UJI MUTAGENISITAS

Uji mutagenisitas adalah uji yang digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan
bersifat karsinogenik, yaitu dapat menimbulkan sel kanker

Hidrokarbon aromatik, polisiklik, dan amiri aromatik

Senyawa pengalkil

Senyawa yang berasal daari alam

Menggunakan hewan coba, serangga, dan sel mamalia

Metode yang
digunakan untuk
menentukan sifat
karsinogenik suatu
Menggunakan bakteri
senyawa kimia

Paling sering digunakan karena

memerlukan waktu relatif
singkat dan biaya lebih murah

Uji Mutagenisitas menggunakan bakteri

/ Uji Ames

Salmonella typhimurium Escherichia coli WP2

TA 97, TA 98, TA 100, TA 102

Mengandung gen mutasi Mengandung gen

histidini, mutasi rfa, mutasi uvrA
mutasi uvrB, dan faktor R
 Bakteri uji yang akan digunakan untuk uji Ames
harus mempunyai sifat genotip yang telah
disyaratkan. Konfirmasi sifat genotip ini harus
dilakukan :

Segera setelah menerima biakan

Pada waktu pembuatan liofilisat

Pada saat revertan spontan per cawan terletak di luar rentang normal

Jika bakteri-bakteri tersebut kehilangan sensitivitas terhadap mutagen

Uji butuh histidin Untuk Salmonella

typhimurium
Mutasi rfa dan
Untuk Salmonella typhimurium
mutasi uvrB

Konfirmasi genotip Uji faktor R, Untuk Salmonella typhimurium

yang dilakukan uji plasmid pAQ1 TA 102

Uji butuh triptofan Untuk Escherichia coli

Mutasi uvrA Untuk Escherichia coli

Selain konfirmasi genotip, perlu juga 4-nitrokuinolon-N-oksida (NQNO)

dilakukan uji mutagen standar.
Walaupun hasil konfirmasi sifat 4-fluoro-3-nitrofenil azida (FNPA)
genotip memenuhi syarat, tetapi jika
mutagen standar tidak memberikan 2-nitrofluoren (2NF)
hasil positif, bakteri tersebut tidak
dapat digunakan untuk pengujian. Metil metan sulfonat (MMS)
CARA PENGUJIAN
Salmonella typhimurium
TA 97, TA 98, TA 100, TA 102
Bakteri Uji
Escherichia coli WP2

Media Perbenihan :

1 Garam 50x Vogel-Bonner :

Larutkan 10 g magnesium sulfat, 100 g asam sitrat, 500 g kalium hidrogen fosfat, dan
175 g natrium amonium fosfat dalam air suling hingga 1 liter, sterilkan dengan autoklaf
121ºC selama 20 menit.

2 Media untuk pelat master :

a. Larutkan 15 g agar dalam 910 ml air suling dan sterilkan dengan autoklaf 121ºC
selama 20 menit.
b. Tambahkan 50 ml glukosa 40%, 20 ml garam 50x Vogel-Bonner, 10 ml histidin (2 g
per 400 ml air suling), dan 6 ml biotin 0,5 mM yang masing-masing telah disterilkan
secara terpisah dengan autoklaf.
c. Tambahkan 3,15 ml larutan ampisilin (8 mg per ml NaOH 0,02 N). Untuk galur TA
102, ditambahkan juga 0,25 ml larutan tetrasiklin (8 mg per ml NaOH 0,02 N). Kedua
larutan antibiotik tersebut telah disterilkan terlebih dahulu dengan penyaring bakteri.
Media steril yang masih cair dituang secara aseptik ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan membeku.

3 Media Nutrient Broth No.2 :

Larutkan 10 g Lab-Lemco powder, 10 g pepton, dan 5 g NaCl dalam 1 liter air suling,
kemudian sterilkan dengan autoklaf 121ºC selama 20 menit.

4 Pelat Agar Nutrien :

Larutkan 25 g Nutrient Broth No.2 dan 15 g agar dalam air suling hingga 1 liter, dan
sterilkan dengan autoklaf 121ºC selama 20 menit.
5 Pelat histidin-biotin dan triptofan :
a. Larutkan 15 g agar dalam 914 ml air suling dan sterilkan dengan autoklaf 121ºC
selama 20 menit.
b. Untuk pelat histidin-biotin, tambahkan 50 ml glukosa 40%, 20 ml garam 50x Vogel
Bonner, 10 ml histidin (2 g per 400 ml air suling), dan 6 ml biotin 0,5 mM yang
masing-masing telah disterilkan secara terpisah dengan autoklaf.
c. Untuk pelat triptofan, histidin dan biotin diganti dengan 10 ml triptofan (2 g per 400
ml air suling), dan air suling yang digunakan sebanyak 920 ml.
d. Media steril yang masih cair dituang secara aseptik ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan membeku.

6 Top Agar :
a. Untuk membuat 1 liter media, timbang 6 g agar dan 5 g NaCl.
b. Larutkan dalam 1 liter air suling, dan sterilkan dengan autoklaf 121ºC selama 20
menit.
c. Untuk Top Agar yang akan digunakan dalam uji mutagenisitas, tambahkan terlebih
dahulu 10 ml larutan histidin-biotin 0,5 mM (30,9 mg biotin dan 24 mg histidin dalam
250 ml air suling) ke dalam 100 ml Top Agar untuk Salmonella typhimurium, untuk
Escherichia coli, tambahkan 10 ml larutan triptofan 0,5 mM (25,5 mg triptofan dalam
250 ml air suling)

Penanganan Bakteri Uji

Secara aseptik, masing-masing galur bakteri uji (salmonella typhimurium TA 97, TA 98,
TA100, dan Escherichia coli WP2) diinokulasi dengan cara digoreskan pada pelat agar
yang mengandung ampisilin, sedangkan Salmonella typhimurium TA 102 digoreskan pada
pelat agar yang mengandung ampisilin-tetrasiklin. Semua biakan diinkubasi pada suhu
37ºC selama 24-48 jam (pelat master).

Pembuatan Biakan-Semalam
Bakteri dari pelat master diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth lalu diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 18-24 jam.
Konfirmasi Sifat Genotip Galur Bakteri Uji :

1 Uji Butuh Histidin (untuk S. Typhimurium) dan Uji Butuh Triptofan (untuk E. Coli).
Pada pelat agar tanpa histidin dibuat goresan biakan-semalam (kontrol), pada pelat agar
yang mengandung histidin-biotin, dibuat goresan biakan-semalem S. Typhimurium, dan pada
pelat agar yang mengandung triptofan, digoreskan biakan E. Coli. Pelat-pelat agar ini diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni.

2 Uji Mutasi rfa (untuk S. typhimurium)

Pada pelat agar tanpa histidin dibuat goresan biakan-semalam (kontrol), pada pelat agar
yang mengandung histidin-biotin, dibuat goresan biakan-semalem S. Typhimurium, dan pada
pelat agar yang mengandung triptofan, digoreskan biakan E. Coli. Pelat-pelat agar ini diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni.

3 Uji Mutasi uvrB dan uvrA.

Pada pelat agar nutrien, digoreskan biakan-semalam bakteri uji secara paralel. Setelah itu,
tutup cawan petri dibuka, setengah bagian ditutup dengan kertas karton. Bagian yang tidak
ditutup disinari lampu ultra violet pada jarak 33 cm selama 8 detik. Selanjutnya, cawan petri
ditutup kembali dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 12-24 jam. Setelah itu, diamati ada
tidaknya pertumbuhan koloni bakteri pada bagian yang disinari.

4 Uji Faktor R
Biakan-semalam bakteri uji digoreskan pada pelat ampisilin, lalu diinkubasi pada 37ºC
selama 18-24 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni bakteri.

5 Uji Plasmid pAQ1.

Uji ini khusus untuk galur Salmonella typhimurium TA 102. Pada pelat agar ampisilin-
tetrasiklin, digoreskan biakan-semalam galur TA 102, kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC
selama 18-24 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni bakteri.

6- Uji Reversi Spontan.

Sebanyak 0,2 ml biakan-semalam bakteri uji ditambahkan pada 2 ml Top Agar yang telah
ditambah dengan larutan histidin-biotin (untuk Salmonella typhimurium) atau larutan triptofan
(untuk E. coli), kemudian dicampur dan dituangkan pada pelat glukosa minimal, diinkubasi
pada 37ºC selama 24-48 jam, kemudian dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh.
7 Uji Mutagenesis Larutan Uji.
Ke dalam 2 ml Top Agar ditambahkan 0,1 ml biakan-semalam bakteri uji dan 0,1 ml larutan
uji, kemudian dituangkan pada pelat agar glukosa minimal. Setelah memadat, Top Agar
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung.

8 Uji Kontrol Positif.

Ke dalam 2 ml Top Agar ditambahkan 0,1 ml biakan-semalam bakteri uji dan o,54 µg 4-
nitrokuinolon-N-oksida sebagai kontrol positif, kemudian dituangkan ke dalam pelat glukosa
minimal. Setelah memadat, Top Agar diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam.

9 Pembuatan homogenat hati S-9.

Tikus jantan galur Wistar berbobot ±200 g diinduksi dengan fenobarbital dosis 75 mg/kg
bobot badan setiap hari selama 5 hari berturut-turut. Pada hari kelima, tikus dibunuh kemudian
diambil hatinya. Homogenat dibuat dalam wadah yang didinginkan serta menggunakan larutan
KCl 0,15 M steril dingin. Setelah ditimbang, hati segar dicuci dengan larutan KCl 0,15 M steril
dingin. Setelah bersih, hati dipotong-potong dengan pisau steril, dimasukkan ke dalam tabung
homogenizer steril, dan ditambahkan larutan KCl 0,15 M steril dingin sebanyak 3 ml/g hati.
Setelah homogen, homogenat hati disentrifugasi dengan kecepatan 300 rpm pada suhu 4ºC
selama 20 menit. Setelah itu, supernatan diambil, dimasukkan ke dalam tabung, dan disimpan
dalam pembeku. Untuk pengujian menggunakan homogenat hati, 0,5 ml campuran homogenat
hati ditambahkan pada Top Agar.