Anda di halaman 1dari 32

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetative dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Soenarryowinoto, 1996). Sebelum melakukan kegiatan praktikum kultur jaringan dalam laboratorium tentu saja kita harus mengenal nama-nama, kegunaan, dan perawatan peralatan yang ada di laboratorium kultur jaringan. Karena dalam praktikum kita banyak menggunakan peralatan yang ada dalam laboratorium baik alat-alat gelas, nongelas maupun peralatan mekanik. Berdasarkan hal tersebut di atas, perlu di lakukan pengenalan alat-alat dalam kegiatan kultur jaringan. Dalam sebuah praktikum keberhasilan dalam percobaaan pengamatan di tentukan oleh kebersihan dan kesterilan alat yang kita gunakan, hal tersebut bertujuan menghindari kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan penelitian yang dilakukan dilaboratorium maupun untuk kejelasan dan ketetapan pengamatan. Dalam sebuah praktikum, praktikan diwajibkan mengenal dan memahami cara kerja serta fungsi dan alat-alat di laboratorium. Selain untuk menghindari kecelakaan dan bahaya, dengan memahami cara kerja dan fungsi dari masing- masing alat, praktikan dapat melaksanakan praktikum dengan sempurna (Sulaiman, 2013). Teknik kultur jaringan akan berhasil bilamana memenuhi persyaratan dalam kultur jaringan yaitu media yang cocok, kondisi lingkungan yang sesuai dan dalam kondisi aspetis atau steril. Dari persyaratan tersebut maka diperlukan sterilisasi dalam melakukan kegiatan kultur jaringan. Menurut Moeso Suryowinoto (2000) Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan aseptic atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang

1

meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang digunakan, pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan. Seluruh kegiatan kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Artinya, seluruh bahan dan alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Termasuk ruangan laboratoriumnya dan pekerja yang melakukan. Sterilisasi ruangan biasanya dilakukan dengan menyalakan lampu UV selama beberapa menit dan menyemprotkan alkohol 70 . Sementara itu alat dan bahan yang digunakan disterilkan dengan memanaskan dalam autoclave atau direndam larutan sodium hipoklorit (kloroks). Bagi para pekerja, sebelum melakukan aktivitas di dalam laboratorium seluruh permukaan tubuhnya disemprot dengan alkohol 70% (Ir.Sentot,2008 ). Berdasarkan pemaparan tersebut, dapat diketahui bahwa pengenalan alat dan sterilisasi sangatlah penting dalam kegiatan perkembangbiakan secara in vitro atau melalui kultur jaringan. Hal tersebutlah yang mendasari mengapa praktikum pengenalan alat dan sterilisasi peralatan ini dilakukan.

1.2 Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui dan melaksanakan teknik sterilisasi alat yang benar untuk kegiatan in vitro.

2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Kultur Jaringan Kultur in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan, atau organ yang steril, ditumbuhkan pada medium buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Secara teori, perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro dapat dibedakan menjadi dua, yaitu Organogenesis atau perbanyakan melalui tunas-tunas baru dari tunas axilar, serta secara Embriogenesis somatik, yaitu pembentukan tunas adventif dan embrio somatic adventif. Pembentukan tunas adventif maupun embrio somatik dapat melalui cara morfogenesis langsung maupun tidak langsung (Nisa dan Rodinah, 2005). Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian- bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Soenaryowinoto, 1996). Dalam kultur jaringan terdapat beberapa aspek yang berpengaruh terhadap keberhasilan perbanyakan tanaman, antara lain keseimbangan zat pengatur tumbuh yang terkandung dalam media. Keseimbangan zat pengatur tumbuh yang terkandung dalam media menentukan arah suatu kultur. Auksin dan sitokinin merupakan zat pengatur tumbuh yang sering digunakan dalam kultur jaringan. Auksin dan sitokinin dalam keseimbangan yang tepat berpengaruh terhadap organogenesis (Winarsih dan Priyono, 2000). Selain faktor dalam yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan, faktor luar juga sangat berpengaruh, seperti yang dikatakan Widiastoety et al., (2004) bahwa keberhasilan

3

pertumbuhan sel, jaringan dan organ pada kultur in vitro sangat dipengaruhi oleh hubungan timbal balik antara tanaman dan faktor lingkungan, seperti komposisi dan pH media, cahaya, suhu, kelembaban, dan kadar oksigen, selain itu, ketekunan pengalaman dan keahlian serta sarana yang memadai dapat meningkatkan persentase jaringan yang tumbuh. Perbanyakan secara in vitro dapat menghasilkan tanaman dengan sifat sama seperti induknya, pembiakan ini termasuk pembiakan secara vegetatif, yaitu individu baru terjadi dari bagian tubuh suatu induk. Oleh karena itu, individu yang baru terbentuk mempunyai sifat yang sama dengan induknya. Perbanyakan tanaman dengan teknik ini membuat tanaman bebas dari penyakit karena dilakukan secara aseptik. Beberapa keuntungan yang lain dari perbanyakan kultur in vitro antara lain: perbanyakan generatif dan vegetatif yang cepat dan efisien, mempermudah seleksi mutan, menghindari sterilitas yang menghambat hibridisasi, produksi tanaman bebas pathogen dan sebagai pelestarian plasma nutfah (Widiastoety et al, 2004 ).

2.2 Pengenalan Laboratorium Kultur Jaringan Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari ruangan-ruangan yang dipisahkan berdasarkan fungsinya, yaitu ruang persiapan (preparation area), ruang penanaman (transfer area), ruang pertumbuhan (growing area). Seberapapun luasnya laboratorium, ketiga ruang tersebut harus ada. Ketiga ruang di atas juga harus terpisah dari kebun bibit dan green house untuk menghindari masuknya kontaminasi ke dalam ruang kultur. Kebersihan lantai, meja dan kursi harus terus dijaga secara intensif (Hartman dkk, 1997). 1. Ruang Persiapan (preparation area) Ruang persiapan merupakan ruangan yang mempunyai 3 fungsi dasar yaitu untuk membersihkan alat-alat (alat-alat gelas seperti petri, botol, dll), persiapan dan sterilisasi media, dan penyimpanan alat-alat gelas. Sebuah bak untuk mencuci yang dilengkapi dengan kran untuk aliran air mengalir juga diperlukan untuk membersihkan alat-alat berbahan gelas. Selain itu diperlukan meja yang permukaanya dilapisi dengan bahan yang mudah dibersihkan. Peralatan selanjutnya yang digunakan dalam ruang preparasi adalah lemari es

4

untuk menyimpan larutan stok dan beberapa media, timbangan analitik, autoclave, pH meter, magnetic stirrer, destilator (Hartmann dkk., 1997). Selain alat di atas, ruangan ini juga dilengkapi dengan alat-alat seperti Hot plate dengan magnetic stirer,Oven, pH meter , kompor gas, labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scalpel

2. Ruangi Penanaman (Transfer area) Ruang penanaman merupakan ruang yang digunakan untuk isolasi, inokulasi dan subkultur (penjarangan) pada kondisi steril yang di dalamnya terdapat lemari kaca atau kabinet yang disebut Laminar Airflow (LAF). Laminar Airflow ini digunakan untuk pemotongan eksplan, melakukan penanaman dan subkultur. Akan tetapi jika tidak ada LAF yang memadai, tahap isolasi (pemotongan eksplan) dapat dilakukan di antara kertas saring steril. Sangat dianjurkan untuk menggunakan jas laboratorium yang bersih selama tahap persiapan dan mensterilkan tangan dengan alkohol 96% (Pierik, 1987). Alat-alat seperti scalpel, gunting dan alat-alat inokulasi lainnya harus disterilkan dengan alkohol 96% dan dilanjutkan dengan pemanasan di atas api bunsen. Lampu ultraviolet (UV) juga digunakan untuk mensterilkan ruang, sebelum LAF digunakan. Pemotongan eksplan juga dilakukan di dalam LAF yang kemudian dilanjutkan dengan beberapa tahapan sterilisasi sebelum ditanam pada media kultur.

3. Ruang pertumbuhan atau Inkubasi (Growing area) Growing area merupakan ruang pertumbuhan atau ruang penyimpanan hasil kultur pada kondisi cahaya dan temperatur yang terkontrol. Ruang pertumbuhan ini terdiri dari rak-rak yang biasanya terbuat dari kaca dan digunakan untuk meletakkan botol-botol kultur setelah proses penanamanan pada ruang isolasi di dalam LAF. Rak-rak yang digunakan untuk inkubasi dilengkapi dengan lampu neon di atasnya sebagai sumber cahaya. Sedangkan ruang pertumbuhan dalam kultur jaringan dilengkapi dengan Air conditioner (AC) untuk mengontrol suhu ruang (Hartmann dkk., 1997).

5

2.3 Peralatan dalam Kultur Jaringan

Alat-alat yang diperlukan dalam metode kultur jaringan tumbuhan diantaranya

: Gelas ukur, erlenmeyer, petridish, hotplate, timbangan analitik, botol-botol gelas,

oven, magnetic stirrer, destilator, autoclave, lemari es, laminar airflow,

pinset, scalpel, spatula, rak inkubasi, bunsen, aluminium foil, karet, plastik

gulung, batang pengaduk kaca dll, Berikut adalah penjabarannya :

1. Mikropipet (Micropippete) dan Tip

adalah penjabarannya : 1. Mikropipet (Micropippete) dan Tip Gambar 1. Mikropipet Mikropipet adalah alat untuk

Gambar 1. Mikropipet

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan

yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000

μl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya

mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya

(adjustable volume pipette) antara 1μl sampai 20 μl, atau

mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya

tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 μl.

dalam penggunaannya, mukropipet memerlukan tip (Sulaiman, 2013).

2. Hot plate stirrer dan Stirre bar

tip (Sulaiman, 2013). 2. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar

Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)

berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan

pengadukan. Dalam kultur jaringan berperan untuk

menghomogenkan senyawa-senyawa dalam media kultur

dan untuk memanaskan media padat (agar). Pelat (plate)

Gambar 2. Hot yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat Plate dan

proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate

dan magnetic stirrer misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan

kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai

425 o C. Prinsip kerjanya menyimpan beaker glass atau labu erlenmeyer yang

berisi cairan atau larutan yang akan dihomogenkan diatas plat alat ini

(Sulaiman, 2013).

3. Oven

Oven Berfungsi untuk sterilisasi kering dan oven

biasanya digunakan untuk mengeringkan alat-alat sebelum

digunakan dan digunakan untuk mengeringkan bahan yang

6

digunakan untuk mengeringkan alat-alat sebelum digunakan dan digunakan untuk mengeringkan bahan yang 6 Gambar 4. Oven

Gambar 4. Oven

dalam keadaan basah alat-alat yang disterilkan menggunakan oven antaralain

peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dll. serilisasi kerning dengan

oven dilakukan dengan cara memanaskan dengan suhu 180 o C selama 1 jam

(Sulaiman, 2013).

4. Timbangan digital / neraca digital

Neraca digital berfungsi untuk menimbang media dan juga sample atau

contoh uji saat preparasi (Sulaiman, 2013)

5. Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Berfungsi untuk menampung larutan, bahan

(Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan, bahan Gambar 5. Erlenmeyer atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat

Gambar 5.

Erlenmeyer

atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk

meracik dan menghomogenkan bahan-bahan

komposisi media, menampung akuades dll. Terdapat

beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang

dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml

300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb. Prinsip kerjanya yaitu

dengan menuangkan larutan atau zat kimia secara langsung atau menggunakan

corong dengan hati-hati. Labu ini memiliki bagian yang lebar di bawah dan bagian

yang agak sempit (menyempit) pada bagian atasnya (Abdullah, 2006).

6. Beaker Glass

Gambar 6.
Gambar 6.

Beaker Glass

Beaker glass merupakan alat yang memiliki

banyak fungsi. Dapat digunakan untuk preparasi

media-media, menampung akuades dll. Prinsip

kerjanya yaitu dengan menuangkan larutan atau cairan

kedalam beaker glass ini. Alat ini terbuat dari kaca

borosilikat yang tahan terhadap panas hingga suhu 200 C. Ukuran alat ini ada

yang 50 mL, 100 mL dan 2 L. Gelas beaker adalah sebagai tempat untuk

melarutkan zat yang tidak butuh ketelitian tinggi, jadi tidak cocok untuk

pembuatan larutan yang perlu ketelitian tinggi (secara kuantitatif) (Abdullah,

2006).

7. Gelas ukur (Graduated Cylinder)

Berguna untuk mengukur volume suatu cairan,

seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa

7

Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa 7 Gambar 7.

Gambar 7.

Gelas Ukur

pilihan berdasarkan skala volumenya. Prinsip kerjanya yaitu dengan

menuangkan larutan atau cairan zat kimia secara langsung dengan berhati-hati.

Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan

berdasarkan menuskus cekung larutan. Pada saat praktikum dengan ketelitian

tinggi gelas ukur tidak dianjurkan untuk mengukur volume larutan.

Pengukuran dengan ketelitian tinggi dilakukan menggunakan pipet volume

(Abdullah, 2006).

8. Cawan Petri (Petri Dish)

Cawan petri terdiri cawan bagian bawah dan

(Petri Dish) Cawan petri terdiri cawan bagian bawah dan Gambar 8. Cawan Petri cawan bagian atas

Gambar 8.

Cawan Petri

cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri

tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter

cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat

menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan

cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media seba

nyak 10 ml. Prinsip kerja cawan petri selalu berpasangan, yang ukurannya agak kecil

sebagai wadah dan yang lebih besar merupakan tutupnya. Prinsip kerjanya yaitu

medium dapat dituangkan ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas

sebagai penutup (Abdullah, 2006).

9. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

penutup (Abdullah, 2006). 9. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Gambar 9. Pembakar Bunsen Salah satu alat yang

Gambar 9. Pembakar Bunsen

Salah satu alat yang berfungsi untuk

menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar

bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran

udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan

diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola

aliran udara tersebut. Perubahan bunsen dapat

menggunakan bahan bakar gas atau metanol. Prinsip

kerjanya yaitu dengan menyalakannya dengan membakar bagian sumbu (pada

pembakar spirtus) dengan korek api atau dengan memberiapi pada bagian atas

(dari pembakar bunsen yang berbahan bakar gas) (Abdullah,2006).

10. Pinset (Forcep)

Alat ini berfungsi sebagai alat pembantu

dalam mengambil preparet segar agar tidak

Pinset (Forcep) Alat ini berfungsi sebagai alat pembantu dalam mengambil preparet segar agar tidak 8 Gambar

terkontaminasi. Alat ini terbuat dari besi. Prinsip Kerja Prinsip kerjanya adalah

menjepit benda yang akan diambil atau dipindahkan (Abdullah,2006).

11. Spatula

Spatula merupakan berupa sendok panjang dengan

ujung atasnya datar, terbuat dari stainless steel atau

alumunium. Alat untuk mengambil obyek. Spatula yang

sering digunakan di laboratorium biologi atau kimia

berbentuk sendok kecil, pipih dan bertangkai. Fungsi

spatula ini untuk mengambil bahan kimia yang berbentuk padatan atau bias

Gambar 11. Spatula

kimia yang berbentuk padatan atau bias Gambar 11. Spatula juga dipakai untuk mengaduk larutan (Abdullah,2006). 12.

juga dipakai untuk mengaduk larutan (Abdullah,2006).

12. Magnetic Stirrer

Alat ini digunakan untuk membantu dalam proses

pengadukan suatu larutan. Batang-batang magnet

diletakan di dalam larutan kemudian disambungkan arus

listrik maka secara otomatis batang magnetik dari stirer

akan berputar (Abdullah,2006).

batang magnetik dari stirer akan berputar (Abdullah,2006). Gambar 12. Magnetic Stirrer 13. Laminar air Flaw (LAF)

Gambar 12.

Magnetic Stirrer

13. Laminar air Flaw (LAF)

Gambar 12. Magnetic Stirrer 13. Laminar air Flaw (LAF) Gambar 13 . Laminar air Flaw (LAF)

Gambar 13. Laminar air Flaw (LAF)

Kabinet yang digunakan untuk isolasi, inokulasi

dan subkultur. Laminar air-flow cabinet ini harus steril

dan bebas dari debu yang dilengkapi dengan UV,

lampu neon dan blower. putih. Prinsip Kerja Prinsip

kerja dari alat ini yaitu membunuh dan menghilangkan

bakteri yang terbawa atau terapung diudara pada suatu

ruangan untuk menciptakan suasana ruangan yang steril. Fungsi

Alat ini berfungsi untuk mensterilkan suatu ruangan yang akan digunakan

untuk percobaan agar tidak ada kontaminasi bakteriyang terdapat diudara

(Handayani, 2009).

14. Autoklaf

Autoklaf adalah perlatan sterilisasi panas basah

yang menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan

yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2

atm dan dengan suhu 121°C (250°F). Bahan yang

9

yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121°C (250°F). Bahan

Gambar 14.

Autoklaf

disterilisasi dimaaksudkan agar kelak tidak ada kontaminasi. Medium yang akan disterilkan ditempatkandi dalam autoklaf selama 15-20 menit, hal ini bergantung pada banyak sedikitnya barang yang disterilkan. Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121°C. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel reisten yang muncul pada bakteri untuk pertahanan diri dilingkungan yang kurang baik. Sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotic (Handayani, 2009). Cara Penggunaan Autoklaf ini adalah :

1) Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2) Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol tertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan 3) Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. 4) Nyalakan autoklaf, di atur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu

121 o C

5) Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar klef pengaman. Kemudian tiap pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Perhitungkan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm 6) Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada pressure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati (Zumrona,

2012).

10

2.4 Metode Sterilisasi dalam Kultur Jaringan Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi eksplan.

1. Sterilisasi Ruang Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak terlalu besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).

2. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet) Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol 70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar harus tetap dijaga kebersihannya (Edhi Sandra, 2013).

3. Sterilisasi Alat dan Media Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave pada temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen. Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau plastik dan diikat dengan

11

karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30 menit (Edhi Sandra, 2013). 4. Sterilisasi Eksplan Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan, misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya, umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan), musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan eksplannya (Edhi Sandra,

2013).

2.5 Macam-Macam Sterilisasi Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara yang umum digunakan dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia dan penyaringan (Filtrasi) (Hadioetomo, 1993). Macam-macam sterilisasi (Machmud, 2008), Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. 1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) Sterilisasi cara ini menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotic dan cara kerja dari sterilisasi ini berbeda

dan antibiotic dan cara kerja dari sterilisasi ini berbeda Gambar 15. Saringan dari metode lainnya karena

Gambar 15. Saringan

dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme

Alat Sterilisasi Mekanik

melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks

pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya.

12

Metode sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Ukuran nominal pori penyaring 0,2 μm atau kurang dan penyaring dibuat dari berbagai jenis bahan seperti selulosa asetat, selulosa nitrat, florokarbonat, polimer akrilik, polikarbonat, poliester, polivinil klorida, vinil, nilon, politef, dan berbagai tipe bahan lain termasuk membran logam. Larutan dapat dibebaskan dari organisme vegetatif dan spora bakteri dengan melalui filter bakteri, filter bakteri tidak membebaskan larutan dari virus. 2. Sterilisasi fisik Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran. Pemanasan

a. Pemijaran langsung Pemijaran langsung digunakan untuk mensterilkan spatula logam, batang gelas, pinset, jarum inokulum, mulut botol, vial, dan labu ukur, gunting, jarum logam dan kawat, dan alat-alat lain yang tidak hancur dengan pemijaran langsung. Papan salep, lumping dan alu dapat disterilisasi dengan metode ini. Metode ini dapat dilakukan

disterilisasi dengan metode ini. Metode ini dapat dilakukan Gambar 16. Pembakar Bunsen Alat Sterilisasi Fisik dengan

Gambar 16. Pembakar Bunsen Alat Sterilisasi Fisik

dengan membakar langsung alat pada api. Alat yang digunakan untuk sterilisasi yaitu pembakar bunsen (Handayani, 2009).

b. Sterilisasi panas kering Selama pemanasan kering,

2009). b. Sterilisasi panas kering Selama pemanasan kering, Gambar 17. Oven Alat mikroorganisme dibunuh oleh proses

Gambar 17. Oven Alat

mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang dibutuhkan saat proses dilakukan

dengan uap di bawah tekanan. Sterilisasi panas kering membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Sterilisasi panas kering biasa digunakan untuk depirogenisasi alat-alat gelas dan

Sterilisasi Panas Kering

13

bahan-bahan lain yang memiliki kemampuan bertahan pada suhu tersebut. Secara umum, panas kering digunakan untuk sterilisasi bahan- bahan melalui proses pengabuan dari mikroorganisme (Handayani,

2009).

c. Sterilisasi Uap Air Bertekanan Secara umum, sterilisasi uap air bertekanan dilakukan pada suhu 121°C dibawah tekanan 15 psi. alat yang digunakan pada metode ini adalah autoklaf, alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap

digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap Gambar 18 . Autoklaf Alat Sterilisasi Uap Air Bertekanan

Gambar 18. Autoklaf Alat Sterilisasi Uap Air Bertekanan

bersuhu dan bertekanan tinggi (121 0 C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada

autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganism. Kerugian dari penggunaan uap ini adalah ketidaksesuaiannya untuk penggunaan pada bahan sensitif terhadap panas dan kelembaban. Metode ini tidak dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya, produk yang dibuat dari basis minyak dan serbuk. Uap jenuh pada 121°C mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme hidup dalam waktu ½ menit. Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap pemanasan tinggi (Handayani, 2009).

Penyinaran Sinar UV Sinar ultraviolet umumnya digunakan untuk membantu mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan. Sinar yang bersifat membunuh mikroorganisme (germisida) diproduksi oleh lampu kabut merkuri yang dipancarkan secara eksklusif pada 253,7 nm. Sinar UV biasanya digunakan untuk membunuh mikroba yang

253,7 nm. Sinar UV biasanya digunakan untuk membunuh mikroba yang Gambar 19. Laminar Air Flaw Alat

Gambar 19. Laminar Air Flaw Alat Sterilisasi Fisik

14

menempel pada permukaan interior biosafety cabinet. Biosafety cabinet memiliki suatu pengaturan aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor untuk disaring dan diresirkulasinmelalui filter, aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC, udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain (Handayani,2009). 3. Sterilisasi kimiawi Digunakan pada alat/bahan yang tidak tahan panas atau untuk kondisi aseptis. Bahan kimia yang dapat digunakan adalah Alkohol, asam parasetat, formaldehid dll. Biasanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya alkohol. Umumnya isopropyl

alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan efektif. Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan daripada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iritatif, dan kepekaan kulit sangat bervariasi. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain yaitu halogen (senyawa klorin, iodium), alkohol,fenol,hidrogen feroksida,zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosanalin, detergen, logam

berat (hg,Ag,As,Zn), aldehida, dll (Handayani,2009).

detergen, logam berat (hg,Ag,As,Zn), aldehida, dll (Handayani,2009). Gambar 20. Alkohol Bahan Sterilisasi Kimia 15

Gambar 20. Alkohol Bahan Sterilisasi Kimia

15

BAB III METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Kultur Jaringan di laksanakan pada tanggal 13 Maret 2018 pukul 10.50 s/d 12.30 WIB, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan sebagai penunjang kegiatan praktikum ini adalah timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer, autoklaf, Laminar Air Flow (LAF), alat gelas yang meliputi : gelas beaker, erlemeyer, gelas ukur, cawan petri, pipet, mikropipet, botol kultur, alat diseksi yang meliputi : scapel, pinset, spatula,

alat pengukur pH, rak kultur dan lampu neon. Sedangkan bahan yang digunakan adalah alumunium, label dan alat tulis.

3.3 Cara Kerja

Adapun cara kerja praktikum ini adalah :

1. Dikelompokkan alat sesuai dengan namanya

2. Dipahami fungsi dari masing-masing alat

3. Disiapkan alat-alat yang akan disterilkan

4. Disterilkan menggunakan autoklaf

5. Disimpan alat yang sudah steril diruang penyimpanan

6. Didokumentasikan kegiatan praktikum

16

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Tabel 1. Hasil Pengenalan Alat

No

Gambar

 

Fungsi

1.

1. Berfungsi untuk mensterilisasi ahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik dll. Dalam

Berfungsi untuk mensterilisasi ahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik dll. Dalam keadaan terbungkus maupun tidak

Autoklaf

2.

Timbangan Analitik

Timbangan Analitik

Berfungsi

untuk

bahan

dan

larutan nutrisi dalam pembuatan

media kultur jaringan

 
 

3.

3. Berfungsi sebagai tempat untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan untuk pembuatan media

Berfungsi sebagai tempat untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan untuk pembuatan media

Gelas Beker

4.

4. Berfungsi sebagai wadah untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media.

Berfungsi sebagai wadah untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media.

Cawan Petr

17

5.

5. Berfungsi untuk tempat dan sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan

Berfungsi untuk tempat dan sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan

Erlenmeyer

6.

6. Berfungsi untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan

Berfungsi untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan

Pinset

7.

7. Berfungsi untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel dan pinset) di dalam laminar air flow pada saat

Berfungsi untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel dan pinset) di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau sub-kultur

Bunsen

8.

8. Berfungsi untuk mengukur nilai atau tingkat kemasaman suatu jenis bahan.

Berfungsi untuk mengukur nilai atau tingkat kemasaman suatu jenis bahan.

pH meter

9.

9. Berfungsi untuk memindahkan cairan dari satu wadah ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat

Berfungsi untuk memindahkan cairan dari satu wadah ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil.

Pipet Tetes

18

10.

10. Skapel Berfungsi untuk memotong atau mengiris eksplan. 11. Spatula Berfungsi untuk mengambil bahan kimia yang

Skapel

Berfungsi untuk memotong atau mengiris eksplan.

11.

Skapel Berfungsi untuk memotong atau mengiris eksplan. 11. Spatula Berfungsi untuk mengambil bahan kimia yang berbentuk

Spatula

Berfungsi untuk mengambil bahan kimia yang berbentuk padatan atau bias juga dipakai untuk mengaduk larutan

12.

padatan atau bias juga dipakai untuk mengaduk larutan 12. Gelas Ukur Berfungsi untuk mengukur jumlah larutan

Gelas Ukur

Berfungsi untuk mengukur jumlah larutan yang akan digunakan dalam jumlah cukup banyak seperti akuades

13.

Laminar Air Flow (LAF)
Laminar Air Flow (LAF)

Laminar Air Flow (LAF)

Berfungsi Untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam kondisi steril atau melakukan sub kultur yang dilengkapi dengan blower dan lampu UV

14.

sub kultur yang dilengkapi dengan blower dan lampu UV 14. Lemari Pendingin Berfungsi untuk menyimpan kelebihan

Lemari Pendingin

Berfungsi untuk menyimpan kelebihan larutan stok atau media lain agar lebih tahan lama.serta sebagai pendingin dan sebagai tempat untuk mengawetkan eksplan, untuk menyimpan bahan dan alat.

19

15.

15. Botol Kultur Berfungsi menanam eksplan sebagai wadah 16 Sprayer Berfungsi untuk menyemprotkan alcohol 17. Hot

Botol Kultur

Berfungsi

menanam eksplan

sebagai

wadah

16

15. Botol Kultur Berfungsi menanam eksplan sebagai wadah 16 Sprayer Berfungsi untuk menyemprotkan alcohol 17. Hot

Sprayer

Berfungsi untuk menyemprotkan alcohol

17.

wadah 16 Sprayer Berfungsi untuk menyemprotkan alcohol 17. Hot Plate dan Magnetic Stirer Berfungsi untuk pemanasan

Hot Plate dan Magnetic Stirer

Berfungsi untuk pemanasan dan

menghomogenkan larutan dan media

18.

untuk pemanasan dan menghomogenkan larutan dan media 18. Alumunium Foil alas penimbangan bahan kimia dan sebagai

Alumunium Foil

alas

penimbangan bahan kimia dan

sebagai penutup botol kultur

Berfungsi

sebagai

19.

bahan kimia dan sebagai penutup botol kultur Berfungsi sebagai 19. Plastic Wrap Berfungsi sebagai pembungkus 20

Plastic Wrap

Berfungsi sebagai pembungkus

20

20.

20. Kertas label Berfungsi untuk melabeli botol kultur dan larutan stok 4.2 Hasil Sterilisasi Alat No

Kertas label

Berfungsi untuk

melabeli

botol

kultur dan larutan stok

4.2 Hasil Sterilisasi Alat

No

Gambar

 

Keterangan

 

1.

1. Botol kultur yang akan digunakan di beri label dan dikumpulkan menjadi satu dalam sebuah keranjang.

Botol kultur yang akan digunakan di beri label dan dikumpulkan menjadi satu dalam sebuah keranjang.

2.

2. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang

Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

3.

3.   Kemudian dimasukan keranjang
 

Kemudian

dimasukan

keranjang

yang

berisi

botol

kultur

kedalam

autoklaf

 

4.

4. Tutup autoklaf secara rapat dengan memutar gagang agar tidak ada uap yang keluar dari bibir

Tutup autoklaf secara rapat dengan memutar gagang agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf

21

5.

5. Nyalakan autoclave dengan menekan tombol pada bagian belakang autoklaf dan sambungkan kabelnya pada stopkontak

Nyalakan autoclave dengan menekan tombol pada bagian belakang autoklaf dan sambungkan kabelnya pada stopkontak

6.

6. Atur Suhu 121 ο C dengan waktu 15 menit dan tekanan 1 atm pada autoclave

Atur Suhu 121 ο C dengan waktu 15 menit dan tekanan 1 atm pada autoclave

7.

7. Setelah kurang lebih 1 jam dan alarm pada autoclave sudah berbunyi sebelumnya pada waktu 15

Setelah kurang lebih 1 jam dan alarm pada autoclave sudah berbunyi sebelumnya pada waktu 15 menit, buka sedikit tutup autoklaf secara pelan-pelan untuk mengeluarkan uap panas yang ada didalamnya tunggu sampai dingin kemudian alat yang ada didalamnya baru dapat diambil.

8.

8. Alat yang telah disterilisasi

Alat

yang

telah

disterilisasi

disimpan pada ruang penyimpanan.

4.1 Pembahasan Kultur in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan, atau organ yang steril, ditumbuhkan pada medium buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap (Nisa dan Rodinah, 2005).

22

Seperti yang kita ketahui dalam sebuah praktikum, praktikan diwajibkan mengenal dan memahami cara kerja serta fungsi dari alat-alat di laboratorium yang akan digunakan. Selain untuk menghindari kecelakaan dan bahaya, dengan memahami cara kerja dan fungsi dari masing-masing alat, praktikan dapat melaksanakan praktikum dengan sempurna. Dalam praktikum kultur jaringan pun tidak terlepas dari penggunaan alat-alat laboratorium yang menunjang dalam kegiatan kultur jaringan. Peralatan yang digunakan pada laboratorium kultur jaringan hampir sama dengan peralatan-peralatan yang ada di laboratorium pada umumnya, yaitu berupa alat-alat gelas antara lain : gelas beaker, Erlenmeyer, gelas ukur, cawan petri, pipet, mikropipet, botol kultur dan lain-lain. Di samping peralatan gelas tersebut, pada laboratorium kultur jaringan masih ada sejumlah alat yang identik untuk kegiatan kultur in vitro antara lain : autoklaf, Laminar air flaw (LAF), lemari pendingin, timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer, alat pengukur pH, rak kultur, alat-alat diseksi berupa scapel, pinset, spatula dan lain-lain. Alat-alat tersebut memiliki fungsi dan penggunaan yang berbeda, meskipun ada juga fungsi dan penggunaannya hampir sama. Selain memahami dan mengenal alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian kultur jaringan, bebrapa hal lain yang perlu diperhatikan adalah kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Misalnya penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya. Berdasarkan hasil praktikum, berikut adalah beberapa alat-alat yang umumnya digunakan dalam kegiatan kultur jaringan (Tabel 1.) diantaranya :

Autoclave merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi alat dan media kultur jaringan, peralatan yang biasa di sterilisasi menggunakan autoclave adalah alat- alat gelas dan alat diseksi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gabriel (1988) mengemukakan bahwa autoclave merupakan alat yang mampu mensterilkan bermacam-macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi yakni menggunakan uap air yang bertekanan panas. Jadi autoclave adalah alat yang digunakan untuk mensterilkan alat atau bahan-bahan yang dalam hal ini dugunakan pada teknik kultur jaringan. Autoclave bekerja berdasarkan prinsip

23

tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan mati apabila berada pada kondisi lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih bisa hidup pada kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang suhunya tinggi. Laminar Air Flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat ketika akan melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan, persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur jaringan. Alat ini disebut Laminar Air Flow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama, yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus disebut HEPA (High efficiency Particulate Air Filter), dengan menggunakan blower. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sriyanti dan Ari Wijayani (2012) prinsip kerja dari laminar air flow ini adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron. Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam laminar air flow sudah steril

yang

dan

lainnya, laminar air flow pun harus melalui tahap sterilisasi. Laminar air flow terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian dalamnya. Setelah sterilisasi dengan alkohol, pintu laminar air flow ditutup dan lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama 30 menit sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu ultraviolet (UV) pekerjaan dapat segera dimulai. Botol kultur digunakan sebagai tempat media yang digunkanan untuk menanam eksplan. Botol kultur ini harus dicuci hingga bersih terlebih dahulu menggunakan detergen. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada dinding botol guna menghindari kontaminasi. Selanjutnya dapat di sterilisasi menggunakan autoclave. Cawan petri atau petridish adalah jenis gelas piala yang dibutuhkan dalam kultur jaringan untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media. Cawan petri biasanya disterilisasi bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi

membuat

ruangan

menjadi

steril

pula.

bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi membuat ruangan menjadi steril pula. Sama seperti peralatan 24

Sama

seperti

peralatan

24

sebelumnya cawan petri ini harus dicuci bersih kemudian dikeringkan dan setelah kering dibungkus dengan kertas payung coklat untuk disterilisasi

selalu berpasangan, yang ukurannya agak

kecil sebagai wadah dan yang lebih besar merupakan tutupnya. Untuk cawan petri yang terbuat dari plastik dapat dimusnahkan setelah sekali pakai Magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan media yang akan dibuat nantinya. Magnet pengaduk ini nantinya akan berputar pada dasar botol dimana magnet akan menempel karena adanya gaya tarik menarik magnet. Kecepatan putaran dapat diatur sesuai keinginan. Ada beberapa jenis magnetic stirrer yang dilengkapi denganhot plate yang bisa digunakan untuk memanaskan. Hotplate adalah suatu alat yang berfungsi untuk menghomogenkan larutan dan juga untuk pemanas. Hotplate juga merupakan alat untuk mencampur dan memasak media kultur yaitu memasak segala macam bahan nutrisi dengan melibatkan pengaduk dan pemanas. Pengadukan dan pemanas yang dihasilkan oleh alat ini bersumber pada energi listrik. Besarnya kecepatan pengaduk dan pemanasan dapat diatur berdasarkan keperluan (Soeryowinoto,1996). Rak kultur merupakan alat yang digunakan sebagai tempat tempat untuk menyimpan botol-botol berisi eksplan hasil inokulasi dan mengoptimalkan pemanfaatan ruangan yang ada. Rak kultur dalam suatu laboratorium dipisahkan agar mengurangi terkontaminasinya bakteri atau jamur dengan media. Rak kultur biasanya disimpan berjajar dengan rakrak yang lainnya agar mudah mengamati media yang dikultur. Gelas piala merupakan wadah yang terbuat dari borosilikat. Gelas piala yang digunakan untuk bahan kimia yang bersifat korosif terbuat dari PTPE. Fungsi gelas piala pada kultur jaringan adalah untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan untuk pembuatan

dengan autoclave.

larutan yang akan digunkan untuk pembuatan dengan autoclave. Cawan Petridish media. Pada praktikum ini gelas ukur

Cawan Petridish

media.

Pada praktikum ini gelas ukur digunakan untuk mengukur jumlah larutan yang akan digunakan dalam jumlah cukup banyak seperti akuades. Gelas ukur termasuk dalam glass ware, ukuran volume gelas ukur bermacam-macam misalnya : 100 ml, 300 ml sampai 1000 ml. Gelas ukur biasanya jarang disterilkan karena penggunaannya hanya untuk pembuatan medium saja. Erlemeyer adalah

hanya untuk pembuatan medium saja. Erlemeyer adalah Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada

Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada dindingnya.

25

botol berdasar lebar, botol ini terbuat dari kaca bening yang tahan panas. Erlemeyer pada kultur jaringan dipergunakan untuk tempat dan sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. Ukuran erlemeyer bermacam-macam dari volume 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml, sampai 2 liter. Lampu spirtus atau bunsen digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel dan pinset) di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau sub-culture. Sterilisasi dengan menggunakan bunsen ini dengan cara mencelupkan dissecting kit kedalam alkohol kemudian dibakar diatas api bunsen. Pipet tetes berfungsi membantu memindahkan cairan dari wadah yang satu ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil tetes demi tetes. Pipet tetes ini memiliki ketelitian yang kurang dalam memindahkan larutan karena hanya dapat digunakan dengan perkiraan. Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekananfiller dengan udara. Dalam kultur jaringan pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan. Teknik penanaman eksplan harus diusahakan agar ujung pinset tidak mengenai media supaya tidak terkontaminasi. Scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau memotong eksplan. Scalpel ini termasuk dalam peralatan yang masuk kategori dissecting kit. Sebelum digunkan scalpel harus disterilisasi di dalam autoclave dan dengan di flamir yaitu scalpel dicelupkan dalam alkohol kemudian dibakar di atas api bunsen. pH meter digunakan untuk mengetahui nilai atau tingkat kemasaman suatu jenis bahan. pH meter sangat diperlukan karena dalam pembuatan media, ada parameter tingkat kemasaman yang harus dipenuhi yaitu diantara 5,7- 5,8. Cara menggunakan pH meter yaitu, sensor pada pH meter dicelupkan kedalam larutan yang akan dibuat menjadi media, nantinya akan muncul angka pada layar yang

26

menunjukkan nilai kemasaman larutan tersebut. Neraca analitik Berfungsi untuk menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media. Seperti yang kita ketahui seluruh kegiatan kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Artinya, seluruh bahan dan alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Termasuk ruangan laboratoriumnya dan pekerja yang melakukan. Sterilisasi ruangan biasanya dilakukan dengan menyalakan lampu UV selama beberapa menit dan menyemprotkan alkohol 70% . Sementara itu alat dan bahan yang digunakan disterilkan dengan memanaskan dalam autoclave atau direndam larutan sodium hipoklorit (kloroks). Bagi para pekerja, sebelum melakukan aktivitas di dalam laboratorium seluruh permukaan tubuhnya disemprot dengan alkohol 70% (Ir.Sentot,2008 ). Oleh karena itu dalam teknik kultur jaringan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur jaringan harus memenuhi persyaratan diantaranya media yang cocok, kondisi lingkungan yang sesuai dan dalam kondisi aspetis atau steril. Dalam menciptakan kondisi aseptic dan steril tersebut maka harus dilakukan sterilisasi pada semua komponennya baik pada peralatan, bahan/media, ruangan serta pekerjanya Dari Hal ini sesuai dengan pernyataan Suryowinoto Moeso (2000) Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan aseptic atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang digunakan, pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan. Berdasarkan pemaparan diatas maka dapat kita ketahui bahwa syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau steril untuk semua komponen dalam kultur jaringan. Kegiatan kultur diawali dengan sterilisasi alat dan bahan. Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu alat atau bahan yang bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti jamur dan bakteri. Alat-alat yang digunakan seperti botol kultur, cawan petri, erlenmeyer, batang pengaduk, gelas piala, pipet serta peralatan glass ware lainnya harus bersih dan steril. Sterilisasi alat yang dilakukan pada praktikum ini adalah menggunakan autoclave listril. Alat-alat yang di sterilisasi pada praktikum kali ini adalah botol kulur dengan menggunakan autoclave pada suhu 121˚C dengan

27

tekanan 1 atm selama 15 menit karena pada tekanan ini bakteri dan jamur yang terdapat dalam peralatan akan mati. Metode sterilisasi dengan menggunakan Autoclave ini disebut sterilisasi basah dengan prinsip uap air panas bertekanan, pada suhu 121°C pada tekanan 1 atm. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganism. Prinsip kerja autoklaf saat sumber panas dinyalakan air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf, setelah semua udara yang ada dalam autoklaf diganti dengan uap air maka katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik, dan pada saat tercapainya tekanan dan suhu yang sesuai maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur, setelah proses sterilisasi selesai sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi dan perlu diingat autokalaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Tidak semua bahan/media dapat disterilisasi dengan autoklaf ada beberapa bahan/media yang tidak dapat disterilkan dengan autoklaf misalnya serum vitamin yang merupakan bahan tidak panas, pelarut organic seperti fenol dan buffer. Hal ini sesuai dengan pernyataan Soeryowinoto (1996) Penting untuk dipahami bahwa tidak semua peralatan laboratorium tahan terhadap proses sterilisasi dengan pemanasan dan tekanan tinggi terutama peralatan yang terbuat dari plastik seperti polypropyline, polymethylpentene yang dapat di autoklaf berulang. Menurut Zumrona (2012) secara umum, sterilisasi uap air bertekanan dengan menggunakan autoclave yaitu hal pertama yang perlu diperhatikan sebelum melakukan sterilisasi adalah cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi atau aquades, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. Masukkan peralatan dan bahan yang akan disterilisasi, jika mensterilisasi botol tertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan. Selanjutnya tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. Lalu tekan tombol on pada bagian belakang autoklaf dan sambungkan pada listrik.

28

Selanjutnya di atur timer dengan waktu minimal 15 menit untuk sterilisasi peralatan dan 20 menit untuk sterilisasi bahan pada suhu 121 o C dengan tekanan 1 atm. Jika alarm tanda selesai berbunyi jangan langsung dibuka tutup autoklafnya, tapi tunggu sampai tekanan menurun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada pressure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep- klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Untuk sterilisasi petridish, pisau scalpel , pinset, dan alat-alat yang lain (alat- alat logam) terlebih dahulu dibungkus dengan kertas agar tidak kontak langsung dengan uap air autocalve. Petridish akan mudah rusak (pecah) jika mengalami kontak langsung dengan uap air yang panas. Sedangkan alat-alat seperti pisau scalpel dan pinset akan mudah berkarat jika berkontak langsung dengan uap air. Bagian yang ada tulisan dari kertas pembungkus harus diletakkan di bagian luar agar tinta yang larut nanti tidak mengotori alat yang ada di dalamnya. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

29

5.1 Simpulan

BAB V

PENUTUP

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pemahaman dan pengenalan alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan sangatlah penting, selain untuk menghindari kecelakaan dan bahaya, dengan memahami cara kerja dan fungsi dari masing-masing alat, praktikan dapat melaksanakan praktikum dengan sempurna. Peralatan yang digunakan pada laboratorium kultur jaringan antara lain : gelas beaker, Erlenmeyer, gelas ukur, cawan petri, pipet, mikropipet, botol kultur autoklaf, Laminar air flaw (LAF), lemari pendingin, timbangan analitik, hot plate dan magnetic stirrer, alat pengukur pH, rak kultur, alat-alat diseksi berupa scapel, pinset, spatula dan lain-lain. Dalam teknik kultur jaringan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur harus memenuhi persyaratan diantaranya media yang cocok, kondisi lingkungan yang sesuai dan dalam kondisi aspetis atau steril. Dalam menciptakan kondisi aseptic dan steril tersebut maka harus dilakukan sterilisasi pada semua komponennya baik pada peralatan, bahan/media, ruangan serta pekerjanya. Sterilisasi peralatan dan bahan/media dapat menggunakan alat yang dinamakan autoclave pada suhu 121 o C pada tekanan 1 atm dengan waktu 15 menit untu peralatan dan 20 menit untuk bahan/ media.

5.2 Saran

Adapun saran yang dapat saya sampaikan untuk praktikum kali ini adalah mengingat dalam kegiatan kultur jaringan sangat mengutamakan kebersihan dan kesterilan maka diharapkan semua komponen yang terlibat dalam kegaiatannya harus steril seperti penggunaan alat-alat yang bersih dan steril, bahan yang akan digunakan juga harus steril, ruangan sampai pada pekerja nya juga harus steril. Sterilisasi dilakukan sesuai dengan ketentuan yang berlaku agar tidak terjadi kontaminasi pada percobaan yang dilakukan yang dapat menyebabkan kegagalan

hasil kultur.

30

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, Mikrajuddin. 2006. IPA Fisika 1. Jakarta:Erlangga Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPB Press Gabriel, J. F., 1988. Fisika Kedokteran. Jakarta : EGC. Hadioetomo. Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T. Gramedia Pustaka Utama Handayani, Nuri. 2009. Buku Kantong Biologi SMA. Yogyakarta:Pustaka Widyatama. Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation: Principle And Practices. Sixth Ed. Ir. Sentot. 2008. Pesona Sansevieria. Jakarta : Agromedia Pustaka : Jakarta Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.

http://anekaplanta.wordpress.com/2008 /03/02/teknik-penyimpanan-dan- pemeliharaan-mikroba/. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:19 WIB. Nisa dan Rodinah. 2005. Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah Pisang (Musa pa rasidiaca L.) dengan Pemberian Campuran NAA dan Kinetin. J. Bioscientiae. 2 (2) : 23-26. Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers. Dordrecht.The Netherlands. Soenaryowinoto, M. 1996. Pemuliaan Tanaman secara In Vitro. Yogyakarta :

Kanisius. Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2012. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Yogyakarta :

Kanisius. Sulaiman, Achmad. 2013. Mengenal alat-alat laboratorium Mikrobiologi.

http://sulaiman-analis.blogspot.com/2013/09/mengenal-peralatan-

laboratorium_19.html?m=. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:42 WIB. Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius, Yogyakarta. Widiastoety, D. dan B. Marwoto.2004. Pengaruh Berbagai Sumber Arang dalam Media Kultur In Vitro terhadap Pertumbuhan Plantlet Oncidium. J. Hort. 14(1): 1-5, 2004 Winarsih, S. D. Santoso, dan T. Wardiyati. 2002. Embriogenesis Somatik dan Regenerasi dari Eksplan Embrio Zigotik Kakao (Theob roma cacao L.). http://www.sumutprov.go.id. Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 17. 14 WIB. Zumrona, Hilda. 2012. Sekilas Tentang Auoklaf.

http://hildabio12.blogspot.co.id/2012/12/sekilas-tentang-autoklaf.html.

Diakses pada tanggal 18 Maret 2018 pukul 16:02 WIB.

31

LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Botol Kultur Alat Sterilisasi Autoclave Penambahan Aquades

LAMPIRAN

LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Botol Kultur Alat Sterilisasi Autoclave Penambahan Aquades
LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Botol Kultur Alat Sterilisasi Autoclave Penambahan Aquades

Lampiran 1.

Lampiran 2.

Lampiran 3.

Botol Kultur

Alat Sterilisasi Autoclave

Penambahan Aquades kedalam Autoclave

Autoclave Penambahan Aquades kedalam Autoclave Lampiran 4. Botol Kultur Dimasukan dalam Autoclave Lampiran

Lampiran 4. Botol Kultur Dimasukan dalam Autoclave

Autoclave Lampiran 4. Botol Kultur Dimasukan dalam Autoclave Lampiran 7. Alat-Alat dalam Kegiatan Kultur Jaringan

Lampiran 7. Alat-Alat dalam Kegiatan Kultur Jaringan

Lampiran 7. Alat-Alat dalam Kegiatan Kultur Jaringan Lampiran 5. Pengaturan Suhu dan Waktu Sterilisasi Lampiran

Lampiran 5. Pengaturan Suhu dan Waktu Sterilisasi

Jaringan Lampiran 5. Pengaturan Suhu dan Waktu Sterilisasi Lampiran 8. Alat Pengukur pH Media (pH Meter

Lampiran 8. Alat Pengukur pH Media (pH Meter )

32

Lampiran 8. Alat Pengukur pH Media (pH Meter ) 32 Lampiran 6. Proses Sterilisasi Sedang Berlangsung

Lampiran 6. Proses Sterilisasi Sedang Berlangsung

(pH Meter ) 32 Lampiran 6. Proses Sterilisasi Sedang Berlangsung Lampiran 9. Bahan-Bahan dalam Kegiatan Kultur

Lampiran 9. Bahan-Bahan dalam Kegiatan Kultur Jaringan