      Ó  

            Ó    
   

                                    
 
  
 (Krause)Kallunki)

SALAMANCA, C. Efrain1, TICONA, H. Juan Carlos1, RUIZ, P. Grace 1,

CHUQUI Rogelio, UDAETA Enrique y GIMENEZ, T. Alberto 1
1
Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas,
Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224, La Paz-Bolivia.
RESUMEN
En el presente trabajo, se evaluaron extractos orgánicos de corteza y hojas de Angostura
longiflora (Evanta), especie medicinal amazónica, frente a diversos parásitos de Leismania.
Un total de 59 extractos frente al complejo Leishmania amazonensis (PH8 y 690), 61
extractos para el complejo Leishmania braziliensis (M2903 y 2252), 58 extractos para el
complejo Leishmania chagasi (642) y 61 extractos para el complejo Leishmania donovani
(pp75). Todos reportaron actividad Leishmanicida (promastigotes) con valores de la
Concentración Inhibitoria Media (IC50) que varía entre 76.5µg/ml hasta 125µ g/ml, el análisis
de varianza en base a la IC50 sobre Leishmania de la misma especie (pero diferente cepa) no
evidenció diferencia significativa. Sin embargo sobre especies diferentes (misma patología) se
evidencia diferencia significativa, siendo el extracto de corteza mas efectivo contra el
complejo L. donovani (IC50 -90.4µ g/ml). De la misma manera, se evaluaron 18 extractos de
las hojas reflejando valores de IC50 que varian entre 52.7µg/ml y 77.9µ g/ml. En el análisis
entre corteza y hoja en base los valores calculados de IC50 se observa que los resultados
difieren entre si significativamente, así los extractos de hoja presentan mayor actividad
biológica que los extractos de corteza frente a los promastigotes de Leishmania. Tomando en
cuenta los análisis estadísticos desarrollados consideramos que los estudios clínicos Fase I y II
en base a Angostura longiflora (Evanta) deberían utilizar un producto a base de extractos de
corteza y hoja. Además se aportan datos de actividad biológica sobre epimastigotes de
Trypanosoma cruzi con valores de IC50 49,7µ g/ml (corteza) y 32µ g/ml (hojas).
Palabras clave: Leishmaniasis – Tripanosomiasis – Especies vegetales - Antiparasitarios.

ABSTRACT
During this work several organic solvent extracts of bark and leaves of Angostura longiflora
(Evanta), medicinal plant from the Amazon, were evaluated against different Leishmania
parasites. A total of 59 bark extracts aganisnt Leishmania amazonensis complex (PH8 and
690), up to 61 extracts for the Leishmania braziliensis complex (M2903 and 2252), 58
extracts for the Leishmania chagasi complex (642) and 61 extracts for the Leishmania
donovani complex (pp75). All reported Leishmanicidal activity (promastigotes) with values of
the Medium Inhibiting Concentration (IC50) that varies between 76.5µg/ml until 125µg/ml,
the analysis of variance on the basis of the IC50 values on Leishmania of the same species
(but different strand) did not demonstrate significant difference. Nevertheless on different
species (same pathology) significant difference were observed, being the most effective the
bark extract against L. donovani complex (IC50-90.4µg/ml). In the same way 18 leaves
extract were evaluated. IC50 values vary between 52.7µg/ml and 77.9µg/ml. In the
comparative analysis between bark and leaves, on the bases of the IC50 values, the results
differ significantly, the leaves extracts display better biological activity than the bark. Taking
into account the statistical analysis, we considered that the clinical studies Phase I and II on
the basis of Angostura longiflora (Evanta) should use a product base on bark and leaves
extracts. In addition, we provide data of biological activity against epimastigotes of
Trypanosoma cruzi with values of IC50 of 49,7µg/ml (bark) and 32µg/ml (leaves)
Key words: Leishmaniasis - Tripanosomiasis - vegetal Species -Antiparasitic.

INTRODUCCION

Las Leishmaniasis son un conjunto de enfermedades muy diferentes entre si, producidas por
distintas especies de un protozoario perteneciente al género Leishmania. Estas enfermedades
de evolución crónica se caracterizan por comprometer piel, mucosas y vísceras dependiendo
de la especie de Leishmania causante y de la respuesta inmune del huésped.(1).

La Organización Mundial de la Salud considera que las Leishmaniasis se encuentran

distribuidas en Norte y Sudamérica, Europa, África y Asia siendo endémica en las regiones
tropicales y subtropicales de 88 países, se calcula una prevalencia mundial de 12 millones de
casos y se cree que la incidencia anual oscila entre 1.5-2 millones de nuevos casos para las
Leishmaniasis cutáneas (2). En Bolivia se encuentra distribuida geográficamente en el área
rural de la zonas tropicales y subtropicales de 7 de los 9 departamentos, teniendo una
población en riesgo de enfermar de 800.000 habitantes (3).

Por otro lado en América latina la enfermedad de Chagas está considerada como un grave
problema para la salud pública, estimándose que entre 16-18 millones de personas están
infectadas y cerca de 90 millones bajo riesgo de transmisión. Bolivia presenta en el momento
la más grave situación epidemiológica entre los 19 países afectados en el continente, cerca
de dos tercios de su territorio se encuentra infestado por el vector principal (Triatoma
infestans), aproximadamente 1.800.000 de bolivianos ya se encuentran infectados por el
agente causal Trypanosoma cruzi y más de 3.700.000 se hallan bajo riesgo de infección (3).
Todo esto se agrava por el marco de extrema pobreza en el que se debate la población
afectada, donde las carencias materiales se agregan a las barreras culturales para la
comprensión de la situación, con el consiguiente desconocimiento de la magnitud del
problema. A pesar de la existencia de tratamientos contra este tipo de enfermedades el
elevado porcentaje de reacciones adversas que se presentan a desalentado su uso por el
ambiente médico. A pesar de las cifras epidemiológicas de ambas enfermedades, y al ser un
problema asociado a la pobreza, ofrece poco incentivo comercial a la industria farmacéutica,
para desarrollar drogas efectivas y económicas.

Hace varios años entidades locales como el Fondo Nacional de Medio Ambiente (FONAMA)
y la Universidad Mayor de San Andrés (UMSA) de La Paz han realizado estudios botánicos,
biológicos y químicos sobre plantas medicinales utilizadas por diferentes grupos étnicos,
demostrando que Angostura longiflora Krause, usada por las comunidades indígenas como
antiparasitario es la planta más promisoria en el tratamiento contra las Leishmaniasis, por su
alta eficacia y poca toxicidad.

Es por ello que en el Instituto de Investigaciónes Farmaco Bioquimicas (I.I.F.B) se busca

promover el aprovechamiento sostenible de esta planta y sus derivados antiparasitarios a nivel
regional, por su uso tradicional. Por lo tanto el presente trabajo nos permitió obtener
información confiable sobre la calidad de la materia prima de corteza y hojas de Angostura
longiflora Krause en base a la actividad biológica (IC50) sobre promastigotes de diferentes
tipos de leishmania, que será motivo de estudios clínicos Fase I y II en el tratamiento de la
Leishmaniasis en La Paz –Bolivia dentro del programa “Terapia alternativa de enfermedades
infecciosas “ a desarrollarse con el apoyo de la Cooperación Sueca a partir del 2006-2008.

Como tambien nos permitio demostrar la actividad importante de extractos orgánicos de

corteza y hoja de Angostura longiflora (Evanta) frente a epimastigotes de Trypanosoma cruzi,

METODOLOGÍA

Las especie vegetal fue colectadas de la region de Santa Rosa de Maravilla (San

Buenaventura) provincia Iturralde. Los extractos orgánicos fueron obtenidas por métodos de

extracción ácido-base, sohxlet y reflujo a partir del material vegetal. Los extractos etanólicos

fueron preparados por percolación y concentrados en rotavapor a presión reducida.

Ensayos biológicos

Las formas promastigotes de leishmania: complejo L.amazonensis (cepa PH8, cepa 690 ),
complejo L.brasiliensis (cepa M2903, cepa 2252), complejo L.donovani (cepa pp75).
complejo L. chagasi (cepa 642) provistas por Dr. Jean-Pierre Dedet (Instituto Pasteur-
Francia), y epimastigotes de una cepa de Trypanosoma cruzi (tulahuen), fueron cultivados a
26 °C en medio Scheneider y Liver Infusión Tryptose (LIT) respectivamente suplementado al
5 % con suero bovino fetal inactivado (56 °C por 30 minutos).(4)

L. amazonensis (PH8) L. braziliensis (M2903) L. donovani (pp75)

L amazonensis (690) L. braziliensis (2252) L.chagasi (642)

Foto 1. Promastigotes en medio de cultivo-Schneider pH 6.2
(Fuente IIFB)

Los parásitos en fase de crecimiento logarítmico fueron distribuidos en microplacas de 96

pozos a una concentración de 1x106 parásitos/mL y cada pozo fue tratado con diferentes
concentraciones de 100 µg/mL. 50 µg/mL, 25 µg/mL de extractos orgánicos de corteza y hoja
de Angostura longiflora durante 72 horas, los productos que mostraron actividad, las
concentraciones se disminuyeron hasta hallar la IC50; para cada factor de tratamiento fueron
realizadas tres replicas.

La actividad se evaluó mediante conteo óptico en microscopio de fase invertida,

comparándose con pozos control positivo (Anfotericina B) y negativo (Medio Lit o Schneider
+ parásitos). En ambos formas parasitarias (epimastigotes y promastigotes) la CI50 del extracto
de hoja o corteza de Angostura longiflora fue determinada mediante análisis de regresión
lineal de un gráfico porcentaje de inhibición vs. logaritmo de la concentración del extracto
orgánico. El vehículo utilizado para la preparación de los extractos fue DMSO, la
concentración de DMSO no fue superior al 1 %y en estas condiciones la sobrevivencia de los
parásitos es del 100%. (5)

RESULTADOS Y DISCUSION

Todos los extractos orgánicos de hojas (IC50 entre 52.7µg/ml y 77.9µ g/ml) y de corteza
(IC50 entre 76.5µg/ml y 125µ g/ml) de Angostura longiflora (Evanta) presentaron actividad
Leishmanicida in vitro sobre promastigotes de diferentes cepas de Leishmania: complejo
L.amazonensis (690 y PH8), complejo L.braziliensis (M22903 y 2252), complejo L. donovani
(pp75), complejo L. chagasi (642).(Grafica 1-2)

Gráfica 1

Actividad Leishmanicida in vitro de extractos orgánicos de corteza de Angostura longiflora (Evanta) sobre
promastigotes de L.amazonensis(PH8 y 690) L.braziliensis(M2903 y 2252) L.donovani (pp75) L.chagasi(642)

Gráfica 2

Actividad leishmanicida in vitro de extractos orgánicos de hojas de Angostura longiflora (Evanta)

sobre promastigotes de L.amazonensis (PH8 y 690) L.braziliensi s(M2903 y 2252)
L.donovani (pp75)L.chagasi(642)
Del análisis de varianza una via, en base a las IC50 obtenidos por la actividad tanto de
extractos orgánicos de corteza como de hoja de Angostura longiflora (Evanta) sobre
promastigotes de Leishmania de las mismas especies pero diferente cepa como: complejo
L.amazonensis (cepa pH8 y cepa 690) y complejo L.braziliensis (cepa M2903 y cepa 2252)
se observó que no existen diferencias significativas en la actividad Leishmanicida.(P> 0.01)
(tabla 1)
Tabla 1
Análisis de varianza una via (Anova) de extractos orgánicos de corteza de Angostura longiflora
sobre promastigotes de L. amazonensis (PH8) y L. amazonensis (690)

Groups Count Sum Average Variance

PH8 59 5099.8 86.4372881 1296.37031
690 59 5807.8 98.4372881 936.790999
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 4248 1 4248 3.80447215 0.05352798 6.85849955
Within Groups 129523.356 116 1116.58065

Total 133771.356 117

Sin embargo al realizar el mismo análisis sobre complejos diferentes L.donovani (pp75) y L.
chagasi (642), pero misma patología (Leishmaniasis visceral) se puede evidenciar actividad
biológica significativamente diferente.(P < 0.01) (Tabla2)
Tabla 2
Análisis de varianza una via (Anova) de extractos orgánicos de hojas de Angostura longiflora
sobre promastigotes de L donovani ( pp75) y L. chagasi (642)
Groups Count Sum Average Variance
pp75 18 950.7 52.8166667 484.766176
642 18 1402.57 77.9205556 785.8325
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 5671.84714 1 5671.84714 8.92783417 0.00518433 7.44410045
Within Groups 21600.1775 34 635.299338

Total 27272.0246 35

Por otro lado tambien se realizó el análisis de varianza (una via) entre los promedios de las
IC50 de extractos orgánicos de corteza y hoja de Angostura longiflora (Evanta) para cada
una de las cepas de Leishmania en estudio. (Gráfica 3).
 Gráfica 3

Actividad Leishmanicida in vitro de extractos orgánicos de corteza y hojas de Angostura

longiflora (Evanta) sobre promastigotes de L.amazonensis (PH8) y L.amazonensis (690)

Groups Count Sum Average Variance

Corteza 59 5099.8 86.4372881 1296.37031
Hoja 18 1001.7 55.65 472.435588
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13073.0422 1 13073.0422 11.7816362 0.00097671 6.98537406
Within Groups 83220.883 75 1109.61177

Total 96293.9252 76

Análisis de varianza una via (Anova) entre extractos orgánicos de corteza y hoja de Angostura
longiflora sobre promastigotes de Leishmania amazonensis (PH8)

Por lo que podemos concluir que los extractos orgánicos de hojas presentan una mayor
actividad Leishmanicida que los extractos de corteza, excepto el complejo L braziliensis

(cepa 2252) que pese a presentar diferencias en sus medias (corteza76,5µ g/ml y hoja
64,7µ g/ml) y luego del análisis de varianza (una via), asumimos que la variabilidad existente
entre esta poblaciones estudiadas que supuestamente provenían del efecto de los tratamientos
son del mismo orden de magnitud que de los errores, por lo tanto, se considera que las
medias de los tratamientos son iguales y las diferencias observadas se deben a la variabilidad
biológica o a un error experimental.
Tomando en cuenta los análisis estadísticos desarrollados consideramos que los estudios
clínicos Fase I y II en base a Angostura longiflora (Evanta) deberá presentar un producto
base de extractos de corteza y hoja para la actividad leishmanicida.

Así mismo remarcamos la actividad importante de extractos orgánicos de corteza y hoja de

Angostura longiflora (Evanta) frente a epimastigotes de Trypanosoma cruzi donde los
extractos orgánicos de hoja presentan una mejor actividad tripanocida que los extractos
orgánicos de corteza de Angostura longiflora, en base a la IC 50.

Gráfica 4

Actividad tripanocida in vitro de extractos orgánicos de corteza y hoja de Angostura longiflora

(Evanta) sobre epimastigotes de Trypanosoma cruzi (Tulahuen)

Se realizó el análisis de varianza una via (Anova) entre grupos de extractos orgánicos de
corteza y hoja de Angostura longiflora sobre epimastigotes de Tripanosoma cruzi (tulahuen ).
Debido que P es menor que 0.01, se rechaza la hipotesis nula. Por lo tanto, las diferencias
entre promedios de la IC 50 son significativas (ver tabla 24).

Tabla 24. Promedios de la IC50 de extractos orgánicos de corteza y hoja de Angostura longiflora
sobre epimastigotes de Trypanosoma cruzi (tulahuen)

Trypanosoma cruzi Corteza IC50µg/ml Hoja IC50µg/ml

Cepa Tulahuen 49.7µg/ml 32µg/ml

AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo contó con el apoyo de la OEA (Proyecto Flora Regional), UMSA/ SAREC
(Proyecto Enfermedades Infecciosas), CYTED Subprograma X. Proyecto X5 (Búsqueda,
Obtención y Evaluación de Nuevos Agentes Antiparasitarios), IRD (Proyecto Bio-Leish Jeune
Equipe) y La Fundación Alexander Von Humbolt-Shtiftung, a quienes los autores expresamos
nuestros agradecimientos.

BIBLIOGRAFIA
1. ATIAS ,Antonio. (1999) Parasitologia Medica .editorial Mediterraneo Santiago Chile
p242-268.
2. World Health Organization (WHO). (1998) Rapport Sur la Santé dans le Monde, 1998;

3. CASSAB, Alfred Julio. Noireau Francois. Guillen Germán.La Enfermedad de

Chagas en Bolivia . Conocimientos científicos al inicio del programa de
control(1998-2002) La Paz- Bolivia p .17-33
4. GIMÉNEZ Alberto , Ruiz Grace , Vargas Fernando (2004) Manual de Técnicas de
Laboratorio para la Evaluación de Sustancias Tripanocidas y Leishmanicidas
Editorial Prisa Ltda La Paz-Bolivia p. 24,86 .
5. DEHARO Eric ,Loyevsky J, Balanza E,Ruiz G, Muñoz V ,Gordeuk V.(2000)
Antimothiol Multidentate Chelators against Chagas Disease.Experimental
parasitology p.198-200.
6. GUTIERREZ , Ivan . (2001), Estudio de la Evanta ( Galipea longiflora Krause ) en la
región amazónica – Andina de Bolivia. Tesis de Licenciatura. UAGRM. Santa Cruz de
la Sierra Bolivia.
7. TACANA(1999) Ecuanasha aquí, ecuanasha id´rene cuana, me schanapaque
(conozcan nuestros árboles nuestras hierbas).editores UMSA-CIPTA-IRD-
FONAMA-EIA. La Paz-Bolivia p.415-417
8. THOMSOM, Willian .(1996) Las plantas medicinales Guia Práctica ilustrada ,
Editorial Blume ,S.A .Barcelona p. 7-9.
9. RODRÍGUEZ Mirta (2000). Determinación de la activadad antibacteriana de especies
guaranies y evaluación de la toxicidad in vivo de Angostura longiflora Krause
Kallunki
 10. PAZ Norma Magali (1998). Evalauación de la Actividad Citostática/Citotóxica
Antibacteriana, Antifungica y Cultivos Invitro de Galipea longiflora Krause. Tesina
de Licenciatura. UMSA.La Paz-Bolivia
11. AVILA,Illanes.Juan Antonio (2000 )Estudio preclínico de la Evanta Galipea
Longiflora Krause Mediante Modelos Toxicocinéticos.Tesis de Maestria,(UASB)
Sucre-Bolivia

      Ó  
            Ó              
                                    
  
 (Krause)Kallunki)

SALAMANCA, C. Efrain1, TICONA, H. Juan Carlos1, RUIZ, P. Grace 1,

y GIMENEZ, T. Alberto 1

1
Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas,

Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224, La Paz-Bolivia.

SALAMANCA, C. Efrain efrain_salamanca@hotmail.com Av.Saavedra # 2224

Miraflores. La Paz, Bolivia Tele-Fax: 2240347