Anda di halaman 1dari 16

21

BAB III

BAHAN DAN CARA KERJA

A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium

Genetika, Departemen Biologi, FMIPA-UI, Depok. Lama penelitian dari awal

pengambilan data hingga pembuatan skripsi sekitar dua belas bulan

(September 2006--September 2007). Skema kerja penelitian dapat dilihat

pada Lampiran 1.

B. BAHAN

1. Mikroorganisme

Mikroorganisme yang digunakan adalah 12 isolat khamir koleksi

University of Indonesia Culture Collection (UICC), Departemen Biologi FMIPA

UI. Empat isolat berasal dari perairan mangrove Cagar Alam Pulau Rambut,

yaitu: W1114, W1126, W127, dan W144, sedangkan delapan isolat lainnya

berasal dari perairan laut di sekitar Cagar Alam Pulau Rambut, yaitu: W314

(white), W322, W324, W325, W3324, W3329, W3338 (yellow) dan W3351.

2. Medium

Medium yang digunakan untuk pembuatan working culture adalah

Yeast Malt Agar (YMA). Medium yang digunakan untuk pemeliharaan stock

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


22

culture adalah Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%.

Medium padat yang digunakan untuk pengamatan fenotipik adalah Malt

Extract Agar (MEA) 5% dan Yeast Malt Agar (YMA), sedangkan medium cair

yang digunakan adalah Yeast Malt Broth (YMB) dan Malt Extract Broth (MEB)

5%. Pengamatan miselium dengan metode slide culture menggunakan

medium Corn Meal Agar (CMA).

3. Bahan kimia

Bahan kimia produk dari Difco adalah yeast extract, malt extract,

pepton, PDA, CMA dan Bacto agar. Bahan kimia produk dari Merck adalah

D-glukosa, etanol, dan isopropanol. Bahan kimia produk dari Promega

adalah agarosa, DNA ladder, etidium bromida, loading dye (6 X Load Dye

Blue/Orange), Go Taq Green Master Mix [Promega], pure taq ready-to-go

PCR beads [GE Healthcare], mineral oil , nuclease free water, (Tris-asetat

dan EDTA) TAE buffer 10 X, dan kit isolasi DNA (Wizard Genomic DNA

Purification Kit). Bahan kimia produk dari Sigma adalah proteinase, primer

ITS 5 (10 pmol/µl), primer ITS 4 (10 pmol/µl). Bahan kimia lainnya yang

digunakan adalah akuades, akuabides [IKA], alkohol teknis, zymolyase 20 T

[Seigaku America], spiritus teknis, tetrasiklin 500 mg/l [Phapros], dan minyak

imersi [Euromax Holland].

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


23

C. PERALATAN

Mikro pipet P10 dan P1000 [GILSON], mikro pipet P100 dan P200

[Eppendorf Research], alat sentrifugasi [Eppendorf 5415 C], cycle sequencer

[TaKaRa™ Gradient PCR], gel documentation system [BIO-RAD], PCR

thermal cycler [PERKIN ELMER 9600], inkubator [Heraeus], kamera digital

Sony DSC-W30, lemari es [Bauknecht], autoklaf [Hirayama HL-36 AE],

microwave [Hitachi], mikroskop [Euromex HOLLAND], mesin sequencer

[Applied Biosystem 3130XL], mesin sequencer [Applied Biosystem 3100],

spektrofotometer [OPTIMA SP-3000 Plus], alat elektroforesis [Advance],

timbangan digital [AND EW-300 G], sonikator [Sakura US-10 E], vortex

[Scientific Industries], jarum tanam bulat (ose) dan pembakar spiritus.

Peralatan habis pakai yang digunakan adalah tabung PCR [Axygen], tabung

Eppendorf 1,5 ml [Eppendorf], pipet tips 200--1.000 µl [BIO-RAD], lembar

parafilm, wrapping plastic [Klin Pak],dan sarung tangan [Sensi gloves]. Alat

lainnya adalah alat-alat gelas yang umumnya digunakan di laboratorium

mikrobiologi.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


24

C. CARA KERJA

1. Pembuatan medium dan larutan

a. Malt Extract Agar (MEA) 5%

Medium Malt Extract Agar (MEA) 5% dibuat berdasarkan Yarrow

(1998: 87). Sebanyak 20 g agar dan 50 g malt extract dimasukkan ke dalam

labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades hingga 1.000 ml. Larutan

dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut

sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C

dan tekanan 2 atm selama 15 menit. Medium yang sudah disterilkan

ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu medium ± 45° C

kemudian dituang ke cawan Petri masing-masing sebanyak 15--20 ml.

b. Malt Extract Broth (MEB) 5%

Medium Malt Extract Broth (MEB) 5% dibuat berdasarkan Yarrow

(1998: 87). Sebanyak 50 g malt extract dimasukkan ke dalam labu

Erlenmeyer kemudian ditambahi akuades hingga volume 1.000 ml. Larutan

dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut

sempurna. Medium yang sudah homogen kemudian dimasukkan ke

sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan

menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C dan tekanan 2 atm selama 15

menit.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


25

c. Corn Meal Agar (CMA)

Pembuatan medium CMA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak

12,5 g bubuk CMA dan 3,8 g agar ditambahi akuades hingga volume

mencapai 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga

mendidih dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung

reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Medium kemudian disterilkan

menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15

menit.

d. Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%

Pembuatan medium PDA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak

39 g bubuk Potato Dextrose Agar (PDA) dan 15 g NaCl ditambahi akuades

hingga mencapai volume 1.000 ml kemudian dipanaskan hingga mendidih

dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung reaksi masing-

masing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan

suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Medium yang sudah

disterilkan kemudian diletakkan pada bidang miring ± 45° untuk pembuatan

medium miring.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


26

e. Yeast Malt Agar (YMA)

Medium Yeast Malt Agar (YMA) dibuat berdasarkan Yarrow (1998: 79).

Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g glukosa, dan

20 g agar dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades

hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga

mendidih dan larut sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf

dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15 meni t. Medium yang

telah disterilkan ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu

medium ± 45° C kemudian dituang ke cawan Petri masing-masin g sebanyak

15--20 ml.

f. Yeast Malt Broth (YMB)

Pembuatan medium Yeast Malt Broth (YMB) berdasarkan Yarrow

(1998: 79). Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g

glukosa dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades

hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga

mendidih dan larut sempurna. Medium kemudian dimasukkan ke sejumlah

tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium kemudian disterilkan

menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15

menit.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


27

2. Pemurnian isolat khamir, pembuatan stock culture dan working

culture

Pemurnian khamir dilakukan dengan metode gores berdasarkan

Yarrow (1998: 78). Medium yang digunakan adalah YMA dalam cawan petri.

Biakan khamir diambil menggunakan jarum tanam bulat (ose) kemudian

digoreskan di atas medium hingga membentuk empat kuadran garis.

Sebelum menggores satu kuadran, jarum ose dibakar terlebih dahulu dan

didinginkan sebelum menyentuh biakan. Biakan kemudian diinkubasi pada

suhu ruang selama 48 jam. Satu koloni tunggal yang tumbuh terpisah

kemudian digoreskan ke dalam dua tabung PDA yang mengandung 1,5%

NaCl dan disimpan pada suhu 4° C sebagai stock culture. Working culture

dibuat dengan cara subkultur pada médium PDA dari tabung stock culture.

3. Isolasi DNA

Isolasi DNA khamir dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA

Purification Kit (Lampiran 2).

4. Pembuatan gel agarosa 2%

Pembuatan gel agarosa 2% untuk deteksi fragmen DNA sebesar 200

pb--1 kb berdasarkan Sambrook & Russell (2001: 5.14). Sebanyak 2 g

bubuk agarosa ditambahi dengan akuades hingga volume 100 ml kemudian

dipanaskan hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam cetakan

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


28

(tray) yang sudah dipasangi sisir (comb) kemudian dibiarkan hingga

mengeras. Gel agarosa disimpan dalam larutan buffer TAE 1 X sebelum

digunakan untuk proses elektroforesis.

5. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dengan spektrofotometer

Spektrofotometer dikalibrasi menggunakan 100 µl akuabides sebagai

larutan blanko. Sampel DNA sebanyak 10 µl diencerkan dalam 90 µl

akuabides kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Pengukuran dilakukan

terhadap absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 nm dan absorbansi

protein pada panjang gelombang 280 nm. Kualitas atau tingkat kemurnian

DNA yang baik adalah 1,8--2,0 (1,8 ≤ A260/A280 ≤ 2,0). Konsentrasi DNA

kemudian dihitung menggunakan rumus berdasarkan Seidman & Moore

(2000: 419), yaitu:

Konsentrasi DNA (µg/µl) = OD260 x 50 µg/µl x faktor pengenceran

6. Amplifikasi daerah ITS dengan metode PCR

Proses PCR menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega]

dan pure taq ready-to-go PCR beads [GE Healthcare]. Setiap reaksi PCR

menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega] dengan volume total

reaksi 25 µl mengandung green go taq reaction buffer (pH 8,5), DNA

polimerase, 3 mM MgCl2, 400 µM dATP, dGTP, dTTP, dCTP, serta dye

kuning dan biru. Reaksi PCR berdasarkan Flanagan dkk. (2005: 13--16).

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


29

Volume total reaksi 25 µl terdiri atas 0,5 µl primer ITS 5 (5’-GGAAGTAAA

AGTCGTAAC AAGG-3’), 0,5 µl primer ITS 4 (5’-TCCTCCGCCTTATT

GATATGC-3’), 6 µl sampel DNA cetakan, 5,5 µl nuclease free water dan

12,5 µl Go Taq Green Master Mix [Promega]. Campuran tersebut

dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml kemudian disentrifugasi 13.000

rpm selama 1 menit.

Setiap reaksi PCR menggunakan pure taq ready-to-go PCR beads

[GE Healthcare] dengan volume total 25 µl mengandung 2,5 unit pure taq

DNA polimerase, 10 mM Tris-HCL, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dATP,

dGTP, dTTP, dCTP, dan buffer. Reaksi PCR berdasarkan GE Healthcare

[2005: 2]. Volume total 25 µl terdiri atas: 18 µl nuclease free water dan PCR

bead. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml

kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit hingga PCR bead

terlarut sempurna.

Amplifikasi menggunakan PCR thermal cycler [PERKIN ELMER 9600].

Kondisi PCR diawali dengan denaturasi awal pada suhu 94° C selama 2

menit, kemudian dilanjutkan sebanyak 40 siklus yang masing-masing terdiri

atas tiga tahap yaitu: denaturasi pada suhu 94° C s elama 15 detik, pelekatan

(annealing) pada suhu 56° C selama 30 detik dan polimerisasi pada suhu

68° C selama 1 menit. Setelah 40 siklus tersebut, dilanjutkan dengan

polimerisasi akhir pada suhu 68° C selama 10 menit 40 detik. Produk PCR

kemudian dapat disimpan pada suhu 4° C.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


30

7. Elektroforesis hasil amplifikasi daerah ITS

Hasil amplifikasi daerah ITS divisualisasikan dengan teknik

elektroforesis menggunakan gel agarosa 2%. Persiapan loading dilakukan

sebagai berikut. Sebanyak 1 µl loading dye dicampurkan dengan 5 µl sampel

DNA, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan cara dihisap dan

dikeluarkan berulang kali menggunakan mikropipet. Campuran tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam sumur (well) yang terdapat dalam gel.

Penentuan panjang fragmen daerah ITS dilakukan menggunakan DNA

marker ukuran 1 Kb (DNA ladder) sebanyak 1 µl yang dicampurkan dengan 1

µl loading dye yang dimasukkan pada sumur pertama.

Proses elektroforesis dilakukan menggunakan alat elektroforesis

[Advance] dengan buffer TAE 1X dan tegangan listrik 100 V. Proses

elektroforesis berlangsung selama 30 menit. Selanjutnya gel direndam

dalam larutan EtBr selama 20 menit kemudian dibilas menggunakan air. Gel

diamati menggunakan Gel Documentation System [BIO-RAD] yang

tersambung dengan komputer untuk melihat perpendaran pita-pita (band)

DNA hasil produk PCR, kemudian didokumentasikan menggunakan program

Gel Doc XR.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


31

8. Cycle sequencing, purifikasi produk Cycle sequencing dan sequencing

Cycle sequencing dan sequencing dilakukan di Lembaga Biologi

Molekular Eijkman, Jakarta dan Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong.

Reaksi cycle sequencing dilakukan di Lembaga Biologi Molekular

Eijkman, Jakarta. Total volume sebanyak 15 µl terdiri atasi: 6 µl big dye

terminator ready reaction mix, 1 µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR,

dan 7 µl distilled water. Cycle sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai

berikut: denaturasi awal pada suhu 96° C selama 2 menit. Reaksi kemudian

dilanjutkan sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi

pada suhu 96° C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik,

dan polimerisasi pada suhu 60° C selama 4 menit.

Reaksi cycle sequencing dilakukan di laboratorium bioteknologi BPPT,

Serpong. Total volume sebanyak 10 µl terdiri atas: 1 µl big dye terminator, 1

µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR, buffer 2 µl dan 5 µl distilled

water. Cycle Sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai berikut:

denaturasi awal pada suhu 96° C selama 1 menit, kem udian dilanjutkan

sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi pada suhu

96° C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik, dan

polimerisasi pada suhu 60° C selama 1 menit 30 deti k.

Produk cycle sequencing, yang berasal dari Lembaga Biologi

Molekular Eijkman maupun di Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong,

kemudian dipurifikasi dengan metode presipitasi etanol untuk menghilangkan

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


32

sisa reagen yang dapat mengganggu pembacaan urutan nukleotida pada

proses selanjutnya. Proses purifikasi adalah sebagai berikut: produk PCR

ditambahi 10 µl ddH2O hingga volume mencapai 20 µl, kemudian ditambahi 2

µl 1,25 M EDTA, 2 µl 3 M NaOAc dan 50 µl EtOH absolut. Tabung ditutup

dengan lembar aluminium dan dihomogenkan dengan cara tabung dibolak-

balik lalu didiamkan pada suhu kamar selama 15 menit. Campuran

kemudian disentrifugasi 3.000 rpm selama 10 menit pada suhu 20° C.

Supernatan dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan cara divakum

selama 20 menit. Selanjutnya campuran ditambahi ddH2O sebanyak 12 µl

dan dipanaskan pada suhu 42° C selama 10 menit. Pr oduk siap digunakan

untuk proses sequencing. Proses sequencing di Lembaga Biologi Molekular

Eijkman, Jakarta menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem

3130XL] sedangkan sequencing di laboratorium bioteknologi BPPT, Serpong

menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem 3100].

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


33

9. Deskripsi morfologi khamir

a. Pembuatan Slide culture

Pembuatan slide culture untuk pengamatan adanya miselium sejati

maupun miselium palsu dilakukan berdasarkan Yarrow (1998: 83). Miselium

sejati adalah struktur menyerupai tabung atau jalinan benang panjang dan

terbentuk dari spora sedangkan miselium palsu terbentuk dari sel anak yang

tidak terlepas dari sel induk pada saat pertunasan sel vegetatif (Yarrow 1998:

83). Gelas obyek steril diletakkan di dalam cawan petri. Medium CMA

kemudian dituangkan ke atas gelas obyek tersebut sehingga menghasilkan

lapisan tipis medium. Biakan khamir digoreskan menggunakan jarum ose di

sepanjang gelas obyek setelah medium mengering, kemudian ditutup dengan

kaca obyek steril. Dua buah kertas saring steril yang sudah dicelupkan ke

dalam akuades steril kemudian diletakkan di kedua sisi gelas obyek tersebut.

Biakan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dan kertas saring sesekali

diganti untuk menjaga kelembapan. Preparat yang berusia 7 hari kemudian

dikeluarkan dari cawan petri dan digunakan untuk pengamatan mikroskopik.

Pengamatan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop dengan

perbesaran 10 X 100 dengan bantuan minyak imersi untuk mengamati ada

atau tidaknya pembentukan miselium sepanjang garis inokulasi, di bawah

maupun di sekitar kaca obyek.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


34

b. Pengamatan makroskopik koloni pada medium padat

Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium padat

dilakukan menggunakan medium YMA dan MEA 5%. Sel khamir

diinokulasikan dengan metode empat kuadran gores ke dalam medium

kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi

hingga satu bulan. Pengamatan makroskopik dilakukan pada koloni sel yang

berusia 48 jam dan satu bulan berdasarkan Yarrow (1998: 81--82).

Karakteristik morfologi makroskopik koloni khamir yang diamati pada medium

padat antara lain: tekstur, warna, penampakan permukaan, profil, dan tepi

koloni.

c. Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair

Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair

dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose

biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi

pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi hingga satu bulan.

Pengamatan makroskopik khamir dilakukan pada sel yang memiliki usia 48

jam dan satu bulan berdasarkan Kirsop dkk. (1984: 97). Karakter

makroskopik yang diamati pada medium cair adalah keberadaan cincin,

pelikel pada permukaan medium serta endapan pada dasar medium.

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


35

d. Pengamatan mikroskopik pada medium cair

Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair

dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose

biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi

pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan mikroskopik khamir dilakukan

berdasarkan Yarrow (1998: 81). Sebanyak satu ose biakan khamir diambil

dan diletakkan di atas gelas obyek kemudian ditutup dengan kaca obyek.

Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 X 100

dengan bantuan minyak imersi. Karakteristik yang diamati antara lain bentuk

sel, keberadaan miselium palsu maupun miselium sejati dan tipe pertunasan.

Pengukuran panjang dan lebar sel juga dilakukan terhadap 20 sel khamir

menggunakan lensa mikrometer okuler.

10. Penyusunan dan analisis data

Penelitian bersifat non eksperimental. Data hasil pengukuran

kuantitas DNA mengggunakan spektrofotometer disajikan dalam bentuk tabel

(Tabel 1). Data yang diperoleh setelah sequencing berupa elektroferogram

(Lampiran 3--14) dan text file data sequence. Data sequence yang diperoleh

kemudian dapat dilakukan editing secara manual dengan program bioedit

berdasarkan hasil elektroferogram. Data sequence dalam format FASTA

kemudian dikirimkan ke situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mencari

homologi terhadap database sequence daerah ITS khamir yang telah

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008


36

diketahui, menggunakan program BLASTN. Identifikasi dilakukan

berdasarkan persentase homologi (% identities) yang tertinggi antara

sequence isolat yang dikirim dengan sequence spesies khamir yang terdekat

pada database GenBank.

Nilai % identities yang tinggi harus didukung oleh E value yang

rendah, serta nilai bit score dan total query coverage yang tinggi untuk dapat

menarik kesimpulan mengenai identitas query (BLAST Tutorial 2004: 1).

Hasil pencarian homologi sequence menggunakan program BLAST disajikan

dalam bentuk gambar (Gambar 5--16). Data pengamatan morfologi

makroskopik dan mikroskopik disajikan dalam bentuk tabel (Tabel 4--8) untuk

membantu menarik kesimpulan mengenai identitas isolat. Data pengamatan

morfologi juga digunakan sebagai tambahan informasi mengenai karakter

fenotip dari isolat-isolat tersebut. Data hasil identifikasi disajikan dalam

bentuk gambar dan tabel (Gambar 17--20 dan Tabel 2--3).

Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008