EXPRESIÓN HETEROLOGA

Tulianis Cepeda Marrugo

Alérgeno: Api m 1

Organismo de origen: Apis

mellifera

Organismo donde se
expresará: Escherichia
Coli B
PASO 1: OBTENCIÓN
DE LA SECUENCIA
DE NUCLEÓTIDOS.
- Se ingresa a
la base de Se coloca el
datos Allergen nombre del
Nomenclature alérgeno

Damos clic en
la opción del
alérgeno que
buscamos
Aparecerá este cuadro
en donde le daremos
clic a la opción
GenBank Nucleotide
La opción elegida en
el punto anterior nos
redireccionará a esto,
donde le daremos
clic a la opción
FASTA
Y así
obtenemos la
secuencia de
nucleótidos
PASO 2: OBTENCIÓN
DEL MARCO DE
LECTURA
Ingresamos a la base
de datos
TRANSLATE TOOL
y pegamos nuestra
cadena de
nucleótidos obtenida
en el paso anterior y
damos clic en la
opción
TRANSLATE!
Luego aparecerán
estas secuencias de
aminoácidos de donde
vamos a sacar nuestro
marco de lectura.
Yo escogí la opción 1

Lo siguiente que se
debe hacer es quedarnos
solamente con el marco
de lectura
(letras sombreadas en
rojo), para esto
debemos eliminar los
aminoácidos restantes.
Para eliminar los
aminoácidos, primeramente
se debe encontrar el codón
de inicio (ATG, que codifica
para metionina).

Se eliminan todos los codones que está antes de este.

Y nuestro marco de lectura quedará así

Luego hay que encontrar el
codón de parada (TTA,
TAG o TGA). En mi caso
fue TGA.

Se eliminan todos los codones que está después

de este.
Y nuestro marco de lectura quedará así:
Para corroborar si el marco de
lectura obtenido corresponde al de
el alérgeno Api m 1, ingresamos a Ingresamos a la opción
la base de datos BLAST Protein blast.
Colocamos el
marco de
lectura y
efectivamente
pertenece a Api
m1
 PASO 3:
AROMONIZACIÓN
Para esto debemos ingresar a la base de
datos KAZUZA, donde buscaremos las
tablas de codones del organismo de origen
(Apis mellifera) y de el organismo donde se
expresará la proteína (Escherichia Coli B)
 Ahora debemos analizar cada codón de la
secuencia de nucleótidos del alérgeno y mirar en
la tabla la frecuencia de dichos codones en el
organismo de origen, comparando con la
frecuencia de los mismos en el organismo donde
se expresará la proteína.
SECUENCIA SIN ARMONIZAR
ATG TGC CCG GAC GTT ATG TCA GCT GGT GAA
TCG AAG CAC GGC CTG ACC AAC ACG GCC TCC
CAC ACC AGG TTG TCG TGC GAC TGC GAC GAC
AAG TTC TAT GAT TGT CTT AAA AAT TCG GCG
GAC ACG ATT AGC TCG TAT TTC GTA GGG AAG
ATG TAC TTC AAT CTG ATA GAC ACG AAG TGT
TAC AAA CTG GAG CAT CCT GTC ACC GGG TGC
GGT GAG AGA ACC GAG GGT CGT TGT CTT CAC
TAC ACC GTG GAC AAA AGC AAA CCG AAA GTG
TAC CAA TGG TTC GAT CTT CGC AAG TAT
La idea es cambiar los codones que
tengan frecuencias muy alejadas por
otro tenga una frecuencia lo mas
cercana posible, siempre teniendo en
cuenta que dichos codones codifiquen
para el mismo aminoácido
SECUENCIA ARMONIZADA
ATG TGC CCA GAC GTT ATG TCG GCT GGG GAA
TCG AAA CAT GGG CTC ACG AAT ACG GCT TCG
CAT ACG AGA TTG TCG TGC GAC TGC GAC GAC
AAA TTC TAT GAT TGC CTC AAA AAT TCG GCT GAC
ACG ATC AGC TCG TAT TTC GTC GGA AAA ATG TAT
TTC AAT CTC ATA GAC ACG AAA TGC TAT AAA CTC
GAG CAT CCA GTC ACG GGA TGC GGG GAG AGA
ACG GAG GGG CGT TGC CTC CAT TAT ACG GTG
GAC AAA AGC AAA CCA AAA GTG TAT CAG TGG
TTC GAT CTT CGG AAA TAT
 PASO 4:
COMPROBACIÓN
DE LA
ARMONIZACIÓN
En este paso debemos comprobar si las
secuencias (armonizada y no
armonizada) codifican para la misma
proteína. Para esto primero debemos
traducir las secuencias a aminoácidos
con la base de datos TRANSALTE
TOOL.

PROTEINA SIN ARMONIZAR

MCPDVMSAGESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTKCYKLEHPV
TGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKY

PROTEINA ARMONIZADA
MCPDVMSAGESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTKCYKLEHPV
TGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKY
Luego ingresamos a la base de datos CLUSTAL OMEGA, la cual va a mostrarnos si
ambas secuencias codifican para la misma proteína.
Colocaremos las secuencias (traducidas a aminoácidos) de la siguiente forma:

Efectivamente nos
damos cuenta que
si codifican para
la misma proteína
 PASO 5:
ESTABLECIMIENTO DE
LAS PROPIEDADES
FISICOQUÍMICAS
TEÓRICAS DE LA
PROTEÍNA
Para esto utilizaremos la base de datos La base de datos dos dará propiedades
PROTPARAM, en donde colocaremos la fisicoquímicas como el peso molecular
secuencia de aminoácidos de la proteína. y el punto isoeléctrico (PI)
 PASO 6:
DETERMINACIÓN DE
LA REGIÓN DEL GEL
DE SDS-PAGE DONDE
SE ENCONTRARÁ LA
PROTEÍNA
El peso molecular de mi
proteína es de: 11394.94
Da= 11,39 kDa

Teniendo el cuenta el
marcador de peso
molecular mi proteína se
encontraría mas o menos
aquí
 PASO 7:
PROTOCOLO DE
PURIFICACIÓN DE LA
PROTREINA POR
INTERCAMBIO
IÓNICO
Para tener en cuenta:
- Se debe usar un pH que difiera en una unidad
del pI de la proteína. La proteína debe tener
una carga neta suficiente para unirse a la Entonces…
matriz, pero no tanta para que se requieran Punto Isoeléctrico: 7,57
condiciones muy extremas para ser eluída. Tipo de columna: Carboximetil-celulosa
- Una proteína, a pH menor de su pI (punto /Catiónica
pH: 6,57
isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH Buffer: Tampón fosfato monosódico/disódico
mayor de su pI presentará carga negativa. que se puede usar en rangos de pH de 5,8- 8
- Proteínas con carga negativa se separan con
columnas aniónicas (cargadas positivamente),
proteínas con carga positiva se separan con
columnas catiónicas (cargadas
negativamente).

1. Equilibrio
El primer paso es el equilibrio
de la fase estacionaria con las
condiciones iniciales deseadas.
Esto es haciendo pasar por la
columna nuestro buffer.
2. Aplicación
El paso siguiente es sembrar la
muestra a la cual queremos
filtrar a través de la columna.
Para ello es necesario aplicar el
mismo buffer inicial para que
todas las proteínas cargadas se
unan al intercambiador.
3. Elusión
Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas
debido a cambios en la composición del buffer. Estos
cambios se logran aumentando progresivamente la
concentración de un contra ión, de modo de desplazar el
equilibrio de unión de la proteína hacia la forma libre, para
ello se usa NaCl, sirviendo el sodio de contracatión. Los
contracationes en el búfer de elución interactúan con la
fase estacionaria cargada, desplazando a la proteína unida.
4. Lavado
Por último, se remueven las partículas que aún están
asociadas al intercambiador. Los iones que se adhieren a
los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo y
pueden ser removidos total o parcialmente durante el
proceso de regeneración. Una vez agotadas las resinas, se
pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la
operación de intercambio. Así, el intercambio iónico es un
proceso cíclico y no continuo. La regeneración de las
resinas se hace según
reacciones inversas.