Biotransformasi adalah istilah yang digunakan untuk menunjukkan konversi

oleh tubuh dari kimia asing untuk bahan kimia yang berbeda secara struktural.
Senyawa baru disebut metabolit. Biotransformasi pada sebuah obat atau biasanya
racun, tetapi tidak selalu, menghasilkan pembentukan zat aktif secara fisiologis
yang lebih siap dikeluarkan dari tubuh daripada senyawa induk. Gambar 8.3
menyajikan biotransformasi kokain. Metabolit dapat terjadi secara fisiologis aktif
atau tidak aktif dan tidak beracun, kurang beracun, atau lebih beracun daripada
senyawa induk. Kokain mencontohkan proses ini sebagai norcocaine secara
fisiologis aktif, sementara benzoylecgonine dan methylecgonine tidak memiliki
tindakan fisiologis (Gambar 8.3). Dengan demikian, ahli toksikologi harus
memiliki pemahaman tentang reaksi biotransformasi. Dalam beberapa kasus,
metabolit adalah satu-satunya bukti bahwa obat atau racun yang telah diberikan.
Bukti penggunaan heroin atau kokain ditunjukkan oleh kehadiran metabolitnya
masing-masing, morfin dan benzoylecgonine.
Ahli toksikologi harus menyadari perubahan kimia normal yang terjadi selama
penguraian tubuh. Analisis otopsi atau toksikologi harus dimulai sesegera
mungkin setelah kematian, karena proses dekomposisi alami dapat
menghancurkan racun yang pada awalnya hadir pada saat kematian atau mungkin
menghasilkan zat atau senyawa dengan sifat kimia atau fisik yang mirip dengan
racun yang biasa ditemukan. Sebagai contoh, selama dekomposisi, fenilalanin,
asam amino yang biasanya ada di dalam tubuh, diubah menjadi phenylethylamine,
yang memiliki sifat kimia dan fisik yang sangat mirip dengan amfetamin.
Kandungan etil alkohol dan sianida dalam darah dapat menurun atau meningkat
tergantung pada tingkat pembusukan dan aktivitas mikroba. Namun, banyak
racun, seperti arsenik, barbiturat, merkuri, dan strychnine, masih dapat terdeteksi
bertahun-tahun setelah kematian.
Dalam penyelidikan keracunan, pertama-tama perlu bagi ahli toksikologi untuk
mengisolasi dan mengidentifikasi racun. Oleh karena itu, kelompok racun
toksikologi forensik sesuai dengan metode yang digunakan untuk mengisolasi zat
dari jaringan tubuh atau cairan.

Kelompok I: Gas
Sebagian besar gas toksikologi tidak terdeteksi dalam spesimen otopsi. Namun,
beberapa mungkin diisolasi dari jaringan darah atau paru-paru melalui proses
aerasi. Biasanya, sampel udara dikumpulkan di tempat paparan.

Kelompok II: Steam Volatile Poisons

Senyawa dalam kelompok ini diisolasi oleh steam distillation. Sampel (darah,
urin, atau homogenat jaringan) dibuat asam dengan asam klorida atau basa dengan
magnesium oksida padat. Aliran uap dilewatkan melalui sampel dan racun yang
mudah menguap disuling dalam aqueous distillate. Racun yang dapat distilasi dari
medium asam meliputi karbon tetraklorida, kloroform, sianida, etanol, metanol,
fenol, nitrobenzen, dan fosfor kuning. Racun yang bisa didistilasi dari medium
dasar termasuk amfetamin, anilin, meperidin, metadon, dan nikotin.

Kelompok III: Metallic Poisons

Logam diisolasi dari jaringan dengan menghancurkan semua bahan organik yang
terdiri dari jaringan. Jaringan dapat dihancurkan oleh panas yang berlebihan (dry
ashing) atau dengan dididihkan dengan asam pekat atau oksidator kuat (wet
ashing). Berbagai metode dapat digunakan untuk mengidentifikasi racun logam
spesifik yang tersisa di abu.

Kelompok IV: Nonvolatile Organic Poisons

Grup ini berisi sebagian besar obat yang menarik bagi ahli toksikologi di AS.
Senyawa dalam kelompok ini biasanya hadir dalam jaringan hanya dalam
beberapa menit. Beberapa obat (misalnya, barbiturat) dapat langsung diekstrak
dari jaringan homogenat oleh pelarut organik. Namun, banyak senyawa sering
terpisah dari sebagian besar matriks jaringan dengan membentuk filtrasi jaringan
bebas protein. Filtrat ini kemudian mengalami ekstraksi selektif dengan pelarut
organik dalam berbagai kondisi keasaman. Dengan menggunakan teknik-teknik
seperti itu, obat-obatan diisolasi ke dalam lima subkelompok.
1. Asam kuat (misalnya, chlorothiazide, salisilat)
2. Asam lemah (misalnya, acetaminophen, barbiturat)
3. Netral (misalnya, meprobamate, methaprylon)
4. Basa (misalnya, kodein, phenothiazines, quinine, strychnine)
5. Amfoterika ( misalnya, hydromorphone, morfin)
Kelompok V: Miscellaneous Poisons
Kelompok ini mencakup semua racun yang tidak diklasifikasikan dalam empat
kelompok sebelumnya. Zat yang termasuk dalam kelompok ini adalah anion
anorganik (misalnya, bromin), ion organik yang larut dalam air (misalnya curare,
fluororoasetat, paraquat), dan senyawa organik yang tidak larut dalam air atau
alkohol. Umumnya, harus digunakan teknik khusus untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi senyawa-senyawa ini dari sampel-sampel biologis.
Dalam melakukan analisis, ahli toksikologi telah menyediakan semua teknik
kimia analitik modern. Jika racun yang menyebabkan kematian diketahui, analisis
spesifik dapat dilakukan; namun, jika agen tersebut tidak diketahui, atau lebih dari
satu racun diduga, ahli toksikologi harus terlebih dahulu melakukan serangkaian
analisis untuk menentukan toksisitas mana yang ada dan kemudian menentukan
dengan analisis kuantitatif jumlah setiap zat beracun yang ada dalam berbagai
spesimen. Sementara banyak metode kimia tersedia untuk ahli toksikologi, hanya
beberapa prosedur yang lebih umum yang dibahas. Semua metode ini dapat
diterapkan pada analisis kualitatif (identifikasi) dan kuantitatif (konsentrasi).

Color Test
Tes warna adalah prosedur kimia di mana zat yang diuji ditindaklanjuti oleh
reagen yang menyebabkan perubahan dalam reagen, sehingga menghasilkan
warna atau perubahan warna yang dapat diamati. Tes warna dapat digunakan
untuk menentukan keberadaan senyawa spesifik atau senyawa umum.
Prosedurnya biasanya cepat dan mudah dilakukan. Utilitas terbesar dari tes warna
dalam toksikologi adalah skrining cepat spesimen urin, karena urin dapat
dianalisis secara langsung tanpa prosedur ekstraksi yang memakan waktu. Contoh
uji warna adalah "Tes Trinder" untuk mendeteksi salisilat dalam darah atau urin.
Reagen besi nitrat dan merkuri klorida dicampur dengan 1 ml darah atau urin; jika
ada salisilat, terlihat warna ungu. Seperti dalam semua pengujian toksikologi
lainnya, keberadaan salisilat harus dikonfirmasi dengan metode analisis lain. Tes
Trinder positif diamati untuk asam salisilat (metabolit aspirin), salisilamida, dan
metil salisilat. Positif palsu, yaitu terjadi perubahan warna ketika tidak ada
salisilat, hal ini dapat diamati dalam urin pasien diabetes yang mengekskresikan
asam acetoacetic dan pada pasien yang menerima obat fenotiazin dosis tinggi.
Ahli toksikologi harus sadar akan keterbatasan tes yang dilakukannya dan
khususnya sumber reaksi positif palsu.
Microdiffusion Test
Analisis mikrodifusi digunakan untuk isolasi dan deteksi cepat dari racun yang
mudah menguap. Aparatus microdiffusion sederhana terdiri dari piringan porselen
kecil dengan dua kompartemen terpisah, sebuah sumur dalam yang dikelilingi
oleh sumur luar yang terbentuk antara pinggiran dinding kompartemen bagian
dalam dan dinding luar yang lebih tinggi dari piringan tersebut. Sumur luar adalah
sel sampel, dalam jumlah kecil, 1 hingga 5 ml, darah, urin, atau homogenat
jaringan ditambahkan. Ke bagian dalam sumur "penyerap". Penyerap adalah
reagen atau pelarut di mana zat-zat volatil tertentu akan mudah larut. Setelah
sampel dan penyerap ditambahkan ke sel yang tepat, piringan disegel dengan
bahan sealer kental dan pelat penutup kaca tanah. Jika dibiarkan pada suhu kamar
atau dipanaskan dengan hati-hati, racun yang mudah menguap akan menyebar dari
sampel ke atmosfer piringan dan terperangkap oleh larutan penyerap, yang sering
merupakan pereaksi warna. Ketika racun dibebaskan dari sampel, ahli toksikologi
dapat mengamati pembentukan warna atau perubahan warna dalam absorben di
sumur dalam. Banyak racun dan gas yang mudah menguap dapat dideteksi dengan
teknik mikrodiffusion; misalnya acetaldehyde, karbon monoksida, sianida, etanol,
fluoride, hidrokarbon terhalogenasi, dan metanol.

Chromatography
Kromatografi adalah teknik pemisahan. Komponen dari campuran sampel
didistribusikan antara dua fase, salah satunya adalah diam sementara yang kedua,
fase gerak, meresap melalui matriks atau di atas permukaan fase yang tetap.
Komponen dari campuran sampel menunjukkan berbagai tingkat afinitas untuk
setiap fase, dan ketika mereka dibawa oleh fase gerak, terjadi migrasi diferensial.
Beberapa komponen dipertahankan pada fase diam lebih lama dari yang lain,
menghasilkan pemisahan senyawa. Retensi komponen oleh fase diam tergantung
pada beberapa faktor, termasuk sifat kimia dan fisik dari fase diam dan fase gerak,
serta kondisi eksperimental, seperti suhu atau tekanan. Oleh karena itu, penting
bahwa standar acuan murni dikromatografi di bawah kondisi yang sama dengan
bahan yang tidak diketahui. Senyawa secara tentatif diidentifikasi dengan
membandingkan retensi mereka pada fase diam dengan standar referensi. Setelah
kromatografi, identitas senyawa harus dibuktikan dengan metode analisis lainnya.
Ada banyak jenis analisis kromatografi; Namun, hanya tiga yang paling sering
diterapkan oleh ahli toksikologi akan dibahas secara singkat. Ini adalah
kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi cair gas (GLC), dan kromatografi
cair kinerja tinggi (HPLC).
Thin-Layer Chromatography. Dalam TLC, fase diam adalah "lapisan tipis" dari
penyerap, biasanya silika gel, yang tersebar pada penyokong yang solid, seperti
piring kaca. Ekstrak sampel terkonsentrasi dan standar obat diterapkan sebagai
serangkaian bintik di sepanjang bagian bawah piring dan dibiarkan kering. Piring
tersebut kemudian ditempatkan dalam tangki tertutup, di mana lapisan penyerap
membuat kontak dengan "mengembangkan pelarut" (fase gerak) di bawah tempat
yang diterapkan. Pelarut bergerak ke atas piring dengan aksi kapiler, melarutkan
dan memisahkan komponen-komponen ekstrak. Ketika pelarut telah mencapai
bagian atas piring atau naik ke jarak yang telah ditentukan sebelumnya, pelat
dikeluarkan dari tangki dan pelarut menguap dari pelat. Masing-masing obat
dalam campuran standar dan dalam ekstrak akan terpisah selama migrasi,
menghasilkan serangkaian bintik atau pita sempit yang membentang dari bawah
ke atas atau bagian depan pelarut di piring. Migrasi senyawa dinyatakan oleh
faktor retensi (Rf) yang didefinisikan sebagai rasio jarak yang dipindahkan oleh
senyawa ke jarak fase gerak naik ke pelat dari titik penerapan senyawa. Kehadiran
obat divisualisasikan dengan menyemprot atau mencelupkan ke piring berbagai
reagen yang menghasilkan reaksi berwarna dengan komponen tertentu. Beberapa
semprotan dapat digunakan secara berurutan untuk membantu identifikasi
senyawa. Beberapa obat akan bereaksi dengan reagen tertentu tetapi tidak dengan
yang lain. Misalnya, dalam pemeriksaan ekstrak urin untuk mengetahui adanya
penyalahgunaan obat, ahli toksikologi mungkin pertama-tama menyemprotkan
kromatogram dengan ninhidrin, yang menghasilkan warna merah atau merah
muda dengan amina primer seperti amfetamin atau efedrin. Selanjutnya, ia dapat
mengaplikasikan etanol dalam asam sulfat, yang menghasilkan serangkaian
bintik-bintik merah jambu, oranye, biru, atau hijau yang berwarna cerah dengan
penenang fenotiazin dan metabolitnya. Piring kemudian disemprot dengan
iodoplatinat, yang bereaksi dengan semua basa nitrogen. Ada banyak reagen
semprot TLC untuk dipilih, tetapi ahli toksikologi harus melihat sifat kimia dari
senyawa yang diinginkan untuk diidentifikasi. Jika suatu senyawa dari ekstrak
memigrasi jarak yang sama dan bereaksi terhadap semprotan yang diterapkan
dengan cara yang sama seperti obat referensi, ahli toksikologi kemudian memiliki
identifikasi tentatif dari senyawa tersebut, yang harus dikonfirmasi oleh uji kimia
lain; Namun, ia telah mengesampingkan semua senyawa yang tidak bermigrasi
jarak yang diamati dalam sistem pelarut TLC ini dan tidak bereaksi dengan cara
yang sama dengan reagen semprot. Tabel 8.3 menyajikan Rfs dan reaksi dengan
reagen visualisasi beberapa obat yang biasa dicari dalam skrining toksikologi.

Gas Liquid Chromatography. Dalam GLC, fase gerak adalah gas pembawa inert
(misalnya, helium, nitrogen) yang mengalir melalui kolom yang dikemas dengan
fasa diam dengan sebuah penyokong solid yang dilapisi cairan (packed column)
atau lebih dari fase stasioner melapisi dinding kolom sempit (capillary column).
Banyak jenis bahan cair tersedia, dan ahli toksikologi bervariasi pada fase
stasioner tergantung pada sifat senyawa atau kelompok senyawa yang ingin ia
pisahkan dan identifikasi. Contoh yang diekstraksi adalah