BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kanker merupakan penyebab kematian terbesar kedua pada wanita di

seluruh dunia, yaitu 14% dari seluruh kematian pada wanita, sedangkan di

wilayah Asia Tenggara kanker berada di urutan keempat. Menurut data World

Health Organization (WHO) International Agency for Research on Cancer

(IARC) tahun 2012, diperkirakan jumlah kasus baru kanker adalah sebesar 6,7

juta dan jumlah kematian perempuan di seluruh dunia akibat kanker adalah

sebesar 3,5 juta. Angka insidensi kanker pada perempuan diperkirakan akan

mengalami peningkatan sebesar 9,9 juta kasus pada tahun 2030.1

Dengan meningkatnya insidensi kanker pada wanita, pengembangan

modalitas dalam tatalaksana kanker juga telah mengalami peningkatan, termasuk

dalam hal teknik pembedahan, radioterapi, kemoterapi, dan hematopoietic stem

cell transplantation (HSCT). Oleh karena itu, jumlah pasien yang bertahan setiap

tahunnya menjadi lebih banyak, namun harus menghadapi risiko dari efek

samping jangka panjang dari pengobatan, khususnya yang berkaitan dengan

sistem reproduksi. Pengobatan kanker, khususnya radioterapi dan kemoterapi

yang bersifat gonadotoksik, dapat menyebabkan kegagalan ovarium dini

(premature ovarian failure) dengan merusak oosit dan folikel ovarium wanita,

yang berujung kepada gangguan perkembangan pubertas, produksi hormon, dan

infertilitas.2-6
 Infertilitas merupakan kegagalan suatu pasangan untuk mendapatkan

kehamilan dalam 12 bulan berhubungan seksual secara teratur tanpa kontrasepsi,

atau disebut juga sebagai infertilitas primer. Infertilitas sekunder adalah

ketidakmampuan seseorang memiliki anak atau mempertahankan kehamilannya.

Pada perempuan di atas 35 tahun, evaluasi dan pengobatan dapat dilakukan

setelah 6 bulan pernikahan. Menurut Konsensus Penanganan Infertilitas HIFERI

tahun 2013, prevalensi perempuan yang mengalami infertilitas primer pada usia

25-49 tahun di Indonesia adalah sebesar 6%. Pengobatan dari infertilitas

bergantung pada penyebab infertilitasnya, diantaranya perubahan gaya hidup,

pengobatan secara farmakologi, pembedahan, atau teknik reproduksi dengan

bantuan (assisted reproductive technology/ ART).5,7-8

Di era modern sekarang ini, teknik reproduksi dengan bantuan mulai

dikenalkan dan pemanfaatannya di dunia telah menghasilkan pengembangan

teknik kriopreservasi. Kriopreservasi merupakan suatu metode yang digunakan

untuk mengamankan jaringan manusia pada suhu yang sangat rendah (dapat

mencapai -170ºC) dengan menggunakan cairan nitrogen. Ada beberapa teknik

kriopreservasi yang sedang dikembangkan untuk pasien wanita, yaitu

kriopreservasi embrio, kriopreservasi oosit, kriopreservasi jaringan ovarium

(folikel), dan kriopreservasi seluruh ovarium.9-10

Dalam beberapa tahun belakangan, kriopreservasi dari folikel pre-antral

pada manusia tampaknya menjadi menjadi alternatif untuk mempertahankan

kesuburan pada wanita dengan risiko premature ovarian failure dan pasien kanker

yang menjalani kemoterapi atau radioterapi. Teknik kriopreservasi telah

diterapkan pada oosit dan jaringan ovarium manusia yang matur maupun imatur,
dan teknik ini merupakan teknik pilihan karena tingkat post-thaw survival

(kelangsungan hidup jaringan setelah dicairkan), implantasi, dan kelahiran yang

dapat diterima. Penelitian menunjukkan bahwa terjadi perbaikan fungsi ovarium

dalam memproduksi hormon dan perkembangan folikel setelah dilakukan

transplantasi dari jaringan ovarium yang telah dibekukan, dan beberapa telah

dilaporkan berhasil mendapat kehamilan.9,11

Walaupun telah banyak usaha untuk mengembangkan prosedur

transplantasi, persentase folikel yang sudah ditransplantasikan menjadi rusak

karena iskemia cukup besar. Beberapa penelitian juga memaparkan bahwa dalam

jaringan yang sudah ditransplantasikan terdapat risiko adanya transmisi sel

kanker. Untuk menghindari risiko ini, folikel yang diisolasi sebaiknya

dikembangkan secara in vitro. Namun, kultur in vitro dari folikel antral yang

diisolasi dari ovarium manusia belum memiliki hasil yang memuaskan dan belum

banyak penelitian yang telah dilakukan.9

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Fisiologi Perkembangan Folikel Ovarium

Folikel ovarium adalah bagian yang sangat penting dari sebuah ovarium.

Ovarium terdiri dari oosit yang akan mengalami ovulasi, fertilisasi dan

membentuk embrio. Ovarium juga menghasilkan steroid dan hormon protein yang

dibutuhkan selama siklus ovarium, pembentukan karakteristik seks sekunder, dan

persiapan uterus selama proses implantasi. Pembentukan folikel dan

folikulogenesis telah banyak diteliti pada mamalia.12

Ketika seorang anak perempuan dilahirkan, masing – masing ovum

dikelilingi oleh selapis sel –sel granulosa; ovum, dengan selubung sel ganulosa

tersebut disebut folikel primordial. Sepanjang masa kanak – kanak, sel granulosa

diyakini berfungsi memberi makanan untuk ovum dan menyekresikan suatu faktor

penghambat pematangan oosit, yang membuat ovum tetap bertahan dalam

keadaan primordial dalam fase pembelahan meiosis. Secara in vitro, aktivin

muncul untuk menstimulasi sel granulosa dalam pembagian folikel. Kemudian

sesudah pubertas, bila hormon Follicle Stimulating Hormone (FSH) dan

Luteneizing Hormone (LH) dari kelenjar hipofisis anterior mulai disekresikan

dalam jumlah cukup, seluruh ovarium, bersama dengan folikelnya, akan mulai

tumbuh.13

Tahap pertama pertumbuhan folikel berupa pembesaran sedang dari ovum

itu sendiri, yang meningkatkan diametrnya menjadi dua sampai tiga kali lipat.

Kemudian diikuti dengan pertumbuhan lapisan – lapisan sel granulosa tambahan

di dalam folikel. Folikel –folikel inilah yang disebut dengan folikel

primer.1,2- Selama beberapa hari pertama setiap siklus seksual bulanan wanita,

konsentrasi FSH dan LH yang disekresi oleh kelenjar hipofisis anterior meningkat

sedikit demi sedikit menjadi sedang, dengan peningkatan FSH yang sedikit lebih

besar daripada LH. Hormon – hormon ini, khususnya FSH mampu mempercepat

pertumbuhan 6 sampai 12 folikel primer setiap bulan. Efek awalnya adalah

proliferasi se – sel granulosa yang berlangsung cepat yang menyebabkan

penambahan lapisan pada sel –sel tesebut. Sel – sel granulosa juga bertanggung

jawab terhadap pembentukan esterogen, androgen, insulin, dan insuline growth

factor.14

Selain itu, sel- sel berbentuk kumparan yang dihasilkan oleh interstitium

ovarium berkumpul dalam beberapa lapisan luar di granulosa mmbentuk massa

sel kedua yang disebut dengan teka. Teka terbagi dua, yaitu teka interna dan

eksterna. Di dalam teka interna, sel –sel mempunyai karakteristik epitelium yang

mirip dengan sel – sel granulosa dan mempunyai kemampuan menyekresi hormon

steroid seks tambahan (estrogen dan progesteron). Sedangkan lapisan luar yaitu

teka eksterna berkembang menjadi kapsul jaringan ikat yang sangat vaskular.

Kapsul ini akan menjadi kapsul dari folikel yang sedang tumbuh.13

Sesudah tahap awal pertumbuhan proliferasi yang berlangsung selama

beberapa hari, massa sel granulosa menyekresi cairan folikular yang mengandung

esterogen dalam konsentrasi tinggi. Pengumpulan cairan ini yang menyebabkan

munculnya antrum di dalam sel granulosa. Pertumbuhan awal folikel primer

menjadi tahap antral yang dirangsang oleh FSH sendiri. Kemudian akan terjadi

peningkatan pertumbuhan secara besar –besaran menuju ke pembentukan folikel

yang lebih besar lagi, yaitu folikel vesikular. Secara singkat, peningkatan tersebut

melewati beberapa tahap, yaitu: (1) esterogen disekresikan ke dalam folikel dan

menyebabkan sel – sel granulosa membentuk jumlah reseptor FSH yang semakin

banyak; keadaan ini menyebabkan suatu efek umpan balik positif karena

esterogen membuat sel – sel granulosa menjadi lebih sensitif terhadap FSH. (2)

FSH dari hipofisis dan esterogen bergabung untuk memacu reseptor LH sel

granulosa sebenarnya, sehingga terjadi rangsangan LH sebagai tambahan terhadap

rangsangan FSH dan membentuk peningkatan sekresi folikular yang lebih cepat.

(3) peningkatan jumlah esterogen dari folikel ditambah dengan peningkatan LH

dari kelenjar hipofisis anterior bersama – sama bekerja untuk menyebabkan

proliferasi sel – sel teka folikular dan juga meningkatkan sekresi folikular.13

Sekali folikel antral tumbuh, pertumbuhan folikel akan terjadi sangat

cepat. Diameter ovum akan membesar sampai tiga kali lipat lagi, menghasilkan

ovum dengan diameter total sepuluh kali lipat diameter awal atau peningkatan

massa sebesar 1000 kali lipat. Setelah pertumbuhan selama satu minggu atau

lebih tetapi sebelum terjadi ovulasi, salah satu dari folikel mulai tumbuh lebih

cepat melebihi yang lain; bersisa 5 sampai 11 folikel yang tumbuh berinvolusi

(suatu proses yang disebut atresia), dan sisa folikel ini dikatakan menjadi atretik.

Hal ini diduga karena sejumlah esterogen yang berasal dari folikel yang tumbuh

paling cepat bekerja pada hipotalamus untuk lebih menekan kcecepatan sekresi

FSH oleh kelenjar hipofisis anterior dengan cara menghambat pertumbuhan lebih

jauh folikel – folikel yang kurang berkembang. Oleh karena itu, folikel yang

paling besar dapat melanjutkan pertumbuhannya karena pengaruh efek – efek

umpan balik positif intrinsik yang dimilikinya, sementara semua folikel yang lain

berhenti tumbuh, dan mengalami involusi.13

Proses atresia ini sangat penting, kerena bisanya peristiwa tersebut

normalnya hanya membuat satu folikel tumbuh sampai cukup besar untuk

berovulasi setiap bulan. Hal ini terjadi untuk mencegah terjadinya kehamilan

ganda. Folikel tunggal tersebut mencapai diameter 1 sampai 1,5 sentimeter pada

saat ovulasi dan disebut folikel matang. Folikel yang tidak atretik, di bawah

regulasi hormon gonadotropik akan mencapai tahap preovulatori. 13

Pada tahap ini folikel tersebut menjadi folikel Graaf yang merupakan

sumber utama sekresi esterogen. Sebagai akibat dari puncak hormon gonadotropin

pada masing – masing siklus reproduksi, folikel Graaf yang dominan akan

berovulasi melepaskan oosit agar terjadi fertilisasi, dimana sel teka dan granulosa

akan mengalami transformasi menjadi korpus luteum yang berkontribusi pada

sirkulasi hormon progesteron.13-14

Selama tahap akhir perkembangan, FSH adalah stimulator utama dari

perkembangan folikel dan secara klinis FSH digunakan sebagai agen konsentrat

terapeutik pada perkembangan awal antral hingga menjadi salah satu tatalaksana

infertilitas. Beberapa studi menyetujui adanya regulasi hormon pada folikel

preantral, termasuk aktivasi folikel primordial normal dan perkembangan folikel

primer dan folikel sekunder ke tahap awal folikel antral.15

 Gambar 2.1. Regulasi hormon pada pertumbuhan folikel antral.15

Folikel primordial yang akan berkembang menjadi matur dipilih secara

selektif pada tahap awal oleh kontrol sinyal AKT dan mTOR (proses perekrutan

inisial) dimana folikel primordial lainnya akan dihentikan oleh faktor-faktor

dorman. Sekali pertumbuhan dimulai, folikel primordial tersebut akan

berkembang menjadi tahap primer dan sekunder sebelum membentuk rongga

antral. Meskipun hampir semua folikel antral akan mengalami atresia, folikel

antral yang telah dipilih akan dikendalikan oleh perubahan siklus FSH dan LH

kelenjar ptiutari, akan mencapai tahap preovulasi dan mampu mensekresikan oosit

matur setelah ovulasi agar fertilisasi terjadi (rekrutmen siklik).15

Penelitian terbaru kini fokus pada regulasi hormonal dan perkembangan

bertahap suatu folikel (primordial, primer, sekuder). Penelitian terbaru

menyatakan bahwa C-type natriuretic peptide (CNP) adalah sebuah faktor

stimulan folikel. Natriuretic peptide terdiri atas tiga struktur molekul,yaitu atrial
natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), dan CNP. CNP

adalah simbol dari gen NPPC (Natriuretic Peptide Precursor C) yang

diekspresikan oleh tipe sel yang berbeda dimana prekursor NPPC terbagi menjadi

22 asam amino peptida. CNP adalah faktor penting dalam ovarium yang bekerja

sebagai selamapertumbuhan folikel preantral dan antral sebagai inhibitor dari

proses pematangan oosit. CNP dihasilkan oleh sel granulosa pada folikel sekunder

dan folikel antral sebagai respon terhadap stimulasi FSH. CNP bekerja bersama

reseptornya untuk memproduksi cGmp di dalam kumulus. CNP mengaktivasi

reseptor yang serumpun dengan NPRB (natriuretic peptida receptor-B), yang

dikenal sebagai NPR2 atau guanylyl cyclase B (GC-B), dimana ANP dan BNP

menstimulasi reseptor natriuretik A, yang dikenal sebagai NPR1 atau guanylyl

cyclase (GC)-A. Kedua reseptor ini adalah ezim pada membran guanylyl cyclase

yang memberi sinyal melalui produksi second messenger cGMP dan mengalami

desensitisasi homolog dan heterolog yang dicerminkan dengan deposporilasi dari

bagian khusus domain kinase. mANP dan BNP bertindak sebagai hormon

endokrin yang merelugasi tekanan darah, volume, dan menghambat terjadinya

hipertrofi otot jantung, sedngkan CNP bekerja dengan cara baik autokrin maupun

parakrin dalam menginduksi pertumbuhan tulang dan untuk meningkatkan

relaksasi pembuluh darah.15

Studi terbaru sebelumnya melaporkan adanya ekspresi NPPC dan NPRB

di ovarium dan regulasinya oleh hormon gonadotropin. Proses transkripsi untuk

reseptor NPPC dan NPRB diekspresikan di sel ganulosa dan kumulus pada

folikel antral dan folikel preovulatori. Adapun penatalaksanaan komplex

kumulus-oosit dengan CNP menstimulasi produksi cGMP yang bekerja di sel

kumulus. Karena adanya taut erat diantara kumulus dan oosit, cGMP akan

menyebar kedalam oosit untuk menekan aktivitas phospodiesterase 3 (PDE3),

menyebabkan peningkatan level intraoosit meningkat dan oosit matang. Sebelum

lonjakan LH, level CNP yang tinggi mencegah proses pematangan oosit dimana

lonjakan LH dalam fase ovulasi menekan level CNP pada ovarium dan cairan

folikel , dan diikuti dengan penghancuran oosit oeh vesikel germinalis.15

FSH secara predominan dimediasi oleh proses signaling cAMP dimana

aktivitas CNP secara eksklusif dimediasi oleh cGMP bukan cAMP. Meskipun

peran cGMP dalam pertumbuhan folikel masih perlu dijelaskan, sangat menarik

bahwa NPRB hipomorfi tikus menunjukkan gangguan meiosis namun dapat

mempertahankan perkembangan folikel yang normal, mengingat FSH dan CNP

memiliki peran tumpang tindih dalam perkembangan folikel. Studi in vivo pada

mencit mengkonfirmasi kemampuan CNP untuk memulai proses pertumbuhan

ovarium yang secara sukses diinduksi oleh hormon gonadotropin. Layaknya FSH,

CNP yang memiliki peran sama dalam perkembangan ovarium, pengobatan

dengan CNP saja pada tikus pubertas (tanpa FSH eksogen) memulai pertumbuhan

folikel dalam tahap preovulasi, yang diinduksi secara efisien oelh LH/hCG. Oosit

matur yang akan diperoleh setelah penatalaksanaan CNP siap dibuahi dan dapat

berkembang menjadi blastosit secara in vitro. Oleh karena itu, CNP yang

disekresikan oleh folikel yang sedang tumbuh mampu menstimulasi pertumbuhan

folikel preantral dan antral.15

 Gambar 2.2. CNP sebagai faktor intaovarian yang penting dalam
pertumbuhan folikel preantral dan antral.15

Hanya sebagian kecil dari sekumpulan folikel yang akhirnya mencapai

tahap akhir dari proses maturasi ovulasi. Fungsi terpenting dari folikel ovarium

adalah agar oosit yang siap dibuahi diperoleh sehingga terbentuk spesies – spesies

baru. Tahap akhir perkembangan folikel ini hanya dapat dicapai oleh folikel yang

sehat dan yang akan menghasilkan oosit yang sehat. Salah satu mekanisme yang

terlibat adalah sektresi faktor parakrin dari oosit yang ditunjukkan dengan

dimulainya perkembangan sel granulosa, seperti R-spondin2, GDF9 (growth

differentiation factor-9) dan BMP 15 (bone morphogenic protein -15).15

Transkripsi R-spondin 2 terdapat secara eksklusif pada oosit primer dan

folikel yang lebih besar tetapi tidak pada folikel primordial. Padakultur sel

somatik yang diisolasi dari folikel antral, R-spondin2 bekerja sinergis dengan

ligan WNT (Wingless)yang menstimulasi proses signaling WNT. Pada kultur

ovarium mencit yang belum pubertas, R-spondin2 yang mirip dengan FSH
memulai perkembangan folikel primer sampai menjadi folikel antral. Oleh karena

itu, R-spondin2 yang dihasilkan oleh oosit adalah faktor parakrin yang penting

untuk perkembangan folikel preantral. Jika dibandingkan dengan mekanisme

kerja R-spondin2 yang diidentifikasi pada manusia, agonis R-spondin dapat

menjadi salah satu terapi baru pada wanita – wanita infertil yang tidak berespon

baik dengann terapi hormon gonadotropin.15

Baik R-spondin2, GDF9, dan BMP15 adalah faktor yang dihasilkan oleh

oosit, yang merupakan milik superfamili protein TGF (transforming gowth

factor)-beta dan berikatan dengan serin kinase (RSKs) yang menstimulasi proses

signaling. Studi pada mencit menjelaskan bagaimana penyuntikan GDF9 pada

mencit yang tidak memiliki GDF9 meningkatkan pertumbuhan serta diferensiasi

folikel preantral pada kultur dan memulai biosintesis androgen pada sel teka.

GDF9 juga memiliki peran antiapoptosis selama perkembangan folikel

berlangsung. BMP15, gen paralog GDF9, juga diekpresikan dalam oosit melalui

folikulogenesis dan merupakan stimulator poten untuk prolifeasi sel granulosa.

Pada mencit, ketidaktersediaan BMP15 memang akan menurunkan kecepatan

ovulasi, namun tidak menyebabkan steril.15

Dalam sebuah ovarium, folikel primordial terletak di daerah korteks yang

merupakan struktur yang lebih kaku daripahda lamisan medular yang terletak

lebih dalam. Ada banyak mekanisme didalam ovarium yang sampai saat ini belum

dapat diketahui secara pasti yang dapat menjelaskan bagaimana folikel – folikel

yang lain berada dalam keadaan dorman. Sekali folikel primordial tersebut

diaktivasi untuk berkembang, Hippo signaling dari sebuah sel dalam folikel yang

berada dekat dengan korteks akan terganggu. 14-15

 Jalur Hippo signaling adalah sebuah mekanisme dalam sel untuk

mempertahankan ukuran optimalnya. Hippo signaling diatur bedasarkan lokasi

masing – masing folikel yag ada dalam ovarium. Hippo signaling jga terlibat

dalam komunikasi antar folikel, dimana folikel yang ukurannya lebih besa akan

menekan Hippo signaling di folikel tetangga yang berukuran lebih kecil untuk

menekan pertumbuhannya. Oleh karena itu, pada ovulasi masing – masing folikel,

rupturnya folikel dapat juga mengganggu Hippo signaling diinduksi oleh

perubahan polimerisasi aktin pada permukaan epitelium. Gangguan Hippo

signaling setiap bulannya dan akibat dari over proliferasi pada permukaan epitel

dapat meningkatkan kecenderungan epitel ovarium untuk berkembang menjadi

kanker.15-16

Jalur Hippo signaling diregulasi oleh pengaruh fisik dan mekanik dalam

lingkungan sel. Pengaruh mekanik yang berasal dari matris ekstraseuler, adhesi

sel, bentuk sel, dan susunan sitoskeleton aktomiosin akan berpengaruh pada nasib

sel tersebut nantinya. Jalur Hippo signaling terdiri dari beberapa regulator

pertumbuhan negatif yang bekerja pada kaskade kinase yang bekerja dengan

proses fosforilasi dan inaktivasi kunci efektor Hippo signaling, yaitu Yes-

associated protein (YAP)/transcriptional coactivator with PDZ – binding motif

(TAZ). Ketika Hippo signaling terganggu penurunan fosforilasi YAP akan

meningkatkan level YAP di inti sel. YAP bekerja dengan faktor transkripsi untuk

meningkatkan kinerja faktor pertumbuhan CCN dan baculoviral inhibitor of

apoptosis repeat containing (BIRC) apoptosis inhibitor. CCN bekerja

menstimulasi pertumbuhan, ketahanan, dan proliferasi sel.15-16

 Pada sel yang memiliki matriks ekstraseluler yang kaku, terjadi

peningkatan aktivitas YAP, sedangkan pada sel dengan matriks yang lembut,

terjadi penurunan aktivitas YAP dan terjadi proses adipogenesis. Pada embrio

mamalia, sekumpulan F-actin terkumpul dalam lapisan tropektoderm,yang

berhubungan dengan peningkatan aktivitas YAP dan proliferasi sel. Kebanyakan

tumor memiliki struktur stroma yang keras dan sitoskeleton yang kuat, yang

meningkatkan aktivitas YAP den proliferasi sel. Pada perkembangannya, folikel

primordial yang berada korteks yang strukturnya lebih kaku akan berjalan ke

lapisan medular yang strukturnya lebih lembut dan longgar, sehingga aktivitas

YAP di lapisan ini akan berkurang, diikuti dengan penurunan proses proliferasi.16

Gambar 2.3. Sel berdasarkan kekakuan matriks ekstraseluler yang

mempengaruhi aktivitas YAP/TAZ dalam menentukan nasib sebuah sel.16

 Oosit yang berada dalam folikel primordial yang dorman secara aktif

dimetabolisme dan mengalami transkrip gen pada pertumbuhan oosit. Oleh karena

itu, oosit primordial pada folikel ini sudah disiapkan dengan transkrip gen untuk

pertumbuhan yang lebih jauh lagi. Studi terbaru memberi cara pandang baru untuk

melihat mekanisme signaling intrasel yang penting untuk aktivasi folikel

primordial dari fase dorman.15

Gambar 2.4. Jalur PTEN-PI3K-AKT dalam oosit dalam proses aktivasi

folikel primordial.15

Penelitian pada mencit dan tikus menunjukkan bahwa stimulasi pada

aktivitas AKT dan penekanan faktor transkripsi FOXO3. Setelah ligand Kit

mengaktifasi ligand RTK yang serumpun, fosforilasi dari daerah RTK intraseluler

menstimlasi aktivitas PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) yang menyebabkan

terjalinya hubungan antara second messenger PIP2 (phosphatidylinositol

biphospate) menjadi PIP3 (phosphatidylinositol triphosphate), mengaktifkan PK1

(phosphatidylinositol-Dependant Kinase 1) dan diikuti oleh aktivasi AKT.

Translokasi pada AKT ke nukleus menekan aktivitas transkripsi FOXO3. Jalur ini

juga diregulasi oleh inhibitor enzim PTEN (TumorSsupressor Phosphtase) dengan

homolog tensin yang secara negatif meregulasi PI3K signaling dengan

defosforilasi dari PIP3 dan mengubahnya kembali menjadi PIP2.15

Peran penting dari jalur PI3K-PTEN-AKT;FOXO3 dalam sel aktivasi

folikel primordial telah terlihat jelas pada percobaan dengen mencit. Pada

mamalia, target dari rapamycin (mTOR) secara positif meregulasi pertumbuhan

sel dan proliferasi dengan memulai biosintesis protein, lipoid, dan organela, dan

dengan membatasi proses katabolisme seperti autofagi. Disamping itu, jalur

signaling PTEN-AKT-FOXO3, supresi pada aktivitas mTORC1 oleh komplex

gen Tsc1 dan Tsc2 juga bekerja sinergis dalam meningkatkan pertumbuhan oosit

dan aktivasi folikel. Penemuan – penemuan ini mendemonstrasikan pentingnya

peran jalur aktivasi AKT dan mTOR1 yang bekerja sinergis dalam regulasi folikel

primordial agar tetap dalam keadaan dorman dan mempertahankan panjang siklus

hidup reproduksi seorang wanita.15-16

2.2 Indikasi Fertility preservation

Terdapat beberapa indikasi dalam melakukan pengawetan atau

pemeliharaan fertilitas pada wanita, yang dapat dilihat pada gambar 2.5.)

a. Kanker pada anak-anak

Kanker pada anak-anak dan dewaasa merupakan indikasi pemeliharaan

fertilitas yang paling sering. Walaupun kanker masih merupakan penyebab

kematian terbesar kedua pada anak-anak, angka pengobatan pada anak-anak

dengan kanker meningkat secara pesat selama tiga dekade terakhir. Jenis
keganasan yang paling sering dijumpai selama masa kanak-kanak adalah

leukimia, Hodgkin’s dan non-Hodgkin’s limfoma, tumor pada sistem saraf pusat,

sarkoma, dan tumor ginjal. Akut limfoblastik leukimia (acute lymphoblastic

leukimia/ ALL) merupakan jenis keganasan anak terbanyak, dengan 2.100 kasus

baru dan 2.000 penderita yang masih bertahan setiap tahunnya.11

Angka five-year survival rate pada anak-anak dengan kanker hampir

mencapai 80%, dengan persentase yang lebih tinggi pada limfoma (94%) dan

tumor Willms (91%). Walaupun jumlah anak yang bertahan dengan kanker

semakin banyak karena telah banyak dilakukan pengembangan modalitas dalam

penatalaksaannya, akan tetapi belum termasuk dalam tatalaksana dari efek

gonadotoksik akibat kemoterapi atau radioterapi. Kriopreservasi dari jaringan

ovarium mungkin merupakan satu-satunya metode yang dapat digunakan pada

pasien perempuan usia pubertas dan belum menarke yang menerima kemoterapi,

radioterapi pelvis, HSCT (hematopoietic stem cell transplantation), atau

ooforektomi pada tumor jinak. Manfaat terbesar dari prosedur ini diharapkan

terjadi pada anak-anak karena mempunyai folikel promordial paling tinggi.

Dengan dilakukannya pembekuan pada jaringan ovarium, maka stimulasi ovarium

tidak perlu dilakukan. Dengan demikian, waktu untuk terapi kanker berkurang dan

tidak ada risiko kanker akibat stimulasi ovarium. 11

b. Penyakit autoimun

Penyakit autoimun dapat menyerang wanita di usia reproduksi, diantaranya

sistemik lupus eritematous, glomerulonefritis resisten steroid, Behcet disease,

inflammatory bowel disease (IBD) dan pemfigus vulgaris. Penelitian melaporkan

bahwa dijumpai peningkatan pemakaian obat-obat yang bersifat sitotoksik, secara

spesifik siklofosfamid, dimana penggunaannya dapat menyebabkan infertilitas

karena bersifat gonadotoksik. Oleh karena itu, kriopreservasi dari jaringan

ovarium dapat diambil untuk digunakan nantinya agar pasien dapat

mempertahankan fertilitasnya.11

c. Kanker pada perempuan dewasa

Diperkirakan hampir 8% dari kanker terjadi pada wanita usia reproduksi di

bawah 40 tahun. Kanker payudara, kanker tersering pada wanita usia reproduksi,

memiliki five-year survival rate yang cukup tinggi yaitu 90%. Kebanyakan pasien

kanker payudara juga menerima pengobatan kemoterapi dengan regimen

siklofosfamid yang bersifat gonadotoksik. Tidak seperti penyakit keganasan

lainnya, kanker payudara memiliki jarak sekitar enam minggu antara tatalaksana

pembedahan dan kemoterapi, sehingga pada periode ini dapat dilakukan bantuan

teknologi reproduksi. Namun, stimulasi ovarium diperkirakan dapat

mempengaruhi pertumbuhan kanker payudara akibat adanya pemberian estrogen

eksternal.11

Kelompok pasien yang juga memiliki indikasi unduk dilakukannya

kriopreservasi jaringan ovarium adalah pasien dengan kanker serviks staium

lanjut, karena pada pasien ini kebanyakan mendapat terapi radioterapi pelvis.

Jaringan ovarium dapat diambil ketika melakukan pembedahan kanker primer,

dan selanjutnya dilakukan kriopreservasi. Pasien dengan mutasi gen BRCA I dan

II juga diindikasikan untuk dilakukan kriopreservasi ovarium, karena pada pasien

ini disarankan untuk melakukan tindakan profilaksis ooforektomi segera setelah

persalinan selesai atau pada usia 35-40 tahun untuk menurunkan risiko kanker

ovarium dan payudara.11

 Gambar 2.5. Indikasi preservasi infertilitas pada wanita11

d. Pasien yang mendapat terapi radioterapi

Radiasi dengan ionisasi diketahui dapat menyebabkan kerusakan ovarium

dan infertilitas yang permanen. Kerusakan gonad yang terjadi tidak hanya karena

paparan radiasi secara langsung, baik itu pada daerah pelvis maupun bagian

bawah abdomen, namun hamburan dari radiasi juga dapat menyebabkan

kerusakan walaupun gonad berada diluar daerah target terapi radiasi. Oosit

manusia sangat sensitif terhadap radiasi, oleh karena itu radiasi dapat mengurangi
jumlah folikel primodial sesuai dengan dosis yang diberikan. Dengan pemberian

radiasi pada ovarium sebesar >6 Gy biasanya akan membuat kegagalan ovarium

yang ireversibel, dan dosis sebesar <4 Gy sudah cukup untuk merusak setengah

dari jumlah oosit.11

2.3. Fertility Cryopreservation Options for Female3,17-18

Teknik reproduksi bantuan dengan kriopreservasi pada perempuan usia

remaja dan dewasa dapat dilakukan dengan beberapa metode yang secara grafis

pada gambar 2.6.

Gambar 2.6. Beberapa bagian dari ovarium manusia yang dapat dilakukan
metode kriopreservasi3

a. Kriopreservasi dari oosit3,17-18

Metode kriopreservasi oosit mengijinkan wanita untuk mempertahankan hak

reproduksinya dan direkomendasikan bagi wanita yang tidak menikah, wanita

tanpa pasangan laki-laki, wanita yang tidak ingin mengawetkan embrio karena

alasan etis dan agama. Angka kelangsungan hidup oosit setelah dicairkan,

fertilisasi in vitro dan angka kehamilan dari kriopreservasi oosit mengalami

peningkatan yang signifikan dalam beberapa tahun terakhir. Kriopreservasi oosit

juga menjadi pilihan bagi wanita dengan kasus khusus, sebagai contoh pada tahun

2010, seorang remaja berusia 14 tahun dengan sindrom Turner mosaik dan

kegagalan ovarium prematur tertarik untuk menjalani pembekuan oosit

dibandingkan dengan pembekuan jaringan ovarium, yang biasanya menjadi

metode pilihan bagi anak-anak. Namun demikian, kriopreservasi oosit tidak

memungkinkan untuk dilakukan pada anak-anak yang belum mengalami pubertas.

Oleh karena itu, dibutuhkan tindakan induksi ovulasi sebelum melakukan

kriopreservasi pada anak-anak yang belum pubertas, dimana akan menyebabkan

penundaan penatalaksanaan kanker.

Gambar 2.7. Pilihan teknik kriopreservasi untuk fertilitas pada wanita3

b. Kriopreservasi jaringan ovarium3,17-18

Pembekuan dari jaringan ovarium dan re-implantasi merupakan teknik pilihan

untuk memelihara fertilitas pada pasien dengan penyakit keganasan yang

menjalani kemoterapi dan atau radioterapi yang tidak mempunyai cukup waktu

untuk melakukan induksi ovulasi dan kriopreservasi embrio atau oosit. Metode
kriopreservasi jaringan ovarium ini merupakan satu-satunya pilihan pada anak

perempuan yang belum memasuki pubertas dan pada wanita dengan kanker yang

sensitif dengan hormon.

Oosit yang imatur akan dimatangkan baik secara in vivo ataupun in vitro,

dengan tujuan agar mengembalikan fungsi reproduksi dan mempertahankan

kesuburan. Jacques Donnez pada tahun 2004 melaporkan bahwa untuk pertama

kalinya seorang anak lahir dari teknik kriopreservasi dan transplantasi jaringan

ovarium oleh seorang wanita dengan riwayat kemoterapi dan radiasi untuk

limfoma Hodgkin. Namun demikian, Practice Commitee of ASRM tetap

mempertimbangkan kriopreservasi jaringan ovarium menjadi teknik

eksperimental untuk mempertahankan fertilitas.

Gambar 2.8. Kriopreservasi jaringan ovarium

2.4. Metode teknik kriopreservasi jaringan ovarium9,19-20

a. Pengumpulan jaringan ovarium

Jaringan ovarium pada wanita yang akan dilakukan kriopreservasi diambil

secara biopsi. Hasil biopsi akan difiksasi dengan larutan Bouin dan sisa jaringan

ovarium dipotong menjadi beberapa potongan untuk dilakukan kriopreservasi.

b. Pembekuan dan pencairan jaringan ovarium

Proses pembekuan dari potongan jaringan ovarium dilakukan dengan

beberapa tahapan. Pertama, jaringan disuspensikan dalam 800 µl minimal

essential medium (MEM) dan Glutamax di wadah cryovial. Kemudian media ini

diganti dengan larutan krioprotektif yang mengandung 10% DMSO (dimethyl

sulfooxide) dan 2% serum albumin manusia dengan jumlah yang sama. Botol

kriovial lalu dibekukan menggunakan freezer yang dapat diprogram dengan

urutan program secara berikut: (i) pendinginan dari suhu 0ºC sampai -8ºC dengan

kecepatan penurunan suhu sebesar -2ºC/menit; (ii) cryovial ditempatkan secara

manual ke dalam larutan nitrogen dengan menggunakan forsep yang telah

didinginkan; (iii) pendinginan dilanjutkan sampai -40ºC dengan kecepatan

penurunan suhu -0,3ºC/menit, lalu cryovial disimpan ke dalam larutan nitrogen (-

196ºC). 9,19-20

Langkah berikutnya adalah proses pencairan dan pembersihan dari larutan

krioprotektif, dimana cryovial dipaparkan dalam suhu ruangan selama 2 menit dan

direndam dalam air yang bersuhu 38ºC sampai es benar-benar meleleh. Untuk

menghilangkan larutan krioprotektif, jaringan ovarium dipindahkan dari kriovial

ke dalam cawan Petri yang mengandung MEM-Glutamax, kemudian dilakukan

pencucian sebanyak 3 kali dengan durasi 5 menit sekali cuci sebelum jaringan
diisolasi atau dikultur secara in vitro. Setelah jaringan bebas dari larutan

krioprotektif, dilakukan pemotongan satu fragmen dari jaringan dan difiksaasi

dengan larutan Bouin untuk kontrol setelah kriopreservasi. 9,19-20

c. Isolasi dari folikel ovarium

Bagian korteks dari ovarium akan ditempatkan pada alat pemotong jaringan

dan ukurannya disesuaikan menjadi 0,5mm. Jaringan ovarium yang telah dipotong

kemudian dipindahkan ke dalam tabung berbentuk kerucut ukuran 50ml yang

mengandung 10 ml Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) dan 1 mg/ml

kolagen tipe IA, kemudian diinkubasi dalam bak air dengan suhu 37ºC selama 60

menit. Kemudian, setiap 15 menit, jaringan ovarium diguncang-guncang dengan

pipet agar menghancurkan jaringan yang dicerna. Proses pencernaan akan selesai

dengan komplit jika dilakukan penambahan DPBS dengan jumlah volume yang

sama pada suhu 4ºC serta penambahan 10% dari fetal bovine serum (FBS).

Setelah itu, suspensi yang dihasilkan disentrifugasi pada 50g selama 10 menit

dengan suhu 4ºC. Supernatan lalu dibuang dan jaringan dipindahkan ke dalam

cawan petri dan setelah itu pemeriksaan stereomikroskop untuk mengidentifikasi

folikel. 9,19-20

Langkah berikutnya adalah mengambil folikel dengan menggunakan ujung

stripper yang berdiameter 135mm, kemudian dilakukan pencucian dengan DPBS

plus 10% FBS pada suhu 4ºC sebanyak tiga kali. Pencucian ini bertujuan untuk

mencegah masukknya sel-sel stroma ke dalam alginat matriks. Diameter dari

folikel ditentukan dari membran basal dengan menggunakan skala mikrometer

okular. Kemudian 2 sampai 5 folikel dari setiap pasien akan dilakukan proses

pengujian apakah folikel masih hidup atau telah mati, dengan tujuan untuk
mengevaluasi viabilitas folikular setelah dilakukan isolasi. Setelah itu, folikel

yang tersisa akan ditanamkan dalam alginat matriks. 9,19-20

d. Kultur folikel yang diisolasi secara in vitro

Prosedur kultur in vitro dilakukan dengan cara inkubasi folikel dilakukan dalam

four-well multidish yang dicocokkan dengan Millicell-CM inserts (diameter

12mm). Sebelumnya Millicell-CM dilapisi dengan maktriks ekstraseluler yang

mengurangi faktor pertumbuhan sebanyak 100 µl (setelah sebelumnya diencerkan

dengan MEM-Glutamax sebesar 1:3). Media kultur terdiri dari MEM-Glutamax

ditambah dengan 10% FBS, 0,47 mM asam piruvat dan 50 µg/ml streptomisin

sulfat. 9,19-20

2.5. In vitro activation in follicle antral

Kesempatan untuk dapat hamil pada pasien – pasien dengan POF

(premature ovarian failure) sangat kecil karena folikel – folikel ovarium

kelelahan dan gagal berovulasi. POF adalah suatu penyakit dimana folikel di

dalam ovarium berkurang atau hampir tidak ada sama sekali. POF dapat

disebabkan oleh penyakit – penyakit autoimun, kelainan genetik, seperti gangguan

kromosom C, autosom, atau penyakit gen lainnya. Faktor – faktor iatrogenik

termasuk pembedahan pada ovarium, radiasi, dan kemoterapi juga merupakan

penyebab tersering. Sebelumnya, pada pasien – pasien dengan riwayat kanker,

yang mendapat intervensi radioterapi dan kemoterapi, prosedur kriopreservasi

jaringan ovarium, oosit yang matur, dan embrio adalah pilihan yang potensial.21,22

Obat – obat kemoterapi, khususya agen alkylating menyebabkan

kerusakan DNA dengan menginduksi terjadinya penghancuran dan cross-linked

pada rantai DNA tunggal. Hal yang sama terjadi padapasien – pasien dengan

terapi sinar. Pada pemeriksaan histologi ditemukan bahwa jaringan ovarium

pasien – pasien yang mendapat kemoterapi terbukti mengalami penurunan jumlah

folikel bahkan kehilangan seluruh folikelnya yang diakibatkan oleh terjadinya

fibrosis pada stroma serta kerusakan pembuluh darah.22

Penatalaksanaan paling efektif pada pasien – pasien inferti akibat keadaaan

– keadaan tersebut adalah dengan melakukan fertilisasi in vitro (IVF) dan transfer

embrio (IVF-ET) dengan menggunakan sel telur donor. Namun baru – baru ini

telah ditemukan bahwa pada pasien – pasien dngan kegagalan ovarium, masih

terdapat folikel – folikel resiudal meskipun sedikit, hanya saja folikel – folikel ini

sulit berkembang. Peneliti akhir – akhir ini sedang mengembangkan sebuah teknik

penatalaksanaan infertilitas yang terbaru yang disebut in-vitro activation (IVA),

yang memberi kesempatan pasien- pasien tersebut menggunakan sel telur mereka

sendir dengan cara mengaktivasi folikel residual yang dalam keadaan dorman.21,22

Folikel primordial berada dalam keadaan dorman di dalam ovarium.

Sejumlah faktor intraovarian seperti kit-ligand,vascular endothelial growth factor,

bone morphogenetic protein 4, BMP7, leukemia inhibitory factor, basic fibroblast

growth factor, dan keratinocyte growth factor merupakan faktor penting dalam

aktivasi folikelmulai dari fase dorman. Di antara begitu banyak jalur signaling

yang ada dalam intrasel, mekanisme yang sangat besar perannya adalah

mekanisme PIK3-Akt-FOXO3 seperti yang telah dijelaskan pada subbab

sebelumnya. Pemahaman dasar tentang mekanisme perkembangan folikel dalam

ovarium inilah yang menjadi dasar kerja aktivasi in vitro pada folikel primordial.

Pada beberapa studi menyebutkan bahwa aktivator dengan PI3K dan dengan
aktivasi stimulan AKT dikombinasikan dengan fragmentasi ovarium yang

merupakan salah satu cara menerapkan mekanisme mengganngu jalur Hippo

signaling sel.23

Korteks ovarium yang menyimpan banyak folikel residual didiseksi

dengan membuang bagian medularis. Untuk kriopreservasi jaringan ovarium,

dibutuhkn metode fitrifikasi. Untuk mengidentifikasi folikel dalam korteks, 10-

20% volume korteks didiseksi sebelum dilakukan kriopreservasi. Secara

histologis, harus dilakukan penilaian jumlah folikel dalam korteks, karena terbukti

bahwa aktivasi invitropada folikel yang tidak memiliki folikel sama sekali tidak

memberikan hasil yang baik selama 1 tahun. Meskipun kriopreservasi bukan hal

utama dalam IVA, namun banyak keuntungan yang ditawarkan oleh tahap ini.

Jika satu ovarium dikriopreservasi pada tahap awal POF, pasien dapat menjalani

terapi noninvasiv terlebih dahulu sebelum diputuskan untuk dilakukan operasi

tahap dua. krioreservasi juga memberikan waktu yang cukup untuk menganalisis

folikel residual secara lengkap sebelum duputuskan untuk menjalani

autotranspantasi.21,24

Potongan tipis jaringan ovarium yang telah dibekukan kemudian

dilelehkan dan difragmentasi menjadi potongan –potongan kubus kecil berukuran

1 – 2 mm. Kubus – kubus ini akan dikultur secara in vitro dengan pengobatan

aktivator PI3K atau agen stimulan Akt selama dua hari. Setelah dikultur, jaringan

ovarium tersebut dicuci dan kemudian di transplantasi ke bawah lapisan serosa

dari tuba Fallopii yang sudah diidentifikasi dengan operasi laparoskopi. Daerah di

bawah lapisan serosa tuba Fallopii akan membengkak karena telah diinjeksi

dengan larutan salin, kemudian diikuti dengan pemotongan lapisan serosa dan
membuat kantong di atntara serosa dan tuba Fallopii sebagai tempat ntuk

memasukkan kubus –kubus ovarium. Hampir 20 – 80 kubus ovarium dapat

dimasukkan , setelah itu diikuti dengan penutupan serosa dengan penjahitan atau

ditutup dengan oxidized regeneration cellulose untuk mencegah hilangnya kubus

– kubus ovarium pada daerah insisi. Daerah transplantasi ini dipilih karena

merupakan daerah yang kaya vaskularisasi, dapat dilihat dengan USG

transvaginal, dan memudahkan proses IVF-ET pada oosit nantinya.23-24,26-27

Setelah proses autotransplantasi tersebut, pertumbuhan folikel akan

dimonitoring setiap minggu atau dau minggu dengan menghitung level serum

esterogen dan gonadotropin yang didukung dengan deteksi folikel antral dengan

menggunakan USG transvaginal.Supresi gonadotropin endogen dipertimbangkan

untuk menginduksi pertumbuhan foikel dengan agar ditanggungjawabi

sepenuhnya oleh gonadotropin endogen dengan menghambat lutenisiasi selama

pertumbuhan folikel berlangsung. Kemudian pasien diberikan esterogen

bersamaan dengan GnRH agonis untuk menekan stimulasi gonadotropin agar

tidak mendahului kerja gonadotropin eksogen. Pertumbuhan folikel juga

distimulasi dengan menginjeksi rekombinan FSH setiap hari. Setelah folikel

matur, pematangan oosit akn dipicu oleh hCG. Kemudian setelah 36 jam, oosit

akan terlihat dengan USG transvaginal dan siap untuk dilakukan IVF.28-30

Penelitian Kanawamura 2015 telah membuktikan beberapa outcome yang

lebih memuaskan pad pasien – pasieng yang ditatalaksana dengan IVA. Penelitian

tersebut menunjukkan presentasi fertilitas pada pasien kanker dan pasien dengan

POF mendapat angka keberhasilan yang jauh lebih memuaskan dengan metode

IVA dibandingkan hanya dengan proses OTCP (old ovarian tissue

cryopreservation and transplantation procedure). Untuk pasien – pasien dengan

POI (primary ovarian insufficiency) yang mendapat prosedur IVA, tidak tampak

pertumbuhan abnormal pada folikel (11 pasien yang mendapat IVA tidak

mengalamiabnormalitas pada tuba falopii nya, 2 bayi lahir dengan skor APGAR,

berat badan, dan panjang badan yang baik, dan tidak ditemukan abnormalitas fisik

maupun mental. Hal demikian juga terjadi pada pasien –pasien yang survive dari

kanker. Prosedur IVA pada pasein kanker yang survive, ovary removal dan

kriopreservasi direkomendaskan sebelum mendapat terapi yang bersifat

gonadotoksik. Karena prosedur IVA dapat menghasilkan oosit multipel untuk

kriopreservasi, maka kesempatan untuk mendapat kehamilan multipel juga dapat

dimiliki oleh pasien.24,31-33

Angka keberhasilan prosedur IVA terkait usia belum diteliti secara jelas.

Namun telah diketahui bahwa jumlah folikel, khususnya pada pasien –pasien POF

akan menurun seiring berjalannya usia.11 Proses kriopreservasi yang baik sangat

berpengaruh pad posedur IVA. Kriopreservasi pada pasien kanker dengan usia

lebih muda memilikiangka keberhasilan lebih baik dibandingkan pasien dengan

usia tua. Demikian pula pada pasien yang sedang diterapi, pasien – pasien yang

telah mendapat kemoterapi mengalami kegagalan dalam kriopreservasi,

khususnya mereka yang mendapat terapi agen ankylating seperti

cyclophosphamide.34

Penelitian prosedur IVA sebagai suatu penatalaksanaan masih sangat

terbatas. Namun penelitian Kanawamura sudah diterima sebagai terobosan

terbaru dalam dunia medis. Identifikasi kelayakan pasien serta pengamatan

terhadap kualitas dan kuantitas folikel ovarium yang dapat diteliti dengan
pengambilan folikel adalah langkah awal penting yeng mempengaruhi angka

keberhasilan IVA untuk mendapat kesempatan hamil pada pasien – pasien kanker,

POI, dan POF.24,35

 DAFTAR PUSTAKA

1. American Cancer Society, 2013. Global Burden of Cancer in Women:

current status, trends, and interventions. American Cancer Society, p9
2. Sonmezer M, Ozkavukcu S, 2009. Fertility preservation in females with
malignant disease-1: causes, clinical needs and indications. Turk J Hematol
26, p107
3. Javed M, Michael E, 2015. Fertility Preservation Option for Cancer
Patients. Advances in Reproductive Sciences 3, p67-71
4. Kondapalli L.A, 2012. Chapter 5: Ovarian Tissue Cryopreservation and
Transplantation. Oncofertility Medical Practice: Clinical Issues and
Implementation, p63
5. Schorge J.O, Scaffer J.I, et al, 2008. Williams Gynecology, chapter 20:
Evaluation of the Infertile Couple. Mc-Graw-Hill Companies.
6. Donnez J, Dolmans M, 2013. Fertility preservation in women. Nature
Reviews- Endocrinology, p1
7. Himpunan Endokrinologi Reproduksi dan Fertilitas Indonesia (HIFERI),
2013. Konsensus Penanganan Infertilitas. POGI, p5
8. The American College of Obstetricians and Gynecologists, 2015. FAQ 137
Gynecologyc Problems: Treating Infertility
9. Amorim C.A, Langendonckt, David A, Dolmans M.M, Donnez J, 2009.
Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian
tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix.
Human Reproduction, Vol 24(1), p92
10. Oxford University Hospitals, 2016. Preserving female fertility before
chemotherapy/radiotherapy treatment; Ovarian Tissue Cryopreservation:
Patient. NHS Foundation Trust, p3
11. Sonmezer M, Ozkavukcu S, 2009. Fertility preservation in females with
malignant disease-1: causes, clinical needs and indications. Turk J Hematol
26,
12. Findlay JK,et al. 2009. Ovarian physiology: follicle development, oocyte,
dan hormone relationships. Anim Reprod.6(1)p.16-19.
13. Guyton AC, Hall JE. 2007. Textbookof Medical Physiology. Female
Physiology Before Pregnancy dan Hormone in Female.p.1065-1067.
Elseviere: Singapore.
14. Zeleznik AJ. 2004. Review The physiology offollicle selection.
Reproductive Biology and Endocrinology.p.1-7.
15. Hsueh, AJ, Kawamura K, Cheng Y, dan Fauser BC. 2014. Intraovarian
Control of Early Follicuologenesis. Endocrine Reviews. doi:
10.1210/er.2014-1020.
16. Piccolo S, Dupount S, Cordenonsi S. 2014. The Physiology of YAP/ TAZ:
Hippo Signaling Pathway and Beyond. Physiol Rev 94: 1287–1312.
17. Rodriguez K, Wallberg, 2012. Recent advances in oocyte and ovarian tissue
cryopreservation and transplantation.
18. The Practice Commitee of the American Society for Reproductive
Medicine, 2014. Ovarian tissue cyropreservation: a committee opinion.
ASRM PAGES Vol 101(5), p1237
19. Luyckx V, Scalercio S, et al, 2013. Evaluation of cryopreserved ovarian
tissue from prepubertal patients after long-term xenografting and exogenous
stimulation. Fertility and Sterility Vol 100 No.5, p1350-1351
20. Paulini F, Vivela J, et al, 2016. Survival and growth of human preantral
follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicle isolation and short-
term xenografting. Reproductive Biomedicine Online 33, p426
21. Kawamura K, Kawamura N, Hsuej AJ. 2016. Activation of dormant
follicles: a new treatment for premature ovarian failure? Curr Opin Obstet
Gynecol; 28(3): 217–222.
22. Kawamura,et al. 2013. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of
ovarian follicles for infertility treatment. PNAS;110(43)p.17475-17479
23. Kawamura,et al. 2015. Ovary transplantation:to activate or not to activate.
Human Reproduction;30(11) pp. 2457–2460
24. Donnez J, Dolmans M. 2015. Ovarian Tissue Freezing: Current Status.
Current Opinion;27(3)p.1-7
25. Soares, et al. Evaluation of a human ovarian follicle isolation technique to
obtain disease-free follicle suspensions before safely grafting to cancer
patients. Fertility and Sterility®;104(3)p.672-680.
26. Vanacker, et al. 2013. Should we isolate human preantral follicles before or
after cryopreservation of ovarian tissue? Fertility and
Sterility®;99(5).p.1363-1368.
27. Donnez J, Dolmans M-M. Fertility preservation in women. Nat Rev
Endocrinol. 9: 735–49.
28. Donnez J. 2013. Introduction: Fertility preservation, from cancer to benign
disease to social reasons: the challenge of the present decade. Fertility and
Sterility;99(6).p.1467-1468.
29. Ting AY, et al.2013. Morphological and functional preservation of preantral
follicles after vitrivication of macaque ovary in a closed system.
Reproduction Update;28(5)p.1267-1279
30. Amorim CA, Langendone AV, David A, Dolmans MM, Donnes J. 2009.
Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian
tisuue, follicular isolation, and in vitro culture in a calcium alginate matrix.
Human Reproduction;24(1)p.92–99.
31. Luyckx V, et al. 2013.Evaluation of cryopreserved ovarian tissue from
prepubertal patients after long-term xenografting and exogenous
stimulation. Fertility and Sterility;100, (5)P.1350-1357.
32. Baerwald AR, Adams G, Pierson R. 2012. Ovarian antral folliculogenesis
during the human menstrual cycle. Human Reproduction Update;18(1)p.73-
91.
33. Asarbaijani,et al. RESEARCH ARTICLE Effect of Previous Chemotherapy
on the Quality of Cryopreserved Human Ovarian Tissue In Vitro. Plos
one.p.1-13.
34. Knight, et al. 2014. Review AN Approach of Fertility Preservation in
Prepubertal and Postpubertal Females; A Critical Review of Current
Literature. Pediatr Blood Cancer.p.1-5.