BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroorganisme yang
tidak dapat dilihat dengan mata telanjang untuk meneliti apa saja yang
terkandung di dalam mikroorganisme. Mikroorganisme yang ada di alam ini
mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan
bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pewarnaan.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil.
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untukdiidentifikasi ialah dengan metode pengecetan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologinya yang
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaa gram merupakan pewrnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak di gunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena
merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Dari pewarnaan
gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan
penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif
dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode
 ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian
gram 1884.
Prinsip dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakter dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun padapewarnaan. Beradasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat
mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram
negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaan gram.
B. Maksud Percobaan
Maksud percobaan ini adalah praktikum mampu membedakan bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif.
C. Tujuan Percobaan
1. Melakukan pemeriksaan mikroskopik bakteri
2. Melakukukan pengecatan bakteri, khususnya dapat membedakan bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak
memiliki membrane inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,
seperti coccus, basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.
Habitat bakteri sangat bervariasi dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan.
(Betsy dan Keogh. 2005)
Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan
hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka
hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila
diamati dengan mikroskop. (Harley dan Presscot. 2002)
Macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana yaitu dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah
difiksasi. Pewarnaan differensial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Pewarnaan
gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri (Pelzer et al.
2005).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua keompok besar yakni gram positif dan
gram negatif.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen, yaitu : (Hadioetomo.
1991)
1. Zat warna utama (violet kristal).
2. Mordan (larutan iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
3. Pencuci/peluntur zat warna (alkohol/aseton) yaitu solven organic yang
digunakan untuk melunturkan zat warna utama.
4. Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan
dengan alkohol.
 Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama
(ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi
dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu
kemudian kita cuci dengan air lalu dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat
terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak adalah zat warna
asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat
warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal
ini sediaan (bakteri) kita sebut gram negative. Bakteri gram negatif adalah bakteri
yang tidak mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram.
Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. (Dwidjoseputro. 1998)
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metal
ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. (Aditya. 2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel memnyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. (Fitria. 2009)
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu
dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila
waktu dekolorisasi terlalu pendek. (Fitria. 2009).
B. Uraian Bahan
1. Agar (Dirjen POM Edisi III, 1979)
Nama resmi : AGAR
Nama lain : Agar-agar
Pemerian : Tidak berbau atau berbau lemah, rsa berlendir,
jika lemabab liat, jika kering rapuh
 Kelarutan : Tidak larut dalam air, larut dalam air mendidih
Kegunaan : Sebagai bahan pemadat medium
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
2. Air suling (Dirjen POM Edisi III, 1974)
Nama resmi : AQUA DESTILATA
Nama lain : Air suling
RM/BM : H2O/18,02
Rumus struktur :

Pemerian : Cair jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak

mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pelarut
Khasiat : Pelarut
3. Ekstrak Beef (Ditjen POM Edisi IV, 1995)
Nama resmi : BEEF EKSTRAK
Nama lain : Kaldu nabati, kaldu hewani, ekstrak beef.
Pemerian : Berbau dan berasa pada lidah.
Kelarutan : Larut dalam air dingin.
Kegunaan : Sumber protein untuk mikroorganisme.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus
cahaya.
4. Iodium (Ditjen POM Edisi III, 1979)
Nama Resmi : IODUM
Nama Lain : Iodium
RM/BM : I/126,91
Pemerian : Keping atau butir, berat, mengkilat, seperti
logam, hitam kelabu, bau khas
Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 3500 bagian air,
dalam 13 bagian etanol (95%) P, dalam lebih
kurang 80 bagian gliserol P, dan dalam lebih
 kurang 4 bagian karbondisulfida P, larut dalam
kloroform P, dan dalam karbontetraklorida p.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutp rapat
Penggunaan : Antiseptikum ekstern, antijamur
5. Kristal Violet (Ditjen POM Edisi III, 1979)
Nama resmi : Kristal Violet
Pemerian : Hablur berwarna hijau tua
Kelarutan : Sukar larut dalam air, agak sukar larut dalam
etanol (95%) P dan dalam asam asetat plasial P.
larutannya berwarna lembayung tua.
6. Pepton ( Dirjen POM Edisi III, 1979 )
Nama resmi : PEPTON
Nama lain : Pepton daging
Pemerian : Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat, bau
khas, tidak busuk.
Kelarutan : Larut dalam air, memberikan larutan berwarna
coklat kekuningan yang bereaksi agak
asam,praktis tidak larut dalam etanol ( 95% ) P
dan dalam eter P.
Kegunaan : Sebagai sumber nutrient yang spesifik untuk
mikroba bakteri.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.
7. Safranin (Ditjen POM Edisi III, 1979)
Nama resmi : SAFRANIN
Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keunguan
Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai komposisi cat D
C. Uraian Mikroba Uji
1. Escheriachia coli (Pelczaer, 1986)
Kingdom : Procaryotae
 Divisio : Garcilicutes
Class : Scotobacteria
Ordo : Eubacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : Escheriachia coli
2. Staphylococcus aureus (Pelczaer, 1986)
Kingdom : Monera
Divisio : Firmicutes
Class : Bacili
Ordo : Bacillales
Famili : Staphylococcaceae
Genus : Staphilococcus
Spesies : Staphilococcus aureus
 BAB III
PROSEDUR KERJA

A. Alat
1. Bunsen
2. Deck glass
3. Korek
4. Mikroskop
5. Objek glass
6. Ose bulat
7. Pipet tetes
B. Bahan
1. Alkohol 96%
2. Aquadest
3. Aseton
4. Iodium
5. Kristal violet
6. Media padat NA (Nutrient agar)
7. Safranin
8. Tissue
C. Cara kerja
1. Dibuat preparat ulas, kemudian fiksasi di atas api
2. Diteteskan kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat
usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama 1 menit
3. Dicuci dengan aquadest mengalir
4. Diteteskan mordan lugol lalu tunggu selama 1 menit
5. Dicuci dengan aquadest mengalir
6. Dicuci dengan aquadest beri larutan pemucat aseton demi setetes hingga
aseton yang jatuh berwarna jernih jangan sampai terlalu banyak
(overdecolorize)
7. Dicuci dengan aquadest mengalir
8. Diteteskan counterstain (safranin) dan tunggu selama 45 detik
9. Dicuci dengan aquadest mengalir
10. Dikeringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan disisi ulasan
(jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara
11. Amati menggunakan mikroskop
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
No Mikroba Gram

Gram A Gram B Gram C Gram D Keterangan

1. Staphylococcus Ungu kecokla Bening merah Bakteri

tan gram positif

2. Escherichia coli Ungu Kecokl Bening Merah Bakteri

atan gram
negatif

B. Pembahasan
Praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan
mikroskopik bakteri. Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik
pewarnaan yang dikerjakan dilaboratorium mikrobiologi untuk kepentingan
identifikasi mikroorganisme. Pewarnaan gram dibagi emnjadi dua hasil yaitu
gram positif dan gram negtaif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap
tinta safranin atau kristal violet.
Pada proses pewarnaan gram, gelas obyek yang digunakan harus
bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan
debu. Pembersihannya biasanya menggunakan alkohol. Setelah dicuci
kemudian diberi satu tetes aquadest pada permukaanj gelas obyek. Kultur
bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek dengan menggunakan
ose. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika
terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat
diratakn tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun. Hal ini akan mengakibatkan
pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
 Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan
diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar
melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus
apabila dilakukan pencucian. Yan perlu diperhatikan dalam proses fiksasi
adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi, kemudian ditetesi dengan larutan gram A
(kristal violet) dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air
mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan
menggunaka tissue untuk mengeringkan bagian bawah objek gelas.
Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari
kristal violet.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium.
Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas
pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh
bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit
pelarutan zat warna. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali
dengan aquades. Akibat pemberiaan cat gram B, maka pengikatan warna
oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (Gram D)
sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 1 menit. Afranini pada gram D tidak
akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena
persenyawaan kompoleks kristal violet tetap terikat pada dinding sel. Pada
bakteri gram negarif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri
berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh kristal
violet telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat
terikat. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Lalu
dilakukan pengamatan dibawah mikroskop.
Berdasarkan hasil pengamatan dibawah mikroskop, diidentifikasi
bakteri Staphylococcus dan Escheriachia coli. Bakteri Staphylococcus
merupakan bakteri gram positif, berwarna merah dan berbentuk coccus atau
bulat. Sedangkan bakteri Escheriachia coli merupakan bakteri gram negatif,
berwarna ungu dan berbentuk basil atau batang.
Bakteri staphylococcus merupakan bakteri gram positif berbentuk
bulat berdiameter 0,7-1,2 nm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang
tidak teratur seperti buah anggur, tidak membentuk spora, dan tidak
bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37˚C, tetapi membentuk
pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25˚C).
Bakteri Escheriachia Coli merupakan salah satu bakteri gram negatif
bersifat anaerob fakultatif dan tidak dapat membentuk spora. Bakteri ini
dapat hidup pada berbagai substrat dengan melakukan fermentasi anaerobic
menghasilkan asam laktat, suksinat, asetat, etanol
 BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pada bakteri gram positif ketika telah jenuh mengikat cat Gram A, maka
tidak mampu lagi Gram D, sehingga bakteri tetap berwarna ungu pada
sampel bakteri Staphylococcus dan memiliki bentuk Streptococcus.
2. Pada bakteri gram negative ketika warna cat sebelumnya telah dilunturkan
oleh cat Gram C, sehingga bakteri yang tidak berwarna tersebut akan
mengikat warna cat Gram D dan bakteri menjadi berwarna merah muda
pada sampel bakteri Escherichia coli.
B. Saran
Dalam melaksanakan praktikum mengenai pewarnaan gram, diharapkan
ketika dalam pemberia larutan warna dilakukan secara hati-hati dan teliti agar
sesuai dengan prosedur yang telah ditentukan.
 DAFTAR PUSTAKA

Aditya, Mushoffa.2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Rajawali: Jakarta

Betsy dan Keogh. 2005. Microbiology Demystife d. McGraw-Hill Publisher: USA
Ditjen POM. 1969. Farmakope Indonesia Edisi III. Depkes RI: Jakarta
Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang
Fitria, bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram Positif dan Gram negatif)
Hadioetomo, R. S. 1991. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga: Jakarta.
Harley dan Publishar. 2002. Labolatory Exercise in Microbiology. McGraw-Hill
Publisher: USA
Pelczaer, M. J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press: Jakarta