Abstrak

Latar Belakang Penurunan produksi erythropoietin (EPO) adalah penyebab utama

anemia yang berhubungan dengan penyakit ginjal kronis (CKD). Pengobatan dengan
EPO manusia rekombinan (rHuEPO) meningkatkan kualitas hidup dan kelangsungan
hidup pasien; Namun, ada variabilitas yang ditandai dalam menanggapi rHuEPO.
Saat ini, tidak ada tes laboratorium yang tersedia yang mampu mengevaluasi respons
terhadap pengobatan EPO. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggunakan
bioassay in vitro untuk memperkirakan efek lingkungan uremik terhadap proliferasi sel
eritroid yang bergantung pada EPO.
Metode: Sel-sel eritrolukemia manusia yang bergantung pada EPO (UT-7) diinkubasi
dengan EPO eksogen (2 u / ml) dan serum diperoleh dari 60 pasien anak-anak (usia
1–23 tahun). Tiga kelompok dipelajari: (1) 12 anak dengan dialisis (4 peritoneal, 8
hemodialisis); (2) 28 pasien dengan CKD 1-5 (tidak menggunakan dialisis), dan (3) 20
anak sehat.
Hasil Sera dari pasien dialisis menghambat pertumbuhan sel UT-7 dibandingkan
dengan kelompok CKD dan kontrol sehat pada 48 jam (p = 0,003 dan p = 0,04,
masing-masing) dan 72 jam kultur (p = 0,02 dan p = 0,07, masing-masing). Pada 18
pasien yang diobati dengan rHuEPO, ditemukan korelasi terbalik yang signifikan
antara indeks resistensi EPO dan proliferasi sel pada 48 jam (p = 0,007, r = - 0,63)
dan 72 jam (p = 0,03, r = .50,52).
Kesimpulan Temuan kami mendukung keberadaan zat penghambat erythropoiesis
dalam serum uremik. Mekanisme yang bergantung pada EPO / EPO-R dapat
berperan dalam menghambat erythropoiesis. Bioassay in vitro yang dijelaskan di sini
dapat berfungsi sebagai indikator daya tanggap rHuEPO yang dapat mendorong
penyelidikan lebih lanjut tentang mekanisme yang mendasari resistensi EPO.

Anemia adalah komplikasi umum penyakit ginjal kronis (CKD) yang mempengaruhi
sekitar 33% pasien anak dan remaja [1]. Kemungkinan efek buruk anemia pada CKD
termasuk kegagalan pertumbuhan, morbiditas dan mortalitas kardiovaskular, kualitas
hidup yang lebih rendah, dan cacat kognitif [2-4].
Hipoksia menginduksi peningkatan produksi hormon erythropoietin (EPO) di ginjal,
yang kemudian berikatan dengan plasma dan berikatan dengan reseptor EPO (EPO-
R). Reseptor ini, yang banyak diekspresikan pada sel-sel progenitor eritroid di
sumsum tulang, meningkatkan viabilitas, proliferasi, dan diferensiasi terminal dari
prekursor eritroid dan menyebabkan peningkatan massa sel darah merah. Kapasitas
pembawa oksigen darah dengan demikian ditingkatkan, meningkatkan ketegangan
oksigen jaringan, sehingga melengkapi loop umpan balik dan menekan peningkatan
EPO lebih lanjut [5]. Penurunan sintesis EPO oleh ginjal adalah penyebab utama
anemia terkait dengan CKD [4]. Penggunaan EPO manusia rekombinan (rHuEPO)
dalam pengobatan anemia pada pasien CKD mengurangi beban zat besi,
menghindari beberapa transfusi darah, meningkatkan kualitas hidup, dan
memperpanjang kelangsungan hidup [6].

Namun, ada variabilitas yang nyata dalam respons terhadap rHuEPO; > 20% pasien
anak dengan CKD stadium 4 memiliki kadar hemoglobin (Hgb) yang rendah bahkan
ketika diobati dengan rHuEPO [4, 6]. Mekanisme yang mendasari fenomena ini
termasuk peradangan, defisiensi besi, kekurangan gizi, dialisis yang tidak adekuat,
dan penyakit tulang metabolik [7-9]. Kehadiran sitokin proinflamasi dalam lingkungan
uremik merupakan faktor dalam mengurangi produksi sel darah merah [9-11]; Namun,
mekanisme tepatnya masih belum jelas. Mekanisme terkait EPO-R juga dapat
berperan dalam resistensi EPO [12].
Indeks resistensi EPO (ERI) adalah alat yang biasa digunakan dalam penelitian klinis
untuk memperkirakan tingkat respons terapi rHuEPO. Ada kekurangan studi yang
berkaitan dengan estimasi resistensi EPO pada populasi anak-anak dan remaja.
Penyesuaian dosis EPO dalam praktek klinis didasarkan pada pengukuran serial Hgb,
sehingga sering menunda pencapaian dosis optimal. Saat ini, tidak ada tes
laboratorium yang tersedia yang dapat memperkirakan respons pasien terhadap
pengobatan EPO. Sel-sel UT-7 adalah progenitor eritroid leukemia manusia yang
bergantung pada EPO dengan ekspresi EPO-R yang tinggi [13]; karenanya, sel-sel ini
dapat digunakan dalam memeriksa efek penghambatan serum ure-mic pada
pertumbuhan sel yang bergantung pada EPO.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji hipotesis bahwa serum pasien CKD
menghambat erythropoiesis, dengan menggunakan model UT-7 in vitro. Model in vitro
ini juga dapat berfungsi sebagai model eksperimental untuk menyelidiki mekanisme
yang mendasari resistensi EPO.
Subjek dan Metode
Kohort penelitian kami terdiri dari tiga kelompok pasien anak: (1) anak-anak dengan
dialisis; (2) pasien dengan CKD1-5 (tidak menggunakan dialisis) [14], dan (3) mereka
yang tidak memiliki CKD atau anemia, berperan sebagai kontrol. Pasien dengan CKD
direkrut dari Nephrology Institute, Schneider Children's Medical Center, Israel. Anak-
anak dalam kelompok kontrol direkrut baik dari Unit Penitipan Anak atau Departemen
Pediatri di institusi kami. Perhitungan estimasi GFR (eGFR) didasarkan pada formula
Schwartz yang baru [15]. Penyakit yang mendasari pasien CKD termasuk anak
displastik (25), sindrom Alport (2), sindrom nefrotik infantil (1), glomerulosklerosis
segmental fokal (1), penyakit ginjal polikistik dominan autosom (1), lupus nefritis (1) ,
sindrom uremik hemolitik atipikal (1), sindrom prune belly (1), nephronophthisis (1),
dan sindrom Denys-Drash (1). Data demografis dan klinis dikumpulkan dari grafik
medis terkomputerisasi pasien. Informed consent diperoleh dari semua pasien.

Analisis sampel darah

Sampel darah diproses untuk jumlah sel darah lengkap dan kadar serum urea,
kreatinin, elektrolit, hormon paratiroid (PTH), zat besi, transferin, feritin, vitamin B12,
asam folat, dan protein C-reaktif (CRP). ERI pada subkelompok pasien yang diobati
dengan rHuEPO dihitung berdasarkan persamaan berikut: ERI = dosis rHuEPO (unit
/ minggu / kg) / Hgb (g / dl) [16]. Saturasi transferrin dihitung sebagai Fe / Transferrin
× 70,9 [17].

Uji proliferasi sel

Sel UT-7 yang bergantung pada EPO [13] dibiakkan dalam Iscove's Modified
Dulbecco's Medium (IMDM) yang mengandung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 10 u / ml
penisilin, 10 μg / ml strepomomin, dan 2 u / ml rHuEPO. Sel diunggulkan dalam
rangkap tiga dalam 96-well, pelat kultur rata-rata (5 × 103 sel per sumur) dan
diinkubasi pada suhu 37 ° C dengan 2 u / ml rHuEPO (EPREX®-Epoetin Alfa) dan
serum (dilar 1:10) diperoleh dari pasien atau subyek kontrol selama 24, 48, dan 72
jam. Viabilitas sel ditentukan oleh natrium 39- (fenilaminokarbonil) -3,4-tetrazolium-bis
(4-metoksi-6-nitro) benzena sulfonat asam hidrat (XTT). Setelah inkubasi, 50 μl XTT
ditambahkan ke sel dan selanjutnya diinkubasi selama 4 jam pada 37 ° C. Pelat dibaca
oleh ELISA SpectraMAX 190 pada 492 nm. Proliferasi sel pada 48 dan 72 jam
dinormalisasi dengan nilai pada 24 jam untuk setiap sampel serum yang diuji.
Untuk menemukan apakah efek penghambatan sera uremik dimediasi melalui sumbu
EPO / EPO-R, kami menambahkan serum pasien dialisis dan kontrol ke garis sel
manusia K562 erythroleukemia manusia [18]. Meskipun sel-sel ini mengekspresikan
kadar EPO-R yang rendah pada permukaannya, mereka tidak bergantung pada
keberadaan hormon untuk proliferasi mereka [19]. Uji proliferasi sel dilakukan sesuai
dengan metode yang dijelaskan di atas (tanpa penambahan EPO). Efek serum pada
proliferasi sel-sel UT-7 yang bergantung pada EPO berkorelasi dengan ERI dan
eGFR. Dengan memanfaatkan garis sel UT-7 dan K562, kami dapat membandingkan
efek serum pasien terhadap proliferasi sel yang bergantung pada EPO dan tidak
bergantung pada EPO.

Analisis statistik
Variabel dengan distribusi tidak normal digambarkan sebagai median ± rentang;
Variabel kualitatif dinyatakan sebagai jumlah dan persentase. Efek serum pada
proliferasi sel UT-7 yang didorong EPO pada 48 dan 72 jam diperiksa dalam tiga
kelompok studi (kontrol, pasien CKD non-dialisis, dan pasien dialisis). Analisis serupa
(uji Kruskal-Wallis H) dilakukan untuk menentukan efek serum pada proliferasi sel
K562. Uji Mann-Whitney U dilakukan untuk variabel non-parametrik dan uji chi-kuadrat
untuk variabel biner.
Korelasi antara ERI, proliferasi sel, PTH, saturasi transferrin, vitamin B12, asam folat,
dan CRP pada subkelompok pasien yang diobati dengan rHuEPO dilakukan dengan
uji korelasi Spearman. Transformasi log dilakukan untuk mencapai distribusi linier.
Nilai p dua sisi <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Semua analisis dilakukan
dengan menggunakan perangkat lunak SPSS versi 17. Penelitian ini disetujui oleh
Komite Etika dari Pusat Medis Rabin, Israel. Informed consent diperoleh dari peserta
penelitian yang berusia> 18 tahun atau dari wali sah mereka yang berusia <18 tahun.

Hasil
Enam puluh anak-anak, 40 laki-laki dan 20 perempuan (usia 1–23 tahun), terdaftar
dalam penelitian ini. Dua belas berada pada dialisis (4 peritoneal dan 8 hemodialisis),
28 diklasifikasikan dengan tahap 1-5 CKD (1 dengan CKD1, 7 dengan CKD2, 9
dengan CKD 3, 7 dengan CKD 4, dan 4 dengan CKD 5), dan 20 kontrol . Lama waktu
yang dihabiskan untuk dialisis adalah 0,25-9,25 tahun pada kelompok hemodialisis
dan 1,3-2,0 tahun pada kelompok dialisis peritoneal. Tidak ada perbedaan yang
signifikan antara usia, distribusi jenis kelamin, dan lamanya waktu yang dihabiskan
untuk dialisis antara pasien hemodialisis dan mereka yang menggunakan dialisis
peritoneal. Semua pasien dialisis dan enam pasien CKD diobati dengan rHuEPO; 16
menerima darbopoietin (Aranesp) dan dua injeksi beta epoietin (Recormon). Konversi
dosis dua obat dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik: 1 mcg darbopoietin alfa =
200 u epoietin beta (Aranesp (darbopoietin-alfa) monograf produk, Mississauga (ON):
Amgen Canada Inc., 2011 ). Tiga kelompok studi disesuaikan dengan usia dengan
dominasi laki-laki yang diamati pada kelompok CKD. Tingkat Hgb yang lebih rendah
ditemukan pada pasien dialisis dibandingkan dengan pasien CKD dan kontrol non-
dialisis; kadar PTH serum utuh secara signifikan lebih tinggi pada kelompok dialisis.
Kadar asam folat serum lebih rendah pada kelompok CKD dibandingkan dengan
pasien dialisis. Kadar vitamin B12 serum dan saturasi transferrin serupa pada semua
kelompok. CRP serum lebih tinggi pada kelompok pasien dialisis (Tabel 1).

Korelasi positif yang signifikan ditemukan antara ERI dan PTH (p = 0,003; r = 0,52)
dan ERI dan CRP (p = 0,05; r = 0,48). Korelasi terbalik ditemukan antara ERI dan
saturasi transferrin (p = 0,03; r = - 0,52) (Gambar 1). Tidak ada korelasi yang
ditemukan antara ERI dan kadar asam folat serum. Proliferasi sel yang bergantung
pada UT-7 EPO secara signifikan menurun di hadapan serum pasien dialisis
dibandingkan dengan proliferasi di hadapan serum dari CKD dan kelompok kontrol
pada 48 jam (p = 0,003 dan p = 0,04, masing-masing ) dan 72 h (masing-masing p =
0,02 dan p = 0,07) (Gbr. 2). Korelasi terbalik yang signifikan antara ERI dan proliferasi
sel ditemukan pada 48 dan 72 jam (p = 0,007; r = -0,63 danp = 0,03; r = -0,52, masing-
masing) (Gbr. 3). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam proliferasi sel UT-7
antara serum dari CKD dan kelompok kontrol pada 48 dan 72 jam (masing-masing p
= 0,36 dan p = 0,9) (Gambar 2). Tidak ada korelasi yang ditemukan antara tingkat
proliferasi sel dan eGFR pada kelompok CKD. Setelah inkubasi sel K562 dengan
serum dari kelompok dialisis dan kontrol, penurunan proliferasi sel diamati pada
kelompok dialisis dibandingkan dengan kontrol pada 48 jam (p = 0,002). Tidak ada
perbedaan yang signifikan antara kelompok pada 72 jam (p = 0,55).

Diskusi
Penelitian saat ini menyajikan aplikasi baru dari bioassay in vitro yang dirancang untuk
menguji efek lingkungan uremik terhadap proliferasi sel yang bergantung pada EPO
dengan memanfaatkan garis sel manusia eritrolukemia (UT-7).
Resistensi terhadap EPO pada pasien CKD bersifat multifaktorial. Berbagai
mekanisme telah diusulkan seperti defisiensi besi, defisiensi B12 dan folat, dan
penyakit tulang metabolik [7-9, 20]. Sejalan dengan laporan sebelumnya [21], kami
menemukan korelasi positif yang signifikan antara ERI dan PTH dan korelasi terbalik
antara ERI dan saturasi transferin. Kekurangan asam folat merupakan faktor penting
dalam resistensi EPO [22]. Tidak ada korelasi yang ditemukan antara kadar asam
folat dan ERI. Ada batasan ketergantungan pada kadar serum asam folat dalam
diagnosis defisiensi folat, karena folat serum mengalami perubahan signifikan terkait
dengan asupan makanan baru-baru ini.

Oleh karena itu, kadar folat serum tidak secara akurat mencerminkan status folat
tubuh jangka panjang dibandingkan dengan konsentrasi folat sel darah merah [23].
Pengukuran konsentrasi folat sel darah merah tidak dapat dicapai; oleh karena itu,
status folat yang tepat tidak dapat ditentukan. Meskipun banyak nutrisi dan faktor
metabolik yang terlibat dalam resistensi EPO, hiporesponsiveness terhadap rHuEPO
terjadi pada pasien CKD yang memiliki cadangan zat besi yang cukup dan tanpa
hiperparatiroidisme atau defisiensi vitamin; oleh karena itu, faktor lain mungkin
berperan dalam resistensi EPO. Fungsi EPO-R, serta interaksi antara EPO-R dan
EPO, sangat penting dalam proses erythropoiesis. Ada beberapa bukti bahwa
lingkungan uremik dapat mempengaruhi sumbu EPO-R / EPO [24-26].
Penelitian kami dirancang untuk menguji efek langsung dari lingkungan uremik pada
eritropoiesis yang bergantung pada EPO dengan menggunakan garis sel UT-7
sebagai pengganti sel-sel progenitor eritroid. Kejenuhan EPO-R dalam sel UT-7
dicapai dengan adanya rHuEPO pada konsentrasi 2 u / ml [13, 27]. Kami menemukan
bahwa serum dari pasien dialisis pediatrik menghambat pertumbuhan sel UT-7
bahkan ketika reseptor EPO jenuh. Karena tidak ada perbedaan yang signifikan
antara karakteristik demografi dan durasi pada dialisis antara pasien dengan dialisis
peritoneal dan pasien dialisis peritoneal, dan karena jumlah total pasien pada dialisis
relatif kecil, kami menganalisis pasien ini sebagai satu kelompok. Menariknya, efek
penghambatan tidak diamati pada pasien CKD yang tidak menggunakan dialisis.
Selain itu, tidak ada korelasi antara eGFR dan sel
proliferasi dicatat. Hanya enam pasien CKD yang diobati dengan rHuEPO (Tabel 1).
Kadar hemoglobin pada kelompok CKD tidak berbeda secara signifikan dari kelompok
kontrol. Kami, oleh karena itu, menganggap bahwa serum dari pasien CKD yang tidak
menggunakan dialisis tidak mengandung jumlah zat penghambat yang cukup untuk
pertumbuhan sel UT-7.
ERI diterima secara luas sebagai indikator responsif terhadap pengobatan rHuEPO.
Meskipun korelasi antara ERI, morbiditas kardiovaskular, dan kematian secara
keseluruhan telah dilaporkan pada populasi orang dewasa [28, 29], beberapa laporan
telah menantang relevansinya [16]. Karena tidak ada parameter lain yang dilaporkan
lebih unggul dari ERI, kami menggunakannya sebagai penaksir klinis resistensi EPO.
Analisis 18 pasien yang diobati dengan rHuEPO menunjukkan korelasi terbalik yang
signifikan antara ERI dan proliferasi sel eritroid.
Untuk menilai apakah efek penghambatan serum uremik spesifik untuk proliferasi
yang didorong oleh EPO, kami memeriksa pertumbuhan sel K562 (EPO-independen)
di hadapan seraobtain dari pasien dialisis dan kontrol. Serum uremik menghambat
pertumbuhan sel K562 pada 48 jam tetapi tidak pada 72 jam. Temuan ini dapat
menyarankan beberapa mekanisme yang mengganggu erythropoiesis pada pasien
CKD.
Beberapa di antaranya mungkin bertindak pada sumbu EPO / EPO-R sementara
faktor lain bertindak oleh jalur independen EPO-R. Salah satu mekanisme yang
diusulkan adalah tingginya kadar EPO-R yang larut dalam plasma yang dapat
menghambat pengikatan EPO ke reseptor transmembran dan juga ditemukan
berkorelasi dengan resistensi EPO pada pasien CKD [24, 25]. Faktor-faktor lain
mungkin terlibat dalam penghambatan EPO. Akumulasi protein pengikat memainkan
peran penting dalam menolak aksi hormon pertumbuhan dan faktor pertumbuhan
insulin 1 (IGF-1) pada pasien dengan CKD [30]. Meskipun, sejauh pengetahuan kami,
protein pengikat EPO belum, belum, telah diidentifikasi pada pasien dengan CKD,
penelitian lebih lanjut harus fokus pada pengenalan kemungkinan inhibitor. Beberapa
faktor tambahan seperti fibroblast growth factor 23 (FGF23) dapat mempengaruhi
erythropoiesis pada pasien CKD. FGF23 adalah hormon pro-fosfaturik yang
disekresikan oleh osteosit dan hormonnya levelnya meningkat pada CKD [31]. Efek
penghambatan langsung FGF23 pada erythropoiesis prenatal dan postnatal telah
dilaporkan dalam model hewan [32]. Selain itu, kadar FGF23 yang tinggi dikaitkan
dengan kadar Hgb yang rendah pada pasien CKD [33].
Penyakit ginjal kronis dikaitkan dengan inflamasi persisten [34, 35]. Seperti dilaporkan
sebelumnya, korelasi positif yang signifikan ditemukan antara tingkat CRP dan ERI
dalam kelompok penelitian kami. Toksin uremik telah terlibat dalam penyebaran
sitokin proinflamasi seperti IL-1, IL-6, interferon gamma, dan faktor nekrosis tumor
yang dapat mengganggu sumbu EPO / EPO-R melalui beberapa mekanisme [35 ]
termasuk menurunkan regulasi EPO-R pada sel progenitor eritroid [25]. Lebih lanjut,
sitokin proinflamasi meningkatkan produksi protein yang mengandung SH2 yang
diinduksi sitokin yang berikatan langsung dengan domain sitoplasma EPO-R serta
mengurangi aktivasi EPO-R [36]. Toksin potensial uremik lainnya seperti protein
spesifik penangkapan 6 (Gas6) dilaporkan menghambat eritropoiesis pada pasien
CKD [37]. Hepcidin, hormon pengatur zat besi, memainkan peran penting dalam
mekanisme yang diatur oleh umpan balik yang mempertahankan konsentrasi plasma
yang memadai dari zat besi-transferrin untuk erythropoiesis [38].
Pada CKD, peradangan dan gangguan pembersihan ginjal meningkatkan kadar
hepcidin plasma, sehingga menghambat penyerapan zat besi duodenum dan
penyerapan zat besi dalam makrofag. Efek ini menyebabkan defisiensi besi fungsional
dan resistensi terhadap EPO [39]; karenanya, lingkungan uremik mengandung
banyak zat yang dapat menghambat erythropoiesis.
Penyesuaian dosis rHuEPO pada pasien CKD didasarkan pada pengukuran serial
kadar Hgb; oleh karena itu, mencapai dosis optimal dapat ditunda. Meskipun bioassay
in vitro yang disajikan di sini tidak dapat menggantikan beberapa parameter klinis
berdasarkan keputusan perawatan yang dibuat, itu mungkin memberikan alat
tambahan untuk memperkirakan respons terhadap EPO dan memfasilitasi
penyesuaian dosis rHuEPO.

Kesimpulannya, untuk yang terbaik dari pengetahuan kita, penelitian kami adalah
yang pertama untuk menguji efek langsung dari serum yang diperoleh dari pasien
CKD pada proliferasi sel eritroid in vitro. Temuan kami mendukung adanya faktor
penghambat dalam serum pasien ini. Kami menyajikan data kohort kami yang relatif
kecil untuk mengantisipasi bahwa hal itu akan merangsang penelitian lebih lanjut di
bidang ini dengan kohort yang lebih besar dan berharap bahwa studi tambahan yang
menggunakan sistem eksperimental yang serupa akan mengidentifikasi zat
penghambat yang relevan dan mekanisme yang berkontribusi terhadap resistensi
EPO.