SINTESIS BIOLOGIS KUMARIN DALAM ESCHERICHIA COLI

Latar Belakang

Tumbuhan mensintesis banyak jenis senyawa fenolik. Tergantung pada kerangka karbonnya,
senyawa fenolik ini dapat dibagi menjadi empat kelompok [1]. Kelompok pertama didasarkan pada asam
fenolik, yang karbon skeletonis C6-C1, dan termasuk asam galat, asam salisilat, dan asam ben-zoat.
Kelompok kedua adalah asam hidroksisinamat (HCs, C6-C3), yang termasuk asamep-coumaric,
caffeicacid, dan coumarin. Kelompok ketiga, stilbenes, memiliki kerangka aC6-C2-C6, dan termasuk
resveratrol, piceatannol, dan pallidol. Kelompok terakhir termasuk flavonoid, yang memiliki kerangka C6-
C3-C6, dan termasuk quer-cetin, genistein, dan apigenin. Fenolik tanaman ini semuanya disintesis dari
asam sinamat yang berasal dari fenilalanin melalui aksi fenilalaninammonia lyase (PAL). Malonyl-CoA
memasok carbonto cinnamonyl-CoA untuk membuat stilbena dan theflavonoid [2], sementara β-oksidasi
asam sinamat mengarah ke pembentukan asam fenolat [3].

Koumarin mengandung tulang punggung 1,2-benzopyrone dan dikelompokkan menjadi empat

kelompok; coumarin sederhana, fu-ranocoumarin, pyranocoumarin, dan couma-rins yang diprenilasi.
Kumarin sederhana termasuk scopoletin, umbelliferone, esculetin, dan lainnya [4]. Koarin adalah
metabolit sekunder tanaman yang diproduksi baik sebagai senyawa pertahanan melawan patogen [5,6]
atau chelator besi dalam minyak [7]. Aktivitas biologis kumarin dan turunannya termasuk antibakteri,
antivirus, antijamur, antiinflamasi, antikanker, antikoagulan, dan aktivitas anti hipertensi [8]. Semakin
banyak dampak coumarinson yang muncul pada manusia, coumarin alami berfungsi sebagai tulang
punggung untuk sintesis berbagai turunan kumarin baru yang berpotensi bermanfaat [8,9].

Jalur biosintesis dari asam cinnamic ke cou-marin pertama kali dijelaskan di Arabidopsis thaliana
[10]. Hidroksilasi pada 6-karbon cinnamoyl-CoAby dioksigenase yang bergantung pada 2-oxoglutarate-
dependen (feruloylCoA 6′-hydroxylase [F6′H] , juga dikenal asp-coumaryolCoA 2′-hydroxylase [C2′H])
adalah langkah kunci untuk biosintesis thumumarin [11]. Dalam ubi jalar (Ipomoea batatas), gen
homolog toF6′HfromA. thaliana (IbF6′H1andIbF6′H2) telah dikloning dan dikarakterisasi [12]. Studi ini
membuka kemungkinan bahwa tiga coumarin (umbelli-ferone, esculetin, dan scopoletin) disintesis dari
asam koomparat, asam caffeic, dan asam ferulic, dengan respek, dengan kombinasi asam p-cinnamic:
CoA ligase (4CL) dan F6 ′ H [10,12] (Gambar 1)

Model mikroorganisme telah digunakan untuk mensintesis senyawa fenolik tanaman. Asam
hidroksikinamat, flavonoid, dan stilbene telah berhasil disintesis dalam Escherichia coli [13-15].
Coumarin dapat disintesis dari fenilalanin atau tirosin menggunakan tiga enzim, fenilalanin (atau tirosin)
amonia amonia (PALOR TAL), asam 4-sinamat: koenzim ligase A (4CL), dan F6H Fenilalanin dan tirosin
masing-masing dapat dikonversi menjadi asam intocinnamic dan asam p-coumaric oleh PAL dan TAL
[16,17]. Asam caffeic disintesis dari asam p-coumaric oleh hidroksilasi menggunakan 4-hydroxyphe-
nylacetate 3-hydroxylase (HpaBC) dari E. coli [18] atau monooksigenase yang disebut Sam5 dari
Saccharothrixespanaensis [19]. Metilasi O selanjutnya dari asam caffeic menghasilkan asam ferulic [20].
Lampiran dari koenzim A untuk setiap HC dan siklisasi spontan 6′-hydroxycinnamoyl-CoA di E. coli
menghasilkan pembentukan kumarin. Kumarin sederhana dan turunannya telah disintesis dari asam
hidroksisinamat atau glukosa [21-23]. Penelitian ini menggunakan F6′H dari A. thaliana dan I. batatas dan
4CL dari A.thaliana untuk menghasilkan umbelliferone dan scopoletin dari p-coumaric acid dan ferulic
acid, masing-masing, Inaddition, dengan menggunakan TAL, HapBC, dan CCoAOMT (caffeoyl CoAO-
methyltransferase ) bersama dengan F6′H dan 4CL, Lin et al. [21] juga mensintesis umbelliferone dan
scopoletin. Tetapi, hasil akhir dari kumarin yang disinonimkan dengan metode ini rendah. Hambatan
untuk sintesis kumarin mungkin adalah konversi hydroxycinnamoyl-CoA menjadi 6′-hydroxy cinnamoyl-
CoA. Dalam tulisan ini, kami mengatasi blok ini dengan meningkatkan kelarutan F6′H, sehingga
meningkatkan hasil kumarin. Kami melaporkan di sini biosintesis kumarin dari asam hidroksisinamat dan
glukosa.

Hasil

Produksi kumarin dari asam hidroksisinamat dalam E. coli Kumarin disintesis dari asam
hidroksisinamat dengan produk dari dua gen, 4CL dan F6′H. Gen-gen dari Oryza sativa (Os4CL) dan I.
batatas (IbF6′H2) dikloning dan ditransformasikan menjadi E. coli. Transforman E. coli (B-CM1 pada Tabel
1) diberi makan dengan asam ferulic. Produk reaksi dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2C, filtrat kultur dari B-CM1 menunjukkan puncak
baru yang memiliki waktu retensi yang sama dengan standar scopoletin. Massa molekul produk reaksi
adalah 192-Da (g / mol) (Gambar 2D), yang sesuai dengan massa molekul scopoletin yang diprediksi. B-
CM1 menghasilkan scopoletin 3.5mg / L.

F6′H adalah dioksigenase. Dioksigenase kadang-kadang diekspresikan dengan buruk pada E. coli
karena kelarutannya rendah. Oleh karena itu, kami menggabungkan F6′Hs ke glutathione S-transferase
(GST) untuk meningkatkan kelarutan dan stabilitas. Protein fusi GST telah terbukti menunjukkan
peningkatan kelarutan dan stabilitas dibandingkan dengan protein fusi tag-nya [24]. Selain itu, kami
membuat konstruksi tipe operon dan pseudo operon dengan 4CL dan F6′H. Konstruk tipe operon
memiliki satu promotor T7 yang mengontrol ekspresi 4CL dan F6′H. Di sisi lain, masing-masing gen
dikontrol oleh promotor T7 yang tidak tergantung pada konstruk tipe operon semu. Oleh karena itu,
kami menghasilkan empat konstruksi dan mengujinya untuk produksi skopoletin dari asam ferulic (B-
CM1 ke B-CM4). Dalam dua konstruksi, pG-pIbF6′H2-pOs4CL dan pG-pIbF6′H2-Os4CL (Tabel 1), IbF6′H2
digabungkan dengan GST. Genogen, IbF6′H2andOs4CL, dikendalikan oleh salah satu dari dua promotor di
pG-pIbF6H2 -pOs4CL andpE-pIbF6′H2-pOs4CL (tipe pseudo-operon) atau satu promotor dalam pG-
pIbF6′H2-Os4CL dan pE-pIbF6′H2-Os4CL (tipe operon). Dalam kasus di mana satu promotor
mengendalikan dua gen, situs pengikatan ribosom (RBS) dipasang di depan masing-masing gen. Selain
itu, IbF6′H terletak sebelum Os4CL ketika kedua gen dikendalikan oleh satu promotor. Orientasi ini
mengakumulasikan intermediet reaksi yang lebih sedikit [25]. Setiap konstruk ditransformasikan menjadi
E. coli BL21 (DE3) dan strain yang dihasilkan diuji untuk kemampuan menghasilkan scopoletin. Strain
yang mengandung IbF6′H2 digabungkan dengan GST menunjukkan produksi skopoletin lebih banyak
daripada strain yang hanya menampung IbF6′H2. B-CM3 dan B-CM4, keduanya mengandung protein fusi
GST-IbF6′H2, masing-masing menghasilkan sekitar 34,6 dan 59,7 mg / L scopoletin, dimana B-CM1 dan B-
CM2 menghasilkan 3,5 dan 8,1 mg / L , masing-masing (Gambar 3). Ini menunjukkan bahwa fusi GST
menghasilkan hasil yang lebih tinggi dari sco-poletin, mungkin karena peningkatan kelarutan dan
stabilitas IbF6′H2.Oleh karena itu, kami memutuskan untuk menggunakan konstruksi tipe operon yang
menyatu dengan GST (pG-pIbF6′H2- Os4CL).
 Menggunakan strain B-CM4, efek medium pada produksi skopoletin diperiksa. Setelah induksi
protein, sel-sel diresuspensi dalam LB, M9, atau YM9 (M9 yang mengandung 1% ekstrak ragi), dan
diinkubasi dengan asam ferulic. Sel yang tumbuh dalam LB mengakumulasi lebih banyak scopoletin
daripada media lainnya (59,2 mg / L scopoletin vs.13.1 mg / L pada YM9 dan 4,3 mg / L dalam M9).

Kami juga menghasilkan gen fusi GST-IbF6′H1, yang disubklonkan dengan Os4CL dalam
konfigurasi tipe operon (pG-pIbF6′H1-Os4CL) .E. colistrains B-CM4, yang mengandung pG-pIbF6′H2-
Os4CL, dan B-CM5, yang mengandung pG-pIbF6′H1-Os4CL, diuji untuk produksi umbelliferone, esculetin,
dan skopoletin dari asam p-coumaric, asam caffeic, dan asam ferulic, masing-masing. Kedua F6′Hs
diharapkan menunjukkan kekhususan substrat yang berbeda. Semua strain E. coli dikonversi asam p-
coumaric, asam caffeic, dan asam ferulic menjadi umbelliferone, esculetin, dan scopoletin. Struktur
produk dikonfirmasi menggunakan spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) (lihat Bahan dan
metode). Namun, hasilnya berbeda tergantung pada jenis E. coli yang digunakan dan substrat. B-CM4
menghasilkan sekitar 38,2 mg / L umbelliferone, tetapi B-CM5 menghasilkan 29,0 mg / L. Scopoletin juga
diproduksi dengan jumlah yang lebih tinggi dalam B-CM4 (sekitar 59,4 mg / L) daripada di B-CM5 (33,6
mg / L). Di sisi lain, lebih banyak esculetin diproduksi di B-CM5 (sekitar 25,2 mg / L) daripada di B-CM4
(16,0 mg / L) (Gambar 4). IbF6′H2 lebih unggul untuk produksi umbelliferone dan scopoletin, sedangkan
IbF6′H1 lebih unggul untuk produksi esculetin.

Optimalisasi produksi umbelliferone, scopoletin, dan esculetin

Konsentrasi awal substrat yang optimal (asam p-coumaric, asam caffeic, dan asam ferulic)
diperiksa untuk produksi umbelliferone, scopoletin, dan esculetin, masing-masing. B-CM4 digunakan
untuk produksi umbelliferone dan scopoletin, sedangkan B-CM5 digunakan untuk produksi esculetin.
Sekitar 90% asam p-coumaric dikonversi menjadi umbelliferone pada 0,3, 0,4, 0,5 mMp-coumaric acid.
Produksi umbelliferone terus meningkat hingga 0,7 mM asam p-coumaric, setelah itu hasilnya tidak
meningkat sangat jauh, dan asam p-coumaric menumpuk.

Oleh karena itu, 0,7 mM asam p-coumaric dipilih sebagai konsentrasi substrat awal. Selanjutnya,
kami menentukan kepadatan sel optimal pada 0,7 mM asam p-coumaric. Produksi umbelliferone terus
meningkat hingga OD600 = 5, setelah itu hasilnya menurun. B-CM4 pada kepadatan sel pada OD600 = 5,
menghasilkan sekitar 0,51 mM (82,9 mg / L) umbelliferone dari 0,7 mM (114,9 mg / L) asam p-coumaric
untuk hasil konversi sekitar 73%. Menggunakan pendekatan yang sama , konsentrasi substrat awal yang
optimal dan kepadatan sel ditentukan untuk produksi skopoletin dari asam ferulic dan produksi esculetin
dari asam caffeic. Konsentrasi substrat dan kepadatan sel yang optimal untuk scopoletin dan esculetin
masing-masing adalah 0,7 mM pada OD600 = 5. Dalam kondisi ini, sekitar 79,5 mg / L scopoletin (0,41
mM; konversi 59%) dan 52,3 mg / L (0,29 mM; konversi 41%) dari esculetin diproduksi setelah reaksi 12
jam.

Sintesis umbelliferone dan esculetin dari glukosa

Umbelliferone dan esculetin masing-masing disintesis dari asam p-coumaric, dan asam caffeic. P-
Coumaricacid disintesis dari tirosin melalui aksi tyrosineammonia lyase (TAL). Selanjutnya, 3′-hidroksilasi
asam p-coumaric mengarah ke sintesis asam caffeic. Oleh karena itu, untuk sintesis umbelliferone, gen
tambahan, TAL diperlukan, yang sebelumnya dikloning di lab kami [26] .E. coli BL21 (DE3)
ditransformasikan dengan gen TAL bersama dengan pG-pIbF6′H2-Os4CL. Strain yang dihasilkan, B-CM6,
digunakan untuk mensintesis umbelliferone. Analisis filtrat kultur oleh HPLC menunjukkan puncak
(puncak 3 pada Gambar 5B) yang memiliki waktu retensi yang sama dengan umbelliferone standar.
Massa molekul dari produk reaksi ini adalah 162 Da (g / mol), yang merupakan massa molekul
umbelliferone yang diprediksi (data tidak diperlihatkan). Oleh karena itu, umbelliferone berhasil
disintesis oleh strain B-CM6.