Anda di halaman 1dari 11

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada perkembangan zaman ini, banyaknya metode yang digunakan untuk


memisahkan berbagai komponen dalam suatu senyawa campuran. Para peneliti
juga semakin dipermudah dengan adanya kemajuan teknologi yang
digunakan pada tekhnik pemisahan ini. Bukanhanya itu, selain alatnya yang
sederhana untuk dirancang, metode yang ditemukan juga bersifat ekonomis
karena kesederhanaan dalam penggunaannya. Teknik pemisahan yang dimaksud
adalah kromatografi.

Teknik kromatografi ini sendiri telah dikembangkan dan telah digunakan


untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang
kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik. Kromatografi
dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pengelompokkannya.
Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan
menjadi kromatografi absorbs, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion,
kromatografi penukar ion, kromatografi size eksklusif, serta kromatografi
afinitas. (Gandjar, 2007) Saat ini, kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang paling umum dan paling sering digunakan untuk bidang kimia analisis.
Baik untuk melakukan analisis kuantitatif, analisis kualitatif maupun analisis
preparative dalam bidang farmasi, lingkungan, industry, dan sebagainya. Dari
berbagai metode yang digunakan, penulis akan membahas tentang kromatografi
size eksklusi dimana pada dasarnya, pemisahan berbagai konstituen dengan
meninjau perbedaan ukuran dan geometri molekul. Adanya perbedaan ukuran
tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

a. Apa yang dimaksud dengan kromatografi ekslusi ?


b. Bagaimana prinsip dari kromatografi ekslusi ?
c. Bagaimanakah prosedur dala penggunaan kromatografi ekslusi ?
d. Apa saja intsrumentasi dari kromatografi ekslusi ?

1.3 Tujuan

a. Untuk mengetahui kromatografi ekslusi.


b. Mengetahui prinsip kromatografi ekslusi.
c. Mengetahui dan memahami prosedur penggunaan kromatografi ekslusi.
d. Mengetahui instrumentasi kromatografi ekslusi.

1.4 Manfaat

Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik kromatgrafi


size eksklusi teoritis maupun kromatgrafi size eksklusif praktis. Kromatgrafi size
eksklusi teoritis makalah ini berguna sebagai pengembangan wawasan tentang
kromatografi size eksklusi. Kromatgrafi size eksklusi praktis makalah ini
diharapkan bermanfaat bagi:
1. Penulis, sebagai sarana penambah wawasan dan pengetahuan khususnya
tentang kromatografi size eksklusi.
2. Pembaca, sebagai media informasi tentang kromatgrafi size eksklusi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Kromatografi Ekslusi

Sistem paling sederhana dari kromatografi cair adalah kromatografi kolom


terbuka. Sistem ini tergolong non-instrumental method. Hampir semua sampel
dapat dianalisis dengan metode ini dan tidak perlu pre treatment seperti
penguapan pada kromatografi gas. Hal yang menjadi kekurangan dari sistem ini
adalah keterbatasannya dalam menjaga laju alir fase gerak dan membuat fase
diam terpacking secara merata. Oleh karena itu dalam banyak kasus sering terjadi
pelebaran pita kromatogram. Ada banyak macam interaksi solut-fase diam-fase
gerak yang mendasari terjadinya proses pemisahan dalam kromatografi ini, yaitu:

1. Adsorpsi permukaan (didasarkan pada mekanisme adsorpsi-desorpsi solut


dalam fase diam).
2. Partisi (didasarkan pada partisis solut dalam fase diam dan fase gerak).
3. Ion exchange atau pertukaran ion (didasarkan pada pertukaran ion solute dan
fase diam).
4. Eksklusi (didasarkan pada perbedaan ukuran partikel solut)\

Kromatografi eksklusi juga disebut kromatogarfi permeasi gel. Proses


pemisahan didasarkan pada ukuran partikel solut. Sebagai fase diam adalah
material yang terkontrol ukuran partikelnya, bisa silika atau gelas yang ukuran
partikelnya terkontrol atau gel organik seperti agarosa dan poliakrilamid. Sistem
kromatografi ini biasa dipakai untuk menentukan ukuran partikel dari senyawa
polimer seperti protein. Partikel solut denan ukuran partikel besar akan terelusi
lebih cepat karena mereka melewati ruang antar partikel fase diam. Sebaliknya,
partikel solut dengan ukuran partikel kecil akan terelusi lebih lama karena
mereka harus melewati pori-pori fase diam. Kromatgrafi size eksklusi adalah
metode kromatografi molekul dalam larutan yang dipisahkan berdasarkan
ukuran partikel. Nama lain dari kromatgrafi size eksklusi yaitu gel filtration
chromatography (GFC), gel permeation chromatography (GPC), gel
chromatography, steric exclusion chromatography, dan exclusion
chromatography. Kata “gel” merupakan konotasi dari fase diam yang digunakan
yaitu gel organik yang semirigid dan nonrigid, sedangakan kromatgrafi size
eksklusi fase diamnya yaitu gel yang organic atau organic yang rigid.
Kromatografi size eksklusi biasa digunakan dalam pemisahan molekul yang
besar atau kompleks makromolekul seperti protein. Untuk pemisahan yang
biasanya makromolekul dalam fase gerak larutan disebut Gel Filtration
Chromatography sedangkan ketika pemisahan dilakukan di dalam fase gerak
non-larutan disebut Gel Permeation Chromatography.

2.2 Prinsip Kromatografi Size Eksklusi

Gambar 2.2 Proses pemisahan kromatografi size ekslusi (Mori&Sadao, 1999)

Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase diam. Solut
dengan ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-pori adsorben sehingga tertahan,
sedangkan solute dengan ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben akan terelusi
lebih dulu. Berikut gambar proses pemisahan menggunakan kromatografi size
eksklusi (Sastrohamidjojo H, 1985).

2.3 Prosedur Kromatografi Eksklusi


Sebelum melakukan pemisahan atau pemurnian zat dilakukan terlebih
dahulu dilakukan persiapan seperti pemilihan fase gerak dan fase diam,
persiapan sampel yang akan dipisahkan setelah itu barulah dilakukan proses
pemisahan menggunakan kromatografi size Eksklusi.
Berikut ini tahapa-tahapan untuk melakukan pemisahan menggunakan
kromatografi size eksklusi :
1. Pemilihan fase gerak
Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:
a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam.
b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem
kromatgrafi size eksklusi sehingga dapat dijalankan dengan range
tekanan yang normal.
c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang
kuat dengan fase diam (contoh: lewat adsorpsi).
Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase gerak larutan, fase gerak
organik atau dalam larutan buffer.
2. Pemilihan fase diam
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solute dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam.
Fase diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:
a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel.
b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak,
tetapi tidak mengalami efek pembengkakan.
c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur.
d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran
pori sehingga dapat melakukan distribusi berat molekul sampel
yang memadai.
Fase diam yang digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa,
poliakrilamid atau silika yang memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran
pori yang ada pada fase diam ini berkisar 60 4000 Å dengan ukuran partikel
berkisar 5-10 µm dengan efisiensi ribuan theoritical plate setiap 15 cm
kolom. Untuk fase gerak organik, kolom yang biasa digunakan yaitu
crosslinked (dengan difinilbenzen) gel polistiren atau trimetilsilane
turunan silika. Untuk fase gerak larutan yang digunakan yaitu crosslinked
hidroksilat polimetakrilat atau gel poli (propilen oksida) atau gliseril (diol)
turunan silika. Contoh fase diam yang dapat digunakan pada Size Exclusion
Chromatography. Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein.
Bahan disintesis dari polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus
hidroksil menyebabkan dekstran menjadi polar sehingga dapat direaksikan
dengan epiklorhidrin CH2(O)CHCH2Cl. Polimer yang terjadi dapat dikontrol
dengan penambahan asam.
 Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang
dibuat dengan kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N’ metal-bis-akrilamid.
Senyawa ini tidak larut dalam air maupun beberapa pelarut organik.
 Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul >500.000
,dinamakan juga Bio-Gel A. dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga agak
lunak dan tidak tahan tekanan tinggi.
 Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali
dalam air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel
dibuat dari polistiren yang tahan pada suhu di atas 150 C. berat molekul
senyawa yang dapat⁰ dipisahkan antara 16.000 – 40.000 dalton.

Tabel 2. 3. Klasifikasi solven menurut Snyder


GOLONGAN CONTOH SOLVEN
I ETER ALIFATIK, ALKIL AMINA
II ALKOHOL ALIFATIK
TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,
III
AMIDA
IV FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL
V DIKLORMETAN, 1,2-DIKLOROETIL
ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL BENZENA DAN
VI DERIVATNYA

VII KLOROFORM, M
VIII -KRESOL, AIR

Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena beberapa
alasan, antara lain :

a. Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan


b. Menimbulkan interaksi kimia
c. Mengganggu sinyal deskositas sangat tinggi
d. Toksik dan mudah terbakar
e. Tektor, seperti dapat menyerap sinar ultra violet.
f. Tekanan uapnya terlalu tinggi
g. Terlalu mahal
Dari sekian jenis solven yang paling sering digunakan adalah :
a. Metanol, mewakili golongan asam
b. Asetonitril, mewakili golongan basa
c. Terra hidro furan, mewakili golongan yang mempunyai momen dipol
besar.
d. Air, untuk mengatur polaritas
Syarat fase gerak yang baik untuk kromatografi cair adalah :
a. Viskositas rendah
b. Tersedia dalam kemurnian yang tinggi
c. Tidak menginterferensi sinyal detector
d. Dapat bercampur dengan fase gerak yang lain
Untuk meningkatkan resolusi pemisahan dan efektifitas elusi, maka teknik
elusi dapat dikembangkan, yaitu dengan teknik elusi gradien. Elusi gradient
adalah elusi menggunakan komposisi fase gerak yang diubah-ubah secara
terprogram, sedangkan bila elusi dikerjakan dengan satu macam komposisi
fase gerak mulai dari start hingga finish disebut elusi isokratik. Perubahan
komposisi fase gerak dapat dikerjakan secara linear atau non linear (curved
program). Dengan teknik elusi gradien maka resolusi dapat diatur sedemikian
rupa sehingga waktu analisis dapat dipersingkat. Teknik elusi gradien ini
terutama ditujukan untuk :
a. Sampel yang terdiri dari campuran senyawa yang meiliki kisaran harga
factor kapasitas 0.5<k'<20.
b. Sampel yang terdiri dari molekul-molekul dengan berat molekul cukup
besar (BM>1000).
c. Sampel yang mengandung senyawa pengganggu dengan waktu retensi
sangat besar.
d. Sampel dengan konsentrasi sangat encer sehingga volume yang dianalisis
sangat banyak. Dengan teknik ini diharapkan dapat meminimalkan
pelebaran pita kromatogram karena overload volume.

2.4 Instrumentasi kromatografi Ekslusi

HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC


digunakan untuk analisis senyawa yang non vol dalam HPLC merupakan
material yang dipacking dalam kolom dan memiliki ukuran partikel berdiameter
3 melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada
kromatografi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase
gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat
memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan
pemisahan yang maksimal. Pilihan detektor untuk HPLC lebih terbatas bila
dibandingkan dengan kromatografi gas. Detektor yang paling banyak
dipergunakan adalah spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang
dapat mengabsorpsi sinar saja yang dapat dianalisis.
Solven atau fase gerak untuk HPLC hendaknya memenuhi kriteria :

a. Mempunyai kemurnian tinggi.


b. Sebelum digunakan disaring terlebih dahulu dengan kertas saring dengan
ukuran pori 0.2 µm.
c. Bebas dari gas yang dapat mengganggu detektor atau menyumbat
kolom.Dapat dilakukan dengan memanaskan solven sebelum digunakan atau
mengaplikasikan motor vaccum.
Keterangan Bagan Alat HPLC Gradient controller atau pengatur gradien,
adalah alat untuk mengatur komposisi fase gerak apabila elusi dikerjakan secara
gradient Pump/dampning system, adalah pompa yuntuk menyedot fase gerak
yang dilengkapi dengan peredam getaran, sehingga aliran fase gerak stabil tidak
dipengaruhi oleh getaran pompa selama bekerja. Sample introduction, adalah alat
untuk memasukkan sampel biasanya berupa rotary loop. Ketika injektor berada
dalam posisi load sampel dimasukkan dengan bantuan syringe, sehingga sampel
akan memenuhi tempat penampungan sampel. Bila volume sampel terlalu besar,
maka kelebihan sampel akan terbuang secara otomatis ke saluran pembuangan
(vent). Ketika injektor ini diposisikan inject, maka aliran fase gerak akan
berubah, fase gerak akan mengalir dengan membawa sampel ke arah kolom.
Column/Pre column, adalah bagian jantung pemisahan dalam HPLC. Kolom
biasanya terbuat dari bahan stainless steel dan ukuran diameter dalam terukur
dengan presisi tinggi. Guard column adalah kolom berukuran kecil yang
diletakkan di antara injektor dan kolom analitik. Fungsinya adalah untuk
menahan senyawa yang kemungkinan dapat menyumbat kolom analitik. Fase
diam dibuat dari jenis bahan yang sesuai dengan fase diam pada kolom analitik.
Kolom analitik biasanya berukuran panjang 15 cm, diameter dalam 4.6 mm
dengan ukuran partikel fase diam 10 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik
sekitar 5000), 5 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 9000), 3 µm
(memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 15000). Agar diperoleh hasil
pemisahan yang baik, maka perlu dilakukan evaluasi kolom secara berkala.
Evaluasi terhadap kelayakan kolom dapat dipantau dengan mengevaluasi harga
beberapa parameter di bawah ini secara berkala :

a. Faktor kapasitas berkisar 2-10.


b. Jumlah lempeng teoritik tidak mengalami perubahan yang signifikan.
c. Faktor resolusi (Rs) harus > 1.5.
d. Peak asimetri < 1.2.
Tekanan kolom dalam kisaran normal (dapat dikerjakan oleh pompa dengan
ringan)
Ada banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom sehingga harus
dioptimasi agar diperoleh pemisahan yang baik, yaitu :
a. Kecepatan alir fase gerak, kecepatan alir yang sangat lambat akan
menyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat akan
menyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga terjadi
pelebaran pita kromatogram.
b. Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi
semakin baik.
c. Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besar sehingga
dibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar.
d. Panjang kolom, semakin panjang akan semakin besar harga efisiensi kolom,
tetapi dapat menyebabkan terjadinya pelebaran pita.
e. Viskositas fase gerak, semakin kecil harga viskositas fase gerak maka
efisiensi kolom semakin besar.
f. Temperatur, semakin tinggi temperatur maka viskositas semakin rendah dan
efisiensi kolom menjadi lebih besar.
g. Volume ekstra kolom, semakin besar volume ekstra kolom maka
kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga efisiensi
semakin berkurang.
h. Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel
sangat besar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin
besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.
Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut
yang sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi,
batas deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada
banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :
a. Detektor spektrofotometer UV/Vis, merupakan detektor universal dan dapat
diaplikasikan pada semua analit yang dapat menyerap sinar uv/vis.
b. Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang
gelombang yang dipilih.
c. Detektor spektrofluorometer, merupakan detektor yang lebih selektif dan lebih
sensitif daripada detektor spektrofotometer.
d. Tidak semua senyawa bersifat fluoresens dan tidak semua senyawa yang
berfluorsens memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama
dengan senyawa lain.
e. Detektor indeks bias, merupakan detektor yang sinyalnya tergantung pada
perubahan harga indeks bias fase gerak oleh karena adanya analit atau solut.
Detektor elektrokimia, ada banyak jenisnya antara lain :
1. Detector konstanta dielektrika (didasarkan pada perubahan polaritas fase
gerak oleh karena adanya solut), detektor konduktometer (didasarkan
pada perubahan sifat penghantaran listrik dari fase gerak oleh karena
adanya solut), detector amperometer (didasarkan adanya perubahan
kekuatan medan listrik dari fase gerak karena adanya solut). Contoh
Aplikasi Pemisahan Peptida Dan Protein Dengan Rp-HPLC Kondisi Awal
Yang Bisa Dipakai:

VARIABEL PEPTIDA PROTEIN

C4, C3, CN
C18 atau C8
Kolom Bonded 0.46 x 5-15 cm
0.46 X 15 atau 25 cm
phase 3.5-10 µm
3.5-10 µm (diameter)
Dimensi Partikel (diameter)
80-300 A° (pori)
300 A° (pori)

0.12% TFA/air 0.12% TFA/air


Fase gerak Solven A
0.10%TFA/air 0.10%TFA/air
Solven B Gradien
0-60% B/60 menit 0-60% B/60 menit

Temperatur 40 - 80 °C 40 - 80 °C

Kecepatan alir 0.5 - 2 ml/menit 0.5 - 2 ml/menit

Ukuran sampel
10-50 µL 10-50 µL
Volume
1-100 µg 1-100 µg
Berat

Problem yang mungkin muncul:

a. Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing Recovery rendah.


b. Timbul pita yang misterius.
c. Pita ganda untuk satu jenis analit.
d. Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel.
Faktor penyebab :

a. Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran poriporinya
Denaturesi sampel Isomerisasi (cis ke trans)
Pengatasannya :
 Pemisahan pada ph rendah (fase gerak 0.1 % Tetra fluoro Acid.
 Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang
hidrofob gunakan propanol.
 Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 - 80°c.
 Gunakan zwitterionic detergent

BAB III

PENUTUP

3.1. Kesimpulan

kromatografi size eksklusi adalah metode kromatografi molekul dalam


larutan yang dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Prinsip kerja dari
kromatgrafi size eksklusi adalah Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara
solut dengan fase diam. Solut dengan ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-
pori adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut dengan ukuran lebih besar dari
pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu. Biasanya kromatgrafi size eksklusi
digunakan dalam pemisahan molekul yang besar atau kompleks makromolekul
seperti protein.
DAFTAR PUSTAKA