scalpel, spatula, rak inkubasi, bunsen, aluminium foil, karet, plastik
gulung, batang pengaduk kaca dll, Berikut adalah penjabarannya :
1. Mikropipet (Micropippete) dan Tip
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan
yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000
μl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya
mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya
(adjustable volume pipette) antara 1μl sampai 20 μl, atau
Gambar 1. Mikropipet
mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya
tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 μl.
dalam penggunaannya, mukropipet memerlukan tip (Sulaiman, 2013).
2. Hot plate stirrer dan Stirre bar
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)
berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan
pengadukan. Dalam kultur jaringan berperan untuk
menghomogenkan senyawa-senyawa dalam media kultur
dan untuk memanaskan media padat (agar). Pelat (plate)
Gambar 2. Hot
yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat
Plate dan
proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot Stirre Bar
plate
dan magnetic stirrer misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan
kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai
425oC. Prinsip kerjanya menyimpan beaker glass atau labu erlenmeyer yang
berisi cairan atau larutan yang akan dihomogenkan diatas plat alat ini
(Sulaiman, 2013).
3. Oven
Oven Berfungsi untuk sterilisasi kering dan oven
biasanya digunakan untuk mengeringkan alat-alat sebelum
digunakan dan digunakan untuk mengeringkan bahan yang

Gambar 4. Oven
6
 dalam keadaan basah alat-alat yang disterilkan menggunakan oven antaralain
peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dll. serilisasi kerning dengan
oven dilakukan dengan cara memanaskan dengan suhu 180 oC selama 1 jam
(Sulaiman, 2013).
4. Timbangan digital / neraca digital
Neraca digital berfungsi untuk menimbang media dan juga sample atau
contoh uji saat preparasi (Sulaiman, 2013)
5. Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)
Berfungsi untuk menampung larutan, bahan
atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk
meracik dan menghomogenkan bahan-bahan
komposisi media, menampung akuades dll. Terdapat
beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang
dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml Gambar 5.
Erlenmeyer
300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb. Prinsip kerjanya yaitu
dengan menuangkan larutan atau zat kimia secara langsung atau menggunakan
corong dengan hati-hati. Labu ini memiliki bagian yang lebar di bawah dan bagian
yang agak sempit (menyempit) pada bagian atasnya (Abdullah, 2006).
6. Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki
banyak fungsi. Dapat digunakan untuk preparasi
media-media, menampung akuades dll. Prinsip
kerjanya yaitu dengan menuangkan larutan atau cairan Gambar 6.
Beaker Glass
kedalam beaker glass ini. Alat ini terbuat dari kaca
borosilikat yang tahan terhadap panas hingga suhu 200 C. Ukuran alat ini ada
yang 50 mL, 100 mL dan 2 L. Gelas beaker adalah sebagai tempat untuk
melarutkan zat yang tidak butuh ketelitian tinggi, jadi tidak cocok untuk
pembuatan larutan yang perlu ketelitian tinggi (secara kuantitatif) (Abdullah,
2006).
7. Gelas ukur (Graduated Cylinder)
Berguna untuk mengukur volume suatu cairan,
seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa

7 Gambar 7.
Gelas Ukur
 pilihan berdasarkan skala volumenya. Prinsip kerjanya yaitu dengan
menuangkan larutan atau cairan zat kimia secara langsung dengan berhati-hati.
Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan
berdasarkan menuskus cekung larutan. Pada saat praktikum dengan ketelitian
tinggi gelas ukur tidak dianjurkan untuk mengukur volume larutan.
Pengukuran dengan ketelitian tinggi dilakukan menggunakan pipet volume
(Abdullah, 2006).
8. Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri terdiri cawan bagian bawah dan
cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri
tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter
cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat
menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan
Gambar 8.
cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media seba Cawan Petri
nyak 10 ml. Prinsip kerja cawan petri selalu berpasangan, yang ukurannya agak kecil
sebagai wadah dan yang lebih besar merupakan tutupnya. Prinsip kerjanya yaitu
medium dapat dituangkan ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas
sebagai penutup (Abdullah, 2006).
9. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)
Salah satu alat yang berfungsi untuk
menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar
bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran
udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola
aliran udara tersebut. Perubahan bunsen dapat Gambar 9.
menggunakan bahan bakar gas atau metanol. Prinsip Pembakar Bunsen
kerjanya yaitu dengan menyalakannya dengan membakar bagian sumbu (pada
pembakar spirtus) dengan korek api atau dengan memberiapi pada bagian atas
(dari pembakar bunsen yang berbahan bakar gas) (Abdullah,2006).
10. Pinset (Forcep)
Alat ini berfungsi sebagai alat pembantu
dalam mengambil preparet segar agar tidak

8 Gambar 10. Pinset

 terkontaminasi. Alat ini terbuat dari besi. Prinsip Kerja Prinsip kerjanya adalah
menjepit benda yang akan diambil atau dipindahkan (Abdullah,2006).
11. Spatula
Spatula merupakan berupa sendok panjang dengan
ujung atasnya datar, terbuat dari stainless steel atau
alumunium. Alat untuk mengambil obyek. Spatula yang
sering digunakan di laboratorium biologi atau kimia
berbentuk sendok kecil, pipih dan bertangkai. Fungsi Gambar 11. Spatula
spatula ini untuk mengambil bahan kimia yang berbentuk padatan atau bias
juga dipakai untuk mengaduk larutan (Abdullah,2006).
12. Magnetic Stirrer
Alat ini digunakan untuk membantu dalam proses
pengadukan suatu larutan. Batang-batang magnet
diletakan di dalam larutan kemudian disambungkan arus
listrik maka secara otomatis batang magnetik dari stirer
Gambar 12.
akan berputar (Abdullah,2006).
Magnetic Stirrer
13. Laminar air Flaw (LAF)
Kabinet yang digunakan untuk isolasi, inokulasi
dan subkultur. Laminar air-flow cabinet ini harus steril
dan bebas dari debu yang dilengkapi dengan UV,
lampu neon dan blower. putih. Prinsip Kerja Prinsip
kerja dari alat ini yaitu membunuh dan menghilangkan
bakteri yang terbawa atau terapung diudara pada suatu Gambar 13. Laminar air
Flaw (LAF)
ruangan untuk menciptakan suasana ruangan yang steril. Fungsi
Alat ini berfungsi untuk mensterilkan suatu ruangan yang akan digunakan
untuk percobaan agar tidak ada kontaminasi bakteriyang terdapat diudara
(Handayani, 2009).
14. Autoklaf
Autoklaf adalah perlatan sterilisasi panas basah
yang menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan
yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2
atm dan dengan suhu 121°C (250°F). Bahan yang

9 Gambar 14.
Autoklaf
disterilisasi dimaaksudkan agar kelak tidak ada kontaminasi. Medium yang
akan disterilkan ditempatkandi dalam autoklaf selama 15-20 menit, hal ini
bergantung pada banyak sedikitnya barang yang disterilkan. Perhitungan
waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai
121°C. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel
reisten yang muncul pada bakteri untuk pertahanan diri dilingkungan yang
kurang baik. Sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotic
(Handayani, 2009).
Cara Penggunaan Autoklaf ini adalah :
1) Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai
batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya
kerak dan karat.
2) Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol tertutup ulir, maka
tutup harus dikendorkan
3) Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada
uap yang keluar dari bibir autoklaf. klep pengaman jangan dikencangkan
terlebih dahulu.
4) Nyalakan autoklaf, di atur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu
121oC
5) Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen
autoklaf dan terdesak keluar klef pengaman. Kemudian tiap pengaman
ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Perhitungkan waktu 15
menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm
6) Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam
kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan
(jarum pada pressure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep
pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati (Zumrona,
2012).

10
2.4 Metode Sterilisasi dalam Kultur Jaringan
Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda
dari segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus).
Sterilisasi adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan.
Sterilisasi ini meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media
tanam, dan sterilisasi eksplan.
1. Sterilisasi Ruang
Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang
digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak
terlalu besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi
ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai
dengan kain pel yang dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini
mutlak dilakukan menjelang ruang inokulasi akan digunakan. Lampu
ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi ruang, dan biasanya selalu
dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta dimatikan saat
masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).
2. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan
laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan
alkohol 70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan
juga dinyalakan selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di
permukaan laminar. Hal serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan
penanaman atau inokulasi. Laminar harus tetap dijaga kebersihannya (Edhi
Sandra, 2013).
3. Sterilisasi Alat dan Media
Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat
disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan
dengan autoclave pada temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit,
sedangkan sterilisasi bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat
seperti pinset dan scalpel selain disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan
dengan pembakaran di atas api bunsen. Botol-botol yang akan disterilisasi
sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau plastik dan diikat dengan

11
 karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30 menit (Edhi
Sandra, 2013).
4. Sterilisasi Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat
berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah
dikulturkan, misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan
berbeda, tergantung pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan,
morfologi permukaannya, umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau
sehat pada saat pengambilan), musim saat pengambilan, dan lingkungan
tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi eksplan adalah mensterilkan dari
kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan eksplannya (Edhi Sandra,
2013).

2.5 Macam-Macam Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang
terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara yang umum digunakan
dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia dan
penyaringan (Filtrasi) (Hadioetomo, 1993).
Macam-macam sterilisasi (Machmud, 2008), Pada prinsipnya sterilisasi dapat
dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi)
Sterilisasi cara ini menggunakan suatu saringan
yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45
mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan
tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan
yang peka panas, misal nya larutan enzim dan
antibiotic dan cara kerja dari sterilisasi ini berbeda
Gambar 15. Saringan
dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan Alat
mikroorganisme
Sterilisasi Mekanik
melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut.
Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks
pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat
melaluinya.

12
 Metode sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau
bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara
sterilisasi lain. Ukuran nominal pori penyaring 0,2 μm atau kurang dan
penyaring dibuat dari berbagai jenis bahan seperti selulosa asetat, selulosa
nitrat, florokarbonat, polimer akrilik, polikarbonat, poliester, polivinil klorida,
vinil, nilon, politef, dan berbagai tipe bahan lain termasuk membran logam.
Larutan dapat dibebaskan dari organisme vegetatif dan spora bakteri dengan
melalui filter bakteri, filter bakteri tidak membebaskan larutan dari virus.
2. Sterilisasi fisik
Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran.
 Pemanasan
a. Pemijaran langsung
Pemijaran langsung digunakan untuk
mensterilkan spatula logam, batang gelas, pinset,
jarum inokulum, mulut botol, vial, dan labu ukur,
gunting, jarum logam dan kawat, dan alat-alat lain
yang tidak hancur dengan pemijaran langsung.
Papan salep, lumping dan alu dapat disterilisasi Gambar 16.
Pembakar Bunsen Alat
dengan metode ini. Metode ini dapat dilakukan
Sterilisasi Fisik
dengan membakar langsung alat pada api. Alat yang
digunakan untuk sterilisasi yaitu pembakar bunsen (Handayani, 2009).
b. Sterilisasi panas kering
Selama pemanasan kering,
mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi.
Ini berlawanan dengan penyebab kematian
oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang
terjadi dengan sterilisasi uap panas. Pada
umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu
Gambar 17. Oven Alat
pemaparan yang dibutuhkan saat proses dilakukan Sterilisasi Panas Kering
dengan uap di bawah tekanan. Sterilisasi panas kering membutuhkan
pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Sterilisasi
panas kering biasa digunakan untuk depirogenisasi alat-alat gelas dan

13
 bahan-bahan lain yang memiliki kemampuan bertahan pada suhu
tersebut. Secara umum, panas kering digunakan untuk sterilisasi bahan-
bahan melalui proses pengabuan dari mikroorganisme (Handayani,
2009).
c. Sterilisasi Uap Air Bertekanan
Secara umum, sterilisasi uap air bertekanan
dilakukan pada suhu 121°C dibawah tekanan 15
psi. alat yang digunakan pada metode ini adalah
autoklaf, alat pemanas tertutup yang digunakan
untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap
bersuhu dan bertekanan tinggi (1210C, 15 lbs) Gambar 18.
Autoklaf Alat Sterilisasi
selama kurang lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada Uap Air Bertekanan
autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme,
melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah
yang akan membunuh microorganism.
Kerugian dari penggunaan uap ini adalah ketidaksesuaiannya untuk
penggunaan pada bahan sensitif terhadap panas dan kelembaban. Metode
ini tidak dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya, produk yang dibuat
dari basis minyak dan serbuk. Uap jenuh pada 121°C mampu membunuh
secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme hidup dalam waktu
½ menit. Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan
terhadap pemanasan tinggi (Handayani, 2009).
 Penyinaran Sinar UV
Sinar ultraviolet umumnya digunakan
untuk membantu mengurangi kontaminasi di
udara dan pemusnahan selama proses di
lingkungan. Sinar yang bersifat membunuh
mikroorganisme (germisida) diproduksi oleh
lampu kabut merkuri yang dipancarkan secara
Gambar 19. Laminar Air
eksklusif pada 253,7 nm. Sinar UV biasanya Flaw Alat Sterilisasi
digunakan untuk membunuh mikroba yang Fisik

14
 menempel pada permukaan interior biosafety cabinet. Biosafety cabinet
memiliki suatu pengaturan aliran udara yang menciptakan aliran udara
kotor untuk disaring dan diresirkulasinmelalui filter, aliran udara diatur
untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar untuk
mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang
BSC, udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel
yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain (Handayani,2009).
3. Sterilisasi kimiawi
Digunakan pada alat/bahan yang tidak tahan panas
atau untuk kondisi aseptis. Bahan kimia yang dapat
digunakan adalah Alkohol, asam parasetat,
formaldehid dll. Biasanya sterilisasi secara kimiawi
menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan Gambar 20. Alkohol
menguap seperti halnya alkohol. Umumnya isopropyl Bahan Sterilisasi Kimia

alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang

sangat efisien dan efektif. Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada
kebutuhan daripada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga
diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iritatif, dan kepekaan kulit
sangat bervariasi. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara
lain yaitu halogen (senyawa klorin, iodium), alkohol,fenol,hidrogen
feroksida,zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosanalin, detergen, logam
berat (hg,Ag,As,Zn), aldehida, dll (Handayani,2009).

15
 BAB III
METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Kultur Jaringan di laksanakan pada tanggal 13 Maret 2018 pukul
10.50 s/d 12.30 WIB, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Agroekoteknologi
Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan sebagai penunjang kegiatan praktikum ini adalah
timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer, autoklaf, Laminar Air Flow
(LAF), alat gelas yang meliputi : gelas beaker, erlemeyer, gelas ukur, cawan petri,
pipet, mikropipet, botol kultur, alat diseksi yang meliputi : scapel, pinset, spatula,
alat pengukur pH, rak kultur dan lampu neon. Sedangkan bahan yang digunakan
adalah alumunium, label dan alat tulis.

3.3 Cara Kerja

Adapun cara kerja praktikum ini adalah :
1. Dikelompokkan alat sesuai dengan namanya
2. Dipahami fungsi dari masing-masing alat
3. Disiapkan alat-alat yang akan disterilkan
4. Disterilkan menggunakan autoklaf
5. Disimpan alat yang sudah steril diruang penyimpanan
6. Didokumentasikan kegiatan praktikum

16
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Tabel 1. Hasil Pengenalan Alat
No Gambar Fungsi
1. Berfungsi untuk mensterilisasi
ahan atau alat yang pada umumnya
terbuat dari logam, plastik dll.
Dalam keadaan terbungkus maupun
tidak
Autoklaf
2. Berfungsi untuk bahan dan
larutan nutrisi dalam pembuatan
media kultur jaringan

Timbangan Analitik
3. Berfungsi sebagai tempat untuk
mengaduk, mencampur dan
memanaskan larutan yang akan
digunkan untuk pembuatan media

Gelas Beker
4. Berfungsi sebagai wadah untuk
memotong eksplan yang akan
ditanam pada media.

Cawan Petr

17
5. Berfungsi untuk tempat dan
sarana menuangkan air suling
maupun untuk tempat media dan
penanaman eksplan

Erlenmeyer
6. Berfungsi untuk memegang
atau mengambil irisan eksplan atau
untuk menanam eksplan

Pinset

7. Berfungsi untuk sterilisasi

dissecting kit (scalpel dan pinset) di
dalam laminar air flow pada saat
penanaman atau sub-kultur

Bunsen
8. Berfungsi untuk mengukur nilai
atau tingkat kemasaman suatu jenis
bahan.

pH meter
9. Berfungsi untuk memindahkan
cairan dari satu wadah ke wadah
yang lain dalam jumlah yang sangat
kecil.

Pipet Tetes

18
10. Berfungsi untuk memotong atau
mengiris eksplan.

Skapel
11. Berfungsi untuk mengambil
bahan kimia yang berbentuk padatan
atau bias juga dipakai untuk
mengaduk larutan

Spatula
12. Berfungsi untuk mengukur
jumlah larutan yang akan digunakan
dalam jumlah cukup banyak seperti
akuades

Gelas Ukur

13. Berfungsi Untuk menanam

Laminar Air Flow (LAF)
eksplan ke dalam botol dalam
kondisi steril atau melakukan sub
kultur yang dilengkapi dengan
blower dan lampu UV
Laminar Air Flow (LAF)
14. Berfungsi untuk menyimpan
kelebihan larutan stok atau media
lain agar lebih tahan lama.serta
sebagai pendingin dan sebagai
tempat untuk mengawetkan eksplan,
untuk menyimpan bahan dan alat.
Lemari Pendingin

19
15. Berfungsi sebagai wadah
menanam eksplan

Botol Kultur
16 Berfungsi untuk menyemprotkan
alcohol

Sprayer
17. Berfungsi untuk pemanasan dan
menghomogenkan larutan dan media

Hot Plate dan Magnetic

Stirer
18. Berfungsi sebagai alas
penimbangan bahan kimia dan
sebagai penutup botol kultur

Alumunium Foil
19. Berfungsi sebagai pembungkus

Plastic Wrap

20
20. Berfungsi untuk melabeli botol
kultur dan larutan stok

Kertas label

4.2 Hasil Sterilisasi Alat

No Gambar Keterangan

1. Botol kultur yang akan digunakan di

beri label dan dikumpulkan menjadi satu
dalam sebuah keranjang.

2. Sebelum melakukan sterilisasi cek

dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
Jika air kurang dari batas yang
ditentukan, maka dapat ditambah air
sampai batas tersebut. Gunakan air hasil
destilasi, untuk menghindari
terbentuknya kerak dan karat.
3. Kemudian dimasukan keranjang
yang berisi botol kultur kedalam
autoklaf

4. Tutup autoklaf secara rapat dengan

memutar gagang agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf

21
 5. Nyalakan autoclave dengan
menekan tombol pada bagian belakang
autoklaf dan sambungkan kabelnya pada
stopkontak

6. Atur Suhu 121οC dengan waktu 15

menit dan tekanan 1 atm pada autoclave

7. Setelah kurang lebih 1 jam dan

alarm pada autoclave sudah berbunyi
sebelumnya pada waktu 15 menit, buka
sedikit tutup autoklaf secara pelan-pelan
untuk mengeluarkan uap panas yang ada
didalamnya tunggu sampai dingin
kemudian alat yang ada didalamnya
baru dapat diambil.
8. Alat yang telah disterilisasi
disimpan pada ruang penyimpanan.

4.1 Pembahasan
Kultur in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman
seperti protoplasma, sel, jaringan, atau organ yang steril, ditumbuhkan pada
medium buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang
aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan
beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap (Nisa dan Rodinah, 2005).

22
 Seperti yang kita ketahui dalam sebuah praktikum, praktikan diwajibkan
mengenal dan memahami cara kerja serta fungsi dari alat-alat di laboratorium
yang akan digunakan. Selain untuk menghindari kecelakaan dan bahaya, dengan
memahami cara kerja dan fungsi dari masing-masing alat, praktikan dapat
melaksanakan praktikum dengan sempurna. Dalam praktikum kultur jaringan pun
tidak terlepas dari penggunaan alat-alat laboratorium yang menunjang dalam
kegiatan kultur jaringan. Peralatan yang digunakan pada laboratorium kultur
jaringan hampir sama dengan peralatan-peralatan yang ada di laboratorium pada
umumnya, yaitu berupa alat-alat gelas antara lain : gelas beaker, Erlenmeyer,
gelas ukur, cawan petri, pipet, mikropipet, botol kultur dan lain-lain. Di samping
peralatan gelas tersebut, pada laboratorium kultur jaringan masih ada sejumlah
alat yang identik untuk kegiatan kultur in vitro antara lain : autoklaf, Laminar air
flaw (LAF), lemari pendingin, timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer,
alat pengukur pH, rak kultur, alat-alat diseksi berupa scapel, pinset, spatula dan
lain-lain. Alat-alat tersebut memiliki fungsi dan penggunaan yang berbeda,
meskipun ada juga fungsi dan penggunaannya hampir sama. Selain memahami
dan mengenal alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian kultur jaringan,
bebrapa hal lain yang perlu diperhatikan adalah kebersihan dan keamanan saat
bekerja dengan teknik kultur jaringan. Misalnya penimbangan Pada saat
pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati
meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan
timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya.
Berdasarkan hasil praktikum, berikut adalah beberapa alat-alat yang umumnya
digunakan dalam kegiatan kultur jaringan (Tabel 1.) diantaranya :
Autoclave merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi alat dan media kultur
jaringan, peralatan yang biasa di sterilisasi menggunakan autoclave adalah alat-
alat gelas dan alat diseksi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gabriel (1988)
mengemukakan bahwa autoclave merupakan alat yang mampu mensterilkan
bermacam-macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi
yakni menggunakan uap air yang bertekanan panas. Jadi autoclave adalah alat
yang digunakan untuk mensterilkan alat atau bahan-bahan yang dalam hal ini
dugunakan pada teknik kultur jaringan. Autoclave bekerja berdasarkan prinsip

23
tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan mati apabila berada pada kondisi
lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih bisa hidup pada
kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang
suhunya tinggi.
Laminar Air Flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat
ketika akan melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan, persiapan
bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol
yang lain dalam kultur jaringan. Alat ini disebut Laminar Air Flow Cabinet,
karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga
tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam
media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan
yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama, yang kemudian ditiupkan keluar
melalui filter yang sangat halus disebut HEPA (High efficiency Particulate Air
Filter), dengan menggunakan blower. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sriyanti
dan Ari Wijayani (2012) prinsip kerja dari laminar air flow ini adalah dengan
mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam almari penabur melalui saringan
yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron. Bakteri dan jamur ditahan oleh
saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam laminar air flow sudah steril
dan membuat ruangan menjadi steril pula. Sama seperti peralatan yang
lainnya, laminar air flow pun harus melalui tahap sterilisasi. Laminar air flow
terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian dalamnya. Setelah
sterilisasi dengan alkohol, pintu laminar air flow ditutup dan lampu ultraviolet
(UV) dinyalakan selama 30 menit sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu
ultraviolet (UV) pekerjaan dapat segera dimulai.
Botol kultur digunakan sebagai tempat media yang digunkanan untuk
menanam eksplan. Botol kultur ini harus dicuci hingga bersih terlebih dahulu
menggunakan detergen. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran
yang menempel pada dinding botol guna menghindari kontaminasi. Selanjutnya
dapat di sterilisasi menggunakan autoclave.
Cawan petri atau petridish adalah jenis gelas piala yang dibutuhkan dalam
kultur jaringan untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media. Cawan
petri biasanya disterilisasi bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi

24
sebelumnya cawan petri ini harus dicuci bersih kemudian dikeringkan dan setelah
kering dibungkus dengan kertas payung coklat untuk disterilisasi
dengan autoclave. Cawan Petridish selalu berpasangan, yang ukurannya agak
kecil sebagai wadah dan yang lebih besar merupakan tutupnya. Untuk cawan petri
yang terbuat dari plastik dapat dimusnahkan setelah sekali pakai
Magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan media yang akan
dibuat nantinya. Magnet pengaduk ini nantinya akan berputar pada dasar botol
dimana magnet akan menempel karena adanya gaya tarik menarik magnet.
Kecepatan putaran dapat diatur sesuai keinginan. Ada beberapa jenis magnetic
stirrer yang dilengkapi denganhot plate yang bisa digunakan untuk memanaskan.
Hotplate adalah suatu alat yang berfungsi untuk menghomogenkan larutan dan
juga untuk pemanas. Hotplate juga merupakan alat untuk mencampur dan
memasak media kultur yaitu memasak segala macam bahan nutrisi dengan
melibatkan pengaduk dan pemanas. Pengadukan dan pemanas yang dihasilkan
oleh alat ini bersumber pada energi listrik. Besarnya kecepatan pengaduk dan
pemanasan dapat diatur berdasarkan keperluan (Soeryowinoto,1996).
Rak kultur merupakan alat yang digunakan sebagai tempat tempat untuk
menyimpan botol-botol berisi eksplan hasil inokulasi dan mengoptimalkan
pemanfaatan ruangan yang ada. Rak kultur dalam suatu laboratorium dipisahkan
agar mengurangi terkontaminasinya bakteri atau jamur dengan media. Rak kultur
biasanya disimpan berjajar dengan rak–rak yang lainnya agar mudah mengamati
media yang dikultur.
Gelas piala merupakan wadah yang terbuat dari borosilikat. Gelas piala yang
digunakan untuk bahan kimia yang bersifat korosif terbuat dari
PTPE. Fungsi gelas piala pada kultur jaringan adalah untuk mengaduk,
mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan untuk pembuatan
media. Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada dindingnya.
Pada praktikum ini gelas ukur digunakan untuk mengukur jumlah larutan yang
akan digunakan dalam jumlah cukup banyak seperti akuades. Gelas ukur
termasuk dalam glass ware, ukuran volume gelas ukur bermacam-macam
misalnya : 100 ml, 300 ml sampai 1000 ml. Gelas ukur biasanya jarang disterilkan
karena penggunaannya hanya untuk pembuatan medium saja. Erlemeyer adalah

25
botol berdasar lebar, botol ini terbuat dari kaca bening yang tahan panas.
Erlemeyer pada kultur jaringan dipergunakan untuk tempat dan sarana
menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
Ukuran erlemeyer bermacam-macam dari volume 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml,
sampai 2 liter.
Lampu spirtus atau bunsen digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel
dan pinset) di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau sub-culture.
Sterilisasi dengan menggunakan bunsen ini dengan cara mencelupkan dissecting
kit kedalam alkohol kemudian dibakar diatas api bunsen.
Pipet tetes berfungsi membantu memindahkan cairan dari wadah yang satu ke
wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil tetes demi tetes. Pipet tetes ini
memiliki ketelitian yang kurang dalam memindahkan larutan karena hanya dapat
digunakan dengan perkiraan. Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan
larutan dengan volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas
pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. Cara penggunaanya
adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan
volume yang diingini. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang
tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan)
dengan cara menyamakan tekananfiller dengan udara.
Dalam kultur jaringan pinset digunakan untuk memegang atau mengambil
irisan eksplan atau untuk menanam eksplan. Teknik penanaman eksplan harus
diusahakan agar ujung pinset tidak mengenai media supaya tidak terkontaminasi.
Scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau
memotong eksplan. Scalpel ini termasuk dalam peralatan yang masuk kategori
dissecting kit. Sebelum digunkan scalpel harus disterilisasi di dalam autoclave dan
dengan di flamir yaitu scalpel dicelupkan dalam alkohol kemudian dibakar di atas
api bunsen.
pH meter digunakan untuk mengetahui nilai atau tingkat kemasaman suatu
jenis bahan. pH meter sangat diperlukan karena dalam pembuatan media, ada
parameter tingkat kemasaman yang harus dipenuhi yaitu diantara 5,7- 5,8. Cara
menggunakan pH meter yaitu, sensor pada pH meter dicelupkan kedalam larutan
yang akan dibuat menjadi media, nantinya akan muncul angka pada layar yang

26
menunjukkan nilai kemasaman larutan tersebut. Neraca analitik Berfungsi untuk
menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media.
Seperti yang kita ketahui seluruh kegiatan kultur jaringan harus dilakukan
secara aseptik. Artinya, seluruh bahan dan alat yang digunakan harus disterilkan
terlebih dahulu. Termasuk ruangan laboratoriumnya dan pekerja yang melakukan.
Sterilisasi ruangan biasanya dilakukan dengan menyalakan lampu UV selama
beberapa menit dan menyemprotkan alkohol 70% . Sementara itu alat dan bahan
yang digunakan disterilkan dengan memanaskan dalam autoclave atau direndam
larutan sodium hipoklorit (kloroks). Bagi para pekerja, sebelum melakukan
aktivitas di dalam laboratorium seluruh permukaan tubuhnya disemprot dengan
alkohol 70% (Ir.Sentot,2008 ).
Oleh karena itu dalam teknik kultur jaringan berhasil tidaknya suatu kegiatan
kultur jaringan harus memenuhi persyaratan diantaranya media yang cocok,
kondisi lingkungan yang sesuai dan dalam kondisi aspetis atau steril. Dalam
menciptakan kondisi aseptic dan steril tersebut maka harus dilakukan sterilisasi
pada semua komponennya baik pada peralatan, bahan/media, ruangan serta
pekerjanya Dari Hal ini sesuai dengan pernyataan Suryowinoto Moeso (2000)
Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan aseptic atau
sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang meliputi eksplan (bagian
tanaman yang akan dikultur), peralatan yang digunakan, pekerja yang melakukan
kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan.
Berdasarkan pemaparan diatas maka dapat kita ketahui bahwa syarat utama
dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau steril untuk semua
komponen dalam kultur jaringan. Kegiatan kultur diawali dengan sterilisasi alat
dan bahan. Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu
alat atau bahan yang bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti
jamur dan bakteri. Alat-alat yang digunakan seperti botol kultur, cawan petri,
erlenmeyer, batang pengaduk, gelas piala, pipet serta peralatan glass ware lainnya
harus bersih dan steril. Sterilisasi alat yang dilakukan pada praktikum ini adalah
menggunakan autoclave listril. Alat-alat yang di sterilisasi pada praktikum kali ini
adalah botol kulur dengan menggunakan autoclave pada suhu 121˚C dengan

27
tekanan 1 atm selama 15 menit karena pada tekanan ini bakteri dan jamur yang
terdapat dalam peralatan akan mati.
Metode sterilisasi dengan menggunakan Autoclave ini disebut sterilisasi basah
dengan prinsip uap air panas bertekanan, pada suhu 121°C pada tekanan 1 atm.
Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh
mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi
inilah yang akan membunuh microorganism. Prinsip kerja autoklaf saat sumber
panas dinyalakan air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air
yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf, setelah semua udara yang
ada dalam autoklaf diganti dengan uap air maka katup uap/udara ditutup sehingga
tekanan udara dalam autoklaf naik, dan pada saat tercapainya tekanan dan suhu
yang sesuai maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu
mundur, setelah proses sterilisasi selesai sumber panas dimatikan dan tekanan
dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi dan perlu diingat autokalaf tidak
boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Tidak semua bahan/media dapat
disterilisasi dengan autoklaf ada beberapa bahan/media yang tidak dapat
disterilkan dengan autoklaf misalnya serum vitamin yang merupakan bahan tidak
panas, pelarut organic seperti fenol dan buffer. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Soeryowinoto (1996) Penting untuk dipahami bahwa tidak semua peralatan
laboratorium tahan terhadap proses sterilisasi dengan pemanasan dan tekanan
tinggi terutama peralatan yang terbuat dari plastik seperti polypropyline,
polymethylpentene yang dapat di autoklaf berulang.
Menurut Zumrona (2012) secara umum, sterilisasi uap air bertekanan dengan
menggunakan autoclave yaitu hal pertama yang perlu diperhatikan sebelum
melakukan sterilisasi adalah cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi atau aquades, untuk menghindari terbentuknya kerak
dan karat. Masukkan peralatan dan bahan yang akan disterilisasi, jika
mensterilisasi botol tertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan. Selanjutnya tutup
autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
Lalu tekan tombol on pada bagian belakang autoklaf dan sambungkan pada listrik.

28
Selanjutnya di atur timer dengan waktu minimal 15 menit untuk sterilisasi
peralatan dan 20 menit untuk sterilisasi bahan pada suhu 121oC dengan tekanan 1
atm. Jika alarm tanda selesai berbunyi jangan langsung dibuka tutup autoklafnya,
tapi tunggu sampai tekanan menurun hingga sama dengan tekanan udara di
lingkungan (jarum pada pressure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-
klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.
Untuk sterilisasi petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain (alat-
alat logam) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak langsung
dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika mengalami
kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti pisau
scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air.
Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar
agar tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya. Khusus
untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata
pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi.
Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan
pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

29
 BAB V
PENUTUP

5.1 Simpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
pemahaman dan pengenalan alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur
jaringan sangatlah penting, selain untuk menghindari kecelakaan dan bahaya,
dengan memahami cara kerja dan fungsi dari masing-masing alat, praktikan dapat
melaksanakan praktikum dengan sempurna. Peralatan yang digunakan pada
laboratorium kultur jaringan antara lain : gelas beaker, Erlenmeyer, gelas ukur,
cawan petri, pipet, mikropipet, botol kultur autoklaf, Laminar air flaw (LAF),
lemari pendingin, timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer, alat pengukur
pH, rak kultur, alat-alat diseksi berupa scapel, pinset, spatula dan lain-lain. Dalam
teknik kultur jaringan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur harus memenuhi
persyaratan diantaranya media yang cocok, kondisi lingkungan yang sesuai dan
dalam kondisi aspetis atau steril. Dalam menciptakan kondisi aseptic dan steril
tersebut maka harus dilakukan sterilisasi pada semua komponennya baik pada
peralatan, bahan/media, ruangan serta pekerjanya. Sterilisasi peralatan dan
bahan/media dapat menggunakan alat yang dinamakan autoclave pada suhu 121 oC
pada tekanan 1 atm dengan waktu 15 menit untu peralatan dan 20 menit untuk
bahan/ media.

5.2 Saran
Adapun saran yang dapat saya sampaikan untuk praktikum kali ini adalah
mengingat dalam kegiatan kultur jaringan sangat mengutamakan kebersihan dan
kesterilan maka diharapkan semua komponen yang terlibat dalam kegaiatannya
harus steril seperti penggunaan alat-alat yang bersih dan steril, bahan yang akan
digunakan juga harus steril, ruangan sampai pada pekerja nya juga harus steril.
Sterilisasi dilakukan sesuai dengan ketentuan yang berlaku agar tidak terjadi
kontaminasi pada percobaan yang dilakukan yang dapat menyebabkan kegagalan
hasil kultur.

30
 DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, Mikrajuddin. 2006. IPA Fisika 1. Jakarta:Erlangga

Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPB
Press
Gabriel, J. F., 1988. Fisika Kedokteran. Jakarta : EGC.
Hadioetomo. Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T.
Gramedia Pustaka Utama
Handayani, Nuri. 2009. Buku Kantong Biologi SMA. Yogyakarta:Pustaka
Widyatama.
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant
Propagation: Principle And Practices. Sixth Ed.
Ir. Sentot. 2008. Pesona Sansevieria. Jakarta : Agromedia Pustaka : Jakarta
Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.
http://anekaplanta.wordpress.com/2008 /03/02/teknik-penyimpanan-dan-
pemeliharaan-mikroba/. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:19
WIB.
Nisa dan Rodinah. 2005. Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah Pisang (Musa
pa rasidiaca L.) dengan Pemberian Campuran NAA dan Kinetin. J.
Bioscientiae. 2 (2) : 23-26.
Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff
Publishers. Dordrecht.The Netherlands.
Soenaryowinoto, M. 1996. Pemuliaan Tanaman secara In Vitro. Yogyakarta :
Kanisius.
Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2012. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan
dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Yogyakarta :
Kanisius.
Sulaiman, Achmad. 2013. Mengenal alat-alat laboratorium Mikrobiologi.
http://sulaiman-analis.blogspot.com/2013/09/mengenal-peralatan-
laboratorium_19.html?m=. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:42
WIB.
Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius,
Yogyakarta.
Widiastoety, D. dan B. Marwoto.2004. Pengaruh Berbagai Sumber Arang dalam
Media Kultur In Vitro terhadap Pertumbuhan Plantlet Oncidium. J. Hort.
14(1): 1-5, 2004
Winarsih, S. D. Santoso, dan T. Wardiyati. 2002. Embriogenesis Somatik dan
Regenerasi dari Eksplan Embrio Zigotik Kakao (Theob roma cacao L.).
http://www.sumutprov.go.id. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 17.
14 WIB.
Zumrona, Hilda. 2012. Sekilas Tentang Auoklaf.
http://hildabio12.blogspot.co.id/2012/12/sekilas-tentang-autoklaf.html.
Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:02 WIB.

31
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3.

Botol Kultur Alat Sterilisasi Autoclave Penambahan Aquades
kedalam Autoclave

Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6.

Botol Kultur Dimasukan Pengaturan Suhu dan Proses Sterilisasi Sedang
dalam Autoclave Waktu Sterilisasi Berlangsung

Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9.

Alat-Alat dalam Kegiatan Alat Pengukur pH Media Bahan-Bahan dalam
Kultur Jaringan (pH Meter ) Kegiatan Kultur Jaringan

32