AKTIVITAS SITOTOKSIK KOMBINASI EKSTRAK

ETANOL RIMPANG TEMU KUNCI (Boesenbergia pandurata)

DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL T47D

USULAN SKRIPSI

Oleh:

ISNA LAILIATUL FITRIYATI

K100140146

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
SURAKARTA
2017

i
 PENGESAHAN USULAN SKRIPSI

AKTIVITAS SITOTOKSIK KOMBINASI EKSTRAK

ETANOL RIMPANG TEMU KUNCI (Boesenbergia pandurata)
DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL T47D

Oleh:

ISNA LAILIATUL FITRIYATI

K100140146

Telah disetujui dan disahkan pada

Hari :
Tanggal :

Reviewer Pembimbing

ii
 DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL............................................................................................. i
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... ii
DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL ................................................................................................ v
A. JUDUL USULAN SKRIPSI ..................................................................... 1
B. LATAR BELAKANG MASALAH.......................................................... 1
C. RUMUSAN MASALAH .......................................................................... 3
D. TUJUAN PENELITIAN ........................................................................... 3
E. TINJAUAN PUSTAKA............................................................................ 3
1. Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) ............................................. 3
a. Taksonomi ..................................................................................... 3
b. Sinonim ......................................................................................... 4
c. Nama Lokal ................................................................................... 4
d. Morfologi ..................................................................................... 4
e. Kandungan Kimia ......................................................................... 5
2. Doksorubisin ....................................................................................... 5
3. Kanker Payudara ................................................................................. 6
4. Sel T47D ............................................................................................. 6
5. MTT assay .......................................................................................... 6
F. LANDASAN TEORI ................................................................................ 7
G. HIPOTESIS ............................................................................................... 8
H. METODE PENELITIAN .......................................................................... 8
1. Kategori dan Rancangan Penelitian .................................................... 8
2. Variabel Penelitian .............................................................................. 8
a. Variabel bebas ............................................................................... 8
b. Variabel tergantung ....................................................................... 9
c. Variabel kendali ............................................................................ 9
3. Alat dan Bahan .................................................................................... 9

iii
 a. Alat ................................................................................................ 9
b. Bahan............................................................................................. 9
4. Tempat Penelitian................................................................................ 9
5. Rencana Penelitian .............................................................................. 9
a. Identifikasi rimpang temu kunci ................................................... 9
b. Ektraksi ......................................................................................... 10
c. Uji aktivitas sitotoksik................................................................... 10
1) Sterilisasi alat .......................................................................... 10
2) Sterilisasi LAF ........................................................................ 10
3) Pertumbuhan sel ...................................................................... 10
4) Pemanenan sel ......................................................................... 11
5) Uji aktivitas sitotoksik dengan metode MTT .......................... 11
6. Analisis Data ....................................................................................... 12
I. JADWAL PELAKSANAAN .................................................................... 13
J. DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 14
K. LAMPIRAN .............................................................................................. 16

iv
 DAFTAR TABEL

Halaman
Tabel 1. Absorbansi kontrol sel dan media ........................................................... 16
Tabel 2. Kombinasi ekstrak etanol rimpang temu kunci dengan doksorubisin .... 16
Tabel 6. Nilai CI dari kombinasi ekstrak dengan doksorubisin pada sel T47D.... 16

v
 1

A. JUDUL USULAN SKRIPSI

Aktivitas Sitotoksik Kombinasi Ekstrak Rimpang Temu Kunci
(Boesenbergia pandurata) dengan Doksorubisin Terhadap Sel T47D.

B. LATAR BELAKANG MASALAH

Kanker merupakan penyakit yang disebabakan oleh pertumbuhan
abnormal pada sel-sel jaringan tubuh sehingga menjadi ganas dan menyerang
jaringan lain malalui darah atau limfe. Salah satu kanker yang memiliki resiko
kematian tertinggi di dunia adalah kanker payudara. Kasus kematian kanker
payudara memiliki proporsi 40% lebih tinggi dibandingkan dengan penyakit
kanker lainnya dan mengalami peningkatan setiap tahunnya (KeMenkes, 2016).
Indonesia menempati peringkat ketiga sebesar 12 % dibawah China ( 46% ) dan
Jepang ( 14%) pada kasus kematian kanker payudara (Youlden et al, 2014).
Upaya penanganan kanker payudara dapat dilakukan dengan kemoterapi
mengunakan obat tunggal maupun kombinasi, salah satunya doksorubisin (Dipiro
et al, 2015). Kemoterapi memberikan efek samping berupa mual, muntah, sampai
dengan gangguan ingatan (Muhammad et al, 2014). Pengurangan dosis diketahui
mampu mengurangi efek samping yang timbul akibat penggunaan
doksorubisin (Wattanapitayakul et al, 2005). Salah satu pendekatan yang kini
dilakukan untuk meminimalkan efek dari kemoterapi adalah
mengkombinasikan dengan suatu agen kemoprevensi. Senyawa kemoprevensi
yang bersifat non-toksik dikombinasi dengan agen kemoterapi untuk
meningkatkan efikasinya dalam menurunkan toksisitas terhadap jaringan
normal (Jenie and Meiyanto, 2007).
Kemoterapi dengan kombinasi dinyatakan lebih efektif daripada
diberikan dalam bentuk tunggal. Hasil penelitian Jenie and Meiyanto (2007)
menunjukkan bahwa daun sambung nyawa berpotensi meningkatkan efikasi
dan menurunkan toksisitas agen kemoterapi dalam jaringan normal, penelitian
kombinasi daun sambung nyawa dengan doksorubisin terhadap sel T47D
memberikan efek sinergis (IK <1). Efek sinergis dengan indeks kombinasi
optimum 0,48 juga ditunjukkan pada kombinasi arekolin dengan doksorubisin
 2

pada kanker serviks (Maruti et al, 2011). Oleh karena itu, perlu dilakukan
penelitian terhadap agen kemoprevensi untuk mencari kandidat yang memiliki
efek sinergis dalam kombinasi dengan obat antikanker. Salah satu bahan alam
yang berpotensi sebagai agen kemoprevensi adalah rimpang temu kunci
(Boesenbergia pandurata).
Temu kunci (Boesenbergia pandurata) merupakan salah satu tanaman yang
memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker.
Trakoontivakorn et al. (2001) menyatakan bahwa ekstrak metanolik dari rimpang
temu kunci mempunyai efek antimutagenik pad Trp-P-1 pada uji Amest tes. Enam
kandungan zat aktif yang menunjukkan antimutagenik adalah kalkon, cardamonin,
pinocembrin, pinostrobin, 4-hidroksipanduratin, dan panduratin A dengan IC50
masing-masing zat adalah 5.2 ± 0.4m M, 5.9 ± 0.7 m M, 6.9 ± 0.8 m M, 5.3 ± 1.0
m M, 12.7 ± 0.7 m M and 12.1± 0.8m M. Salah satu senyawa dari rimpang temu
kunci (Boesenbergia pandurata) adalah penduratin A yang dapat menghambat sel
kanker HepG2 yang diinduksi dengan tert-Butylhydroperoxide (t-BHP). Tert-
Butylhydroperoxide (t-BHP) merupakan senyawa yang biasa digunakan untuk
menginduksi kanker dengan mekanisme pembentukan intermediet radikal bebas
(Sohn et al., 2005). Selain itu panduratin A dapat menghambat pertumbuhan sel
kanker payudara MCF7 dan sel adenokarsinoma kolon HT-29 pada manusia
dengan nilai IC50 sebesar 3,75 µg/ml dan 6, 56 µg/ml melalui penghambatan
COX-2 yang merupakan faktor penting dalam perkembangan inflamasi dan sel
tumor (Kirana et al., 2006). Penelitian lain menyatakan bahwa salah satu
tumbuhan marga Kaempferia yaitu rimpang temu kunci (Kaempferia pandurata)
memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai
IC50 sebesar 66 uM (Sarmoko et al, 2008). Berdasarkan uraian di atas maka akan
dilakukan suatu penelitian mengenai kombinasi ekstrak etanol rimpang temu
kunci (Boesenbergia pandurata) dengan doksorubisin terhadap sel kanker
payudara T47D.
 3

C. RUMUSAN MASALAH
Berdasarkan latar belakang tersebut, diperoleh rumusan masalah sebagai
berikut:
1. Apakah kombinasi ekstrak rimpang temu kunci (Boesenbergia pandurata)
dengan doksorubisin memiliki aktivitas terhadap sel kanker payudara T47D ?
2. Apakah golongan senyawa kimia apakah yang terkandung dalam ekstrak
etanol rimpang temu kunci (Boesenbergia pandurata) ?
3. Bagaimana aktivitas IC50 dan CI kombinasi ekstrak rimpang temu kunci
(Boesenbergia pandurata) dengan doksorubisin pada sel kanker payudara
T47D ?

D. TUJUAN PENELITIAN
Berdasarkan latar belakang penelitian dan rumusan masalah, maka tujuan
penelitian ini adalah:
1. Mengetahui senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol rimpang
temu kunci (Boesenbergia pandurata).
2. Mengetahui aktivitas ekstrak etanol rimpang temu kunci (Boesenbergia
pandurata) dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara T47D.
3. Mengetahui nilai IC50 dan CI kombinasi ektrak etanol rimpang temu kunci
(Boesenbergia pandurata) dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara
T47D.

E. TINJAUAN PUSTAKA
1. Temu Kunci (Boesenbergia pandurata)
a. Taksonomi
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Ordo : Zingiberales
Famili : Zingiberaceae
Genus : Boesenbergia
 4

Spesies : Boesenbergia pandurata

b. Sinonim
B. rotunda (L.) Mansfeld, Curcuma rotunda L., Kaempferia pandurata Roxb.,
Gastrochilus pandurata (Roxb.) Ridley.
c. Nama Lokal
Sumatera: Temu kunci (Melayu), tamu kunci (Minangkabau); Jawa: Temu
kunci (Sunda), kunci (Jawa), temmo konce, konce (Madura), koncih
(Kangean); Nusa Tenggara: Temu konci (Bali), dumu kunci (Bima); Maluku:
Tumu konci, tombu konci (Ambon), anipa wakang, uni nowo, uni rawu
(Hilaalfuru), aruhu konci (Haruku), sun (Buru), rutu kakusi, ene sitale
(Seram), tamputi (Ternate); Sulawesi: Tamukonci (Makasar), temu konci
(Bugis).
d. Morfologi
Terna dengan tinggi antara 30-82 cm, umumnya tidak berbatang tetapi
dengan rimpang dalam tanah. Rimpang memiliki panjang antara 5-30 cm dan
garis tengah antara 0,5-2 cm, berwarna coklat kekuningan, agak
berpenebalan. Setiap individu umumnya memiliki daun sebanyak 2-7 helai, di
bagian bawah sering terdapat pelepah daun berwarna merah tanpa helai daun;
tangkai daun beralur, tidak berambut, memiliki panjang antara 7-16 cm. Helai
daun tegak, berbentuk lanset lebar atau agak jorong, ujung daun lancip,
permukaan halus tetapi bagian bawah agak berambut terutama sepanjang 85
penulangan, helai daun berwarna hijau muda, lebar antara 5-11 cm, kadang-
kadang sampai 17 cm, panjang helai daun antara 12-50 cm. Perbungaan pada
pucuk berdaun, panjang tangkai bunga 4-11 cm, umumnya tangkai bunga
tersembunyi dalam 2 helai daun terujung, umumnya berkelompok dalam 2
deretan, berbentuk perahu dengan ujung rata; bunga melekat pada bagian
tandan yang pipih sempit; kelopak bunga berbentuk tabung, bergerigi 1-3
buah, panjang kelopak antara 3-18 mm; tajuk berbentuk tabung dengan
panjang antara 50-52 mm, warna merah atau putih kekuningan, berbentuk
lanset dengan lebar 4 mm dan panjang 18 mm (Badan POM RI, 2011).
 5

e. Kandungan Kimia
Rimpang mengandung: minyak atsiri, eukaliptol, kamfor, d-borneol, sinamil
aldehida, etil sinamat, etil p-metoksi sinamat, kaempferol, kaempferid, dl-
pinosembrin (2,3 dihidrokrisin), 2'6' dihidroksi- 4'- metoksikalkon, dl-
pinostrobin (5- OOH- Kaempferol- OH- hidroksi- 7- metoksi flavanon),
kardamomin, 1- 8-sineol, 2'4'dihidroksi-6'-metoksi kalkon, zingiberen, asam
kavisinat, kurkumin, amilum, d-pinen seskuiterpen, zedoarin. Dari penelitian
lain diperoleh informasi bahwa ekstrak rimpang temu kunci dapat
menghambat bakteri isolat penyakit Orf (Ektima kontagiosa) (Plantus, 2008).
Minyak atsiri terdiri dari seskuiterpenoid dan monoterpenoid (geraniol dan
nerol).8 Flavonoid (pinostrobin, alpinetin, pinosembrin kalkonkardamonin,
panduratin A). Selain itu temu kunci mengandung ar-kurkumen,
xanthorrhizol, dehidrokurdion, furadienon (Badan POM RI, 2011).
2. Doksorubisin
Doksorubisin merupakan antibiotik golongan antasiklin yang banyak
digunaka untuk pengobatan kanker seperti leukemia akut, kanker
payudara, kanker tulang, dan ovarium (Childs et al., 2002). Senyawa ini
diisolasi dari Streptomyces peuceetius var caesius (Minotti et all, 2004).
Mekanisme kerja dengan cara merusak DNA dengan interkalasi DNA
sehingga menghambat sintesis dari DNA dan RNA, menghambat
topoisomerase II serta membentuk intermediet radikal semiquinon dan
radikal bebas oksigen akibat interaksi antara doksorubisin dan zat besi
(Brunton et al, 2006). Doksorubisin pada pemakaiannya memiliki
beberapa efek samping diantara mual, muntah, alopecia, mielosupresi,
kebotakan, mukositis dan cardiotoxicity (IONI, 2008).
3. Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan keganasan sel pada jaringan payudara yang
dapat berasal dari epitel duktus maupun lobulusnya (Kementrian
Kesehatan RI, 2017). Terdapat 3 reseptor permukaan spesifik yang
digunakan untuk mengklasifikasi jenis kanker payudara yaitu reseptor
esterogen (ER), reseptor progesteron (PR) dan reseptor neu/ Human
 6

Epidermal Growth Factor Receptor (HER)2 (Roche, 2017). Faktor risiko

yang dapat meningkatkan risiko terjadinya kanker payudara meliputi jenis
kelamin, usia, riwayat keluarga, kondisi payudara dan hormon esterogen
(National Breast And Ovarian Cancer Centre, 2009). Deteksi kanker
payudara dapat dilakukan melalui tindakan skrining diantaranya Periksa
Payudara Sendiri ( SADARI), Periksa Payudara Klinis (SADANIS),
mammografi skrining (Kementrian Kesehatan RI, 2017).
4. T47D
Sel T47D merupakan continuous cell line yang diisolasi dari jaringan
tumor ductal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continuous cell
line sering digunakan dalam penelitian in vitro karena mudah dalam
penanganan, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas,
homogenitas yang tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock. Sel
kanker payudara T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi.
Missence mutation terjadi pada residu 194 (dalam zinc-binding domain,
L2), sehingga p53 tidak dapat berikatan dengan response element pada
DNA. Hal ini mengakibatkan berukurang bahkan hilangnya kemampuan
p53 untuk regulasi cell cycle. Sel T47D merupakan sel kanker payudara
ER/ PR-positif. Induksi estrogen eksogen mengakibatkan peningkatan
proliferasi. Sel T47D merupakan sel yang sensitif terhadap doksorubisin
(CCRC, 2017).
5. MTT Assay
MTT (Microculture Tetrazolium Salt) Assay merupakan metode dengan
prinsip reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase yang membentuk
kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen
stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal berwarna ungu yang
kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Intensitas
warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel hidup.
Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka jumlah sel
 7

hidup semakin banyak. Keunggulan metode ini karena cepat, mudah,

ekonomis, akurat, dan dapat dipercaya (CCRC, 2008).

F. LANDASAN TEORI
Rimpang temu kunci merupakan salah satu tanaman yang memiliki
potensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker. Trakoontivakorn et
al. (2001) menyatakan bahwa ekstrak metanolik dari rimpang temu kunci
mempunyai efek antimutagenik pad Trp-P-1 pada uji Amest tes. Enam
kandungan zat aktif yang menunjukkan antimutagenik adalah kalkon,
cardamonin, pinocembrin, pinostrobin, 4-hidroksipanduratin, dan panduratin
A dengan IC50 masing-masing zat adalah 5.2 ± 0.4m M, 5.9 ± 0.7 m M, 6.9 ±
0.8 m M, 5.3 ± 1.0 m M, 12.7 ± 0.7 m M and 12.1± 0.8m M. Salah satu
senyawa dari rimpang temu kunci (Boesenbergia pandurata) adalah
penduratin A yang dapat menghambat sel kanker HepG2 yang diinduksi
dengan tert-Butylhydroperoxide (t-BHP). Tert-Butylhydroperoxide (t-BHP)
merupakan senyawa yang biasa digunakan untuk menginduksi kanker dengan
mekanisme pembentukan intermediet radikal bebas (Sohn et al., 2005). Selain
itu panduratin A dapat menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF7
dan sel adenokarsinoma kolon HT-29 pada manusia melalui penghambatan
COX-2 yang merupakan faktor penting dalam perkembangan inflamasi dan sel
tumor. Selain itu, panduratin A juga telah dibuktikan mempunyai aktivitas
antimutagenik melalui induksi Quinon Reduktase (QR) yang merupakan
enzim fase II. Enzim fase II memiliki peran penting dalam mekanisme
pertahanan sel dan metabolisme, seperti detoksifikasi senyawa-senyawa
elektrofilik (Kirana et al., 2006). Berdasarkan penelitian Yun et al. (2006)
menyatakan bahwa panduratin A yang merupakan derivat dari kalkon juga
mempunyai berbagai efek biologis, seperti antiinflamasi, analgetik, dan
antioksidan. Pada penelitian sebelumnya, telah dibuktikan bahwa panduratin
A memiliki efek antiinflamasi pada model sel RAW 264. Namun, penelitian
lebih lanjut menunjukkan bahwa panduratin A berpotensi sebagai antikanker
dengan mekanisme aksi menginduksi apoptosis pada sel kanker kolon HT29.
 8

Pada kanker kolon, panduratin A lebih poten dari pada inhibitor selektif COX-
2, misalnya Celecoxib; dan obat-obat antitumor (5-flurouracil and Cisplatin).
Penelitian lain menyatakan bahwa salah satu tumbuhan marga Kaempferia
yaitu rimpang temu kunci (Kaempferia pandurata) memiliki aktivitas
sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 sebesar 66
uM (Sarmoko et al, 2008). Berdasarkan uraian di atas maka akan dilakukan
suatu penelitian mengenai kombinasi ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia
pandurata) dengan doksorubin terhadap sel kanker payudara T47D.
Salah satu upaya untuk meminimalkan toksisitas pada jaringan normal
akibat penggunaan agen kemoterapi yaitu mengkombinasikan dengan senyawa
yang bersifat non-toksik yang disebut senyawa kemoprevensi. Penelitian
menunjukkan bahwa kombinasi ekstrak etanolik daun sambung nyawa (
Gynura procumbens (Lour.) Merr,) dengan doksorubisin diketatahui
memberikan efek sinergis dibuktikan dengan nilai IK<1. Dan IC50 sebesar 90
µg/mL (Jenie and Meiyanto, 2007). Pada penelitian ini peneliti menggunakan
rimpang temu kunci sebagai agen kemoprevensi yang dikombinasikan dengan
agen kemoterapi doksorubisin. Dari uraian diatas peneliti mampu untuk
membuat sebuah hipotesis dari penelitian ini.

G. HIPOTESIS
Kombinasi ekstrak etanol rimpang temu kunci(Boesenbergia pandurata)
dengan doksorubisin memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D.

H. METODE PENELITIAN
1. Kategori dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Post Test Only
With Control Group Design.
2. Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas: variabel yang digunakan yaitu ekstrak rimpang temu
kunci dengan konsentrasi 500; 300; 200 µg/mL dan doksorubisin 31,25;
62,5; 250 µg/mL.
 9

b. Variabel Tergantung: variabel yang digunakan yaitu absorbansi sel hidup.

c. Variabel Kendali: variabel yang digunakan yaitu suhu inkubasi 37 oC
selama 48 jam.
3. Alat dan Bahan
a. Alat
Alat-alat (pyrex), mikropipet (Soccorex), waterbath (Heidolp), Elisa
reader (ELx800 Bio Tech), mikroskop (Olympus CKX 41), 96 well plate,
Laminar Air Flow (Esco), pipa kapiler, ependorf, corong pisah, counter,
conical tube, blue tape steril, yellow tape steril, inkubator CO2 (Binder),
LAF (Esco), rotary evaporator (Heidolp), kertas saring, Silika GF254.
b. Bahan
Umbi ubi jalar ungu, sel T47D yang diperoleh dari koleksi laboratorium
kultur sel mamalia Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah
Surakarta, Etanol 96%, aquadest, doksorubisin, Media DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), FBS 10%, penisilin-
streptomisin, PBS (Phosphate Buffer Salin), MTT 5mg/mL dalam PBS,
SDS 10% dalam HCl 0,01 N sebagai larutan stopper, DMSO (dimetil
sulfoksida), tripsin-EDTA (tripsin 0,25%), pereaksi Dragendodff, FeCl3,
aitroborat, anisaldehid-asam sulfat.
4. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Kimia Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
5. Rencana Penelitian
a. Identifikasi rimpang temu kunci
Penelitian dimulai dengan tahap identifikasi tanaman rimpang temu kunci
di laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah
Surakarta. Identifikasi tanaman bertujuan untuk menetapkan kebenaran
yang berkaitan dengan ciri-ciri morfologi secara makroskopis dari
tanaman rimpang temu kunci.
 10

b. Proses Ekstraksi
Ekstraksi menggunakan metode maserasi merendam bahan ke dalam pelarut
etanol 96% selama 24 jam dalam suhu ruang dan terhindar dari cahaya.
Bahan yang akan diekstraksi ditimbang seberat 300 gram dengan pelarut
yang digunakan sebanyak 1,5 L untuk tiap pelarut. Remaserasi dilakukan
untuk mendapatkan hasil rendemen yang banyak. Remaserasi dilakukan
sebanyak 3 kali pengadukan sesekali untuk mendapatkan hasil yang
maksimal. Ekstrak yang diperoleh dikentalkan dengan rotary evaporator dan
kemudian dikeringkan dengan bantuan waterbath. Ekstrak kering kemudian
ditimbang untuk mengetahui rendemennya dari berat bahan awal. Ekstrak
yang didapat kemudian dilakukan uji secara kualitatif dengan mengelusi pada
plat kromatografi lapis tipis (KLT) yang telah disiapkan.
c. Uji Aktivitas sitotoksik
1) Sterilisasi Alat
Alat-alat gelas dicuci bersih kemudian dikeringkan dan dibungkus kertas.
Peralatan gelas yang tidak tahan terhadap pemanasan seperti pipet tetes,
media, blue tips, yellow tips dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan
pada suhu 121 oC selama 15 menit. Peralatan gelas yang tahan terhadap
pemanasan dimasukkan dalam oven pada suhu 175oC selama 2 jam.
2) Sterilisasi LAF
Laminar Air Flow (LAF) disterilkan dengan cara menyalakan lampu UV
selama 15 menit sebelum digunakan. Permukaan tempat kerja disterilkan
dengan disemprot alkohol 70% sebelum digunakan.
3) Pertumbuhan sel
Sel T47D diambil dari tangki nitrogen cair kemudian dicairkan dengan
waterbath pada suhu 37 oC. Etanol 70% disemprotkan pada Cryo tube,
dibuka dan dipindahkan sel kedalam tabung conical tube steril yang berisi
media RPMI. Suspensi sel kemudian disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan yang terbentuk kemudian
 11

dibuang. Media pertumbuhan dimasukkan ke dalam pellet dan

diresuspensi secara perlahan hingga homogen. Selanjutnya sel T47D
ditumbuhkan dalam tissue culture flask dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 oC dalam inkubator CO2 5%. Media diganti dan sel
ditumbuhkan kembali hingga jumlahnya cukup untuk perlakuan.
4) Pemanenan sel
Pemanenan sel dilakukan ketika jumlah sel 80% konfluen, media dibuang
menggunakan pipet Pasteur steril kemudian sel dicuci 2x dengan PBS 1x
(volume PBS ± ½ volume media awal). Larutan tripsin-EDTA 1x (tripsin
0,25%) ditambahkan secara merata dan diinkubasi selama 3 jam pada
inkubator. Tambahkan media ± 5 mL untuk menginaktifkan tripsin.
Suspensi dilakukan kembali pada sel dengan pipet sampai sel terlepas
satu-satu (tidak menggerombol). Selanjutnya diamati keadaan sel di
mikroskop, apabila terdapat sel yang menggerombol dilakukan resuspensi
kembali. Sel yang telah lepas satu-satu dipindahkan ke dalam conical
steril baru.
5) Uji Aktivitas Sitotoksik dengan Metode MTT
Suspensi sel T47D diambil sebanyak 100 µL dari media lengkap
kemudian dimasukkan ke dalam 96 well plate dan diinkubasi dalam
inkubator CO2 5% selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media pada
masing-masing sumuran dibuang, kemudian ditambahkan media baru dan
sampel 100 µL dalam tiap sumuran yang berbeda sehingga diperoleh
kadar akhir sampel dengan konsentrasi (500; 125; 62,5 µg/mL). Plate
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dalam inkubator CO2 5%. Pada
akhir inkubasi, medium pada masing-masing sumuran dibuang, dicuci
dengan PBS 1x sebanyak 100 µL, kemudian ditambahkan 100 µL MTT 5
mg/ mL dalam PBS. Plate kemudian diinkubasi lagi pada suhu 37oC
selama 4 jam.
Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliumbromid) membentuk formazan berwarna ungu.
Selanjutnya ditambahkan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 10% dalam
 12

HCl 0,01N untuk menghentikan reaksi pembentukan formazan, kemudian

plate diinkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi serapan dibaca
dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Persen
kehidupan sel dihitung melalu data absorbansi sel dan dibuat kurva
hubungan log konsentrasi vs nilai % sel hidup dan dihitung harga IC50
(Haryoto et al, 2013).
6. Analisis Data
Data yang diperoleh dari pengujian menggunakan metode MTT assay
berupa absorbansi yang selanjutnya dikonversi kedalam % sel hidup.
Apabila absorbansi kontrol pelarut sama dengan kontrol sel maka hitung
presentase kehidupan sel dengan rumus:
(Absorbansi perlakuan−Absorbansi kontrol media)
% sel hidup = (Absorbansi kontrol sel−Absorbansi kontrol media)
x 100%

Apabila absorbansi kontrol pelarut lebih rendah dari absorbansi kontrol

sel maka hitung presentase dengan rumus:
(Absorbansi perlakuan−Absorbansi kontrol media)
% sel hidup = (Absorbansi kontrol pelarut−absorbansi kontrol media) x 100%

Keterangan:
Perlakuan : ekstrak + media + sel
Kontrol media : media kultur
Kontrol sel : media + sel T47D
Kontrol pelarut : DMEM + media kultur + sel
Pengujian penghambatan sel T47D menggunakan kombinasi ekstrak
etanol rimpang temu kunci dengan doksorubisin yang didapatkan dari
perhitungan IC50 menggunakan regresi linear dengan sumbu x adalah log
konsentrasi kombinasi ekstrak etanol rimpang temu kunci dengan
doksorubisin dan sumbu y dalah persen sel hidup (Junedi et al, 2017).
Uji kombinasi dilakukan untuk mengetahui adanya sifat sinergis, additive
dan antagonis. Uji kombinasi di evaluasi menggunakan Combination
Index (CI) dengan rumus sebagai berikut:
(𝐷)1 (𝐷)2
CI = (𝐷𝑥)1
+ (𝐷𝑥)2

D1 = konsentrasi kedua senyawa (IC50 terhadap sel kanker)

 13

D2 = konsentrasi kedua senyawa (IC50 terhadap sel kanker)

(Dx) 1 = konsentrasi dari suatu senyawa tunggal (doksorubisin)
Dx)2 = konsentrasi dari suatu senyawa tunggal (rimpang temu kunci)
(Reynolds and Maurer, 2005)
I. JADWAL PELAKSANAAN

Tahapan Uraian Kegiatan Bulan ke-

Penelitian 1 2 3 4 5 6
Persiapan Obeservasi dan Studi  
Literatur
Preparasi Sampel  
Penelitian Pengumpulan Data  
Penyelesaian Analisis Hasil  
Penyusunan laporan 
 14

J. DAFTAR PUSTAKA
Anggriawan, R.P., 2016, Potensi Aktivitas Antikanker Kombinasi Fraksi Etil
Asetat Herba Sambiloto (Andrographispaniculata Ness.) Dengan
Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Hela, Sel kanker T47D dan Sel
Kanker WiDr Secara in Vitro, skripsi thesis, Universitas Erlangga.
Badan POM RI, 2011, Acuan Sediaan Herbal, Volume 6 Edisi I, Badan
Pengawas Obat dan Makanan, Jakarta.
Brunton, L.L., Jhon S.L., Keith, L., 2006, Goodman And Gilman’s The
Pharmacological Basis of Therapeutics, eleventh edition, McGraw-
Hill, USA.
Dipiro, J. T., Terry L., Wells, B.G., Cecily, 2015, Pharmacoteraphy
Handbook 9th Edition, The McGraw-Hill Companies, United States
of America.
Haryoto, Muhtadi, Peni Indrayudha, Tanti Azizah, Andi Suhendi, 2013,
Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Etanol Tumbuhan Sala
(CynometraramifloraLinn) Terhadap Sel HeLa, T47D, dan WiDr,
Jurnal Penelitian Saintek, 18 (2): 21-27.
Jenie, R.I., and Meiyanto, E., 2007, Ko-kemoterapi Ekstrak Etanolik Daun
Sambung Nyawa (Gynura procumbens (Lour.) Merr.) dan
Doxorubicin Pada Sel Kanker Payudara, Majalah Framasi
Indonesia, 18(2), 81-87.
Junedi S., Adam H., Muthi I., Meiyanto, E., 2017, Prosedur Tetap Uji
Sitotoksik Metode MTT, CCRC Fakultas Farmasi UGM, pp. 1-8.
Kementerian Kesehatan RI, 2015, Situasi Penyakit Kanker, Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Kirana, C., Jones, G.P., Record, I.R., and McIntosh, G.H., 2006, Anticancer
Properties of Panduratin A Isolated from Boesenbergia Pandurata
(Zingiberaceae), Journal of Natural Medicine, 61:131-137.
Muhammad S. A., Sidra N., Aftab A., Zaigham A., Iram G., Muhammad A.
A., 2014, Side Effects of Chemoteraphy in Cancer Patients and
Evaluation of Patients Opinion about Starvation Based Differential
Chemoteraphy, Journal of Cancer Teraphy, 5, 817-822.
National Breast And Ovarian Cancer Centre, 2009, Breast Cancer Risk
Factors: a review of the evidence, National Breast And Ovarian
Cancer Centre, Surry Hills, NSW.
Octavia, Y., Carlo, G.T., Kathleen, L., Stefan, J., Harry, J., An, L., 2012,
Doxorubicin Induced Cardiomyopathy: From Molecular
Mechanisms to The Therapeutic Strategies, Journal of Molecular
and Cellular Cardiology, 52, 1213-1225.
Reynold, C.P., and Maurer, B.J., 2005, Evaluating Response to
Antineoplastic Drug Combinations in Tissue Culture Models,
Methods in Molecular Medicine, 110, 173-183.
Rizki Awalia P., 2013, Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol, Fraksi Polar,
Semipolar, dan Nonpolar Herba Kemangi (Ocimum sanctum L.)
Terhadap Sel T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas
Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.
 15

Roche, 2017, Breast Cancer: A guide for journalist on breast cancer and its
treatment, Roche, 3-4.
Sarmoko, Ratri ID, Febriansah R, Romadhon AF, Nugroho APA, Meiyanto
E, Susidarti RA, and Sudarmanto BSA. Cytotoxic Effect of Ethanolic
Extract of Temu Kunci (Kaempferia pandurata L.) and Sirihan
(Piper aduncum L.) on Breast Cancer Line. Proceeding of Molecular
Targeted Therapy Symposium, 2008
Sharma, G., Tyagi, A.K., Singh, R.P., Chan, D.C.F., and Agarwal, R., 2004,
Synergistic anti-Cancer Effect of Grape Seed Extract and
Conventional Cytotoxic Agent Doxorubicin Against Human Breast
Carcinoma Cells, Breast Cancer Research and Treatment, 85: 1-12.
Sohn, J.H., Han, K.L., Lee, S.H., and Hwang, J.K., 2005, Protective Effects
of Panduratin Against Oxidative Damage of tert-Butylhydroperoxide
in Human HepG2 Cells, Biological and Pharmaceutical Bulletin,
28(6):1083-1086.
Sweetman, S.C., 2009, Martindale 36 The Complete drug Reference,
Pharmaceutical Press, London.
Trankoontivakorn, G., Nakahara, K., Shinmoto, H., Takenaka, M.,
Kameyama, M.O., Ono, H., Yoshida, H.M., Nagata, T., and
Tsushida, T., 2001. Structural Analysis of a Novel Antimutagenic
Activity of Flavonoids in Thai Spice, Fingerroot (Boesenbergia
pandurata Schult.) Against Mutagenic Heterocyclic Amines, J.
Agric. Food. Chem, 49(6):3046-3050.
Wattanipitayakul, S.K., Chularojmontri,L., Herunsalee, A.,
Charuchongkolwongse, S., Niumsakul, S., and Bauer, J.A., 2005,
Screening of Antioxidants from Medicinal Pants for Cardioprotective
Effect Againts Doxorubicin Toxicity, Basic and Clinical
Pharmacology and Toxicology, vol.96, 80.
Youlden, D. R., Susanna, Cheng Har, Peter D., 2014, Incidence and Mortality
of Female Breast Cancer In The Asia-Pacific Region, 11 (2), 101-
115.
Yun, J.M., Kweon, M.H., Kwon, H.J., Hwang, J.K., and Mukhtar, H., 2006,
Induction of Apoptosis and Cell Cycle Arrest by a Chalcone
Panduratin A Isolated from Kaempferia pandurata in Androgen-
Independent Human Prostate Cancer Cells PC3 and
DU145, Carcinogenesis Advance Access, 27(7):1454-1464.
 16

K. LAMPIRAN

Tabel 1. Absorbansi kontrol sel dan kontrol media

Absorbansi Rata-rata Absorbansi Rata-rata Absorbansi
kontrol sel absorbansi kontrol media absorbansi kontrol sel
kontrol sel kontrol media dikurangi
kontrol media

Tabel 2. Kombinasi Ekstrak etanol rimpang temu kunci dengan doksorubisin

Kadar Absorbansi* % sel hidup % sel hidup SD
(µg/ mL) rata-rata

* data diperoleh dari replikasi sebanyak 3x masing-masing kadar

Tabel 3. Nilai CI dari kombinasi ekstrak dengan doksorubisin pada sel T47D
Konsentrasi Doksorubisin (µg/mL)
(µg/mL) 31,25 62,5 250
Ekstrak etanol rimpang temu 500
kunci 300
200
200
17
18
19