BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Reaksi antigen-antibodi dapat diketahui dengan menggunakan metode Dot Blot. Dot
Blot merupakan sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis dan mengidentifikasi
protein. Teknik ini menyerupai Western Blot. Western Blot merupakan salah satu teknik
Blotting yang merupakan suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah
dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke dalam lembaran tipis atau matriks membran agar
bagian protein mengalami imobilisasi. Namun perbedaannya dengan Western Blot, pada
dot blot protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai
dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam
preparasi mentah atau kasar diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan
teknik ini jika terdapat protein yang terpurifikasi dan antibod untuk protein tersebut.
Beberapa langkah yang dilakukan dalam proses Dot Blot adalah preparasi membran,
dan menandainya dengan grid untuk memberikan indikasi daerah yang akan di blot.
Sampel yang akan diuji diteteskan pada membrane nitroselulosa pada bagian tengah grid
yang telah digambar pada membrane tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak
spesifik kemudian diblok dengan merendam membrane dalam Bovine Serum Albumin
(BSA) dan diinkubasidalam antibody primer selama 30 menit suhu ruang dan dilanjutkan
dengan pencucian PBS-T selama kurang lebih 3 kali masing-masing 5 menit dan
diinkubasi pada antibody sekunder yang terkonjugasi dengan HRP. Pencucian dilakukan
kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film X-ray pada ruang gelap.
1.2 Rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang diatas didapatkan beberapa rumusan masalah sebagai
berikut
a. Marker spesifik apa yang digunakan pada dot blot
b. Bagaimana Prosedur (skema), Teknik, dan persyaratan teknik dot blot
c. Apa Aplikasinya di dunia kedokteran hewan
1.3 Tujuan
Makalah ini bertujuan agar kami selaku mahasiswa kedokteran hewan memahami
tentang teknik imunoassay, prosedur pelaksanaan dan aplikasi teknik immunoassay di
bidang medis veteriner
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Specific marker that had been used on the assay

Diagnosa RA dengan pemeriksaan biomarker inflamasi, misalnya dengan Laju
Endap Darah (LED), C-reactive protein (CRP), dan pemeriksaan auto antibody, misalnya
rheumatoid factor (RF) dan anti cyclic citrullinated peptide (Anti CCP). Dari jurnal
tersebut marker yang dideteksi dengan dot blot adalah protein MMP-3. Karena kejadian
degradasi kartilago pada RA ada hubungan erat dengan peningkatan aktivitas dari enzim
matrix metalloproteinase. MMP adalah bagian dari zinc metallo endopeptidase yang
disekresi oleh sel dan bertanggung jawab banyak atas pergantian komponen matrix.
MMP adalah enzim degradasi mayor. MMP melibatkan bermacam-macam kejadian
proteolitik pada keadaan normal dan patologi. Peran fisiologi normal MMP seperti
pertumbuhan neurite, migrasi sel, pertumbuhan tulang, penyembuhan luka, dan
angiogenesis. MMP-3 dilepaskan pada tahap awal patomekanisme RA. MMP diyakini
bertanggung jawab pada produksi auto-antibodi akibat serangan sistem imun yang
melawan jaringan tubuh dan organ. Jadi, MMP-3 dapat digunakan untuk deteksi awal
RA berbasis autoMMP-3 pada respon terhadap MMP-3 yang meningkat.

2.2 Method’s scheme , technique and requirements

Reaksi antigen-antibodi dapat diketahui dengan menggunakan metode Dot Blot.
Dot Blot merupakan sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis dan mengidentifikasi
protein. Teknik ini menyerupai Western Blot. Metode atau teknik yang digunakan dalam
pengujian ini yaitu menggunakan uji dot blot, uji dot blot memiliki beberapa tahapan
dalam pengujiannya, yang pertama yaitu koleksi serum dari penderita atau pasien, yang
kedua yaitu isolasi dan konfirmasi MMP3, dilakukan pengujian dot blot, kemudian
dilakukan SDS-PAGE dan Western blot, yang terakhir dilakukan produksi dan purifikasi
antibody untuk anti-MMP3.
1. Koleksi serum
Koleksi serum dilakukan pengambilan sample darah dari pasien penderita
Reumathoid Atrithis dan pasien yang negative Reumathoid Athritis. Koleksi serum
dilakukan di rumah sakit.
2. Isolasi dan konfirmasi MMP3
 MPP3 ini di kumpulkan dari pasien penderita RA, kemudian dilakukan elektroelusi
untuk mengetahui dan memaastikan bahwa serum tersebut mengandung MMP3,
kemudian untuk penegakan atau konfirmasi dilakuakan dot blotting dan weastern blot
kemudian untuk mengetahui konsentrasi protein dilakukan dengan uji nanodrop.
3. Pengujian dot blot
Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi
protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein
sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template
sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi
mentah atau kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkiranakan secara
semikuantitatif dengan menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang
terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. Beberapa langkah yang harus
dikerjakan dalam proses Dot Blot adalah menyiapkan membran, dan menandainya
dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot.
Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah
kisi (grid) yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs
yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine
Serum Albumin (BSA) dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 30 menit suhu
ruang. Langkah berikutnya adalah pencucian dengan PBS-T selama kurang lebih 3
kali masing-masing 5 menit dan dinkubasi pada antobodi sekunder yang terkonjugasi
dengan HRP. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan
dipaparkan pada film X-ray pada ruang gelap.

Untuk pengujian dot blot pada kasus ini yang pertama sample serum dari
penderita RA dan non-RA di teteskan pada membrane nitroselulosa sebanyak 10
mikrolit, kemudian dilakukan inkubasi selama 2 jam dilakukan blocking
menggunakan susu skim 5 %, dan setelah itu dilakukan pencucian dengan PBS T
sebanyak 3 kali. Kemudian diteteskan antibody primer(antibody terhadap MMP3) dan
dilakukan blocking menggunakan susu skim 1% pada membrane dan dilakukan
inkubasi selama 1 jam dan kemudian dicuci menggunakan PBS T sebanyak 3 kali,
kemudian diteteskan antibody skunder yang berlabel konjugat AP(Alkalin
Phospatase) dan di inkubasi selama 1 jam kemudian diberikan substrat untuk
visualisasi warna dan reaksi dihentikan dengan aquades dan dilakukan analisa hasil.
 Skema langkah dot blot :

4. SDS-PAGE dan Western blot

Langkah selanjutnya untuk konfirmasi lebih lanjut dilakukan uji western blot
yang pertama dilakukan yaitu SDS-PAGE utuk mengetahui berat molekul dari protein
tersebut, kemudian dilakukan transfer membrane ke membrane nitroselulose, dalam
transfer ke membrane dilakukan blocking untuk mencegah adanya ikatan pada protein
yang tidak spesifik, kemudian dilakukan pemberian antibody primer dan kemudian
antibody skunder yang berlabel dan dilakukan pemberian substrat untuk visualisasi
warna dan reaksi dihentikan menggunakan stop solution.
Langkah western blot :
 SDS-PAGE

Tranfers membran

Pewarnaan dengan antibody pewarna dan hasil siap untuk dibaca.

5. Produksi anti- MMP3
Produksi anti-MMP3 dilakukan pada kelinci yang telah mendapatkan sertifikat laik
etik atau komisi etik hewan percobaan, produksi ini dilakukan untuk mendapatkan
protein MMP3 secara masal atau banyak.

2.3 The impact in veterinary medicine applications

Teknik immunodot sangat penting peranannya dalam bidang kedokteran hewan.
Aplikasi dari teknik ini secara umum digunakan sebagai metode diagnosis dan konfirmasi
suatu penyakit. Sebagai contoh misalnya digunakan dalam pendeteksian antigen dari
virus bluetongue pada jaringan, analisis antibody terhadap eimeria tenella, deteksi
terhadap Toxoplasma gondii, deteksi haemonchus sp. Pada hewan ternak, Di bawah ini
merupakan salah satu pengaplikasian Dot blot pada dunia kedokteran hewan:
1. Pengembangan Diagnosis Molekuler Toksoplasmosis Berdasarkan Sekuen Spesifik
Deoxyribonucleic Acid Stadium Takizoit Dan Bradizoit. Deoxyribonucleic acid
probe berdasar sekuen spesifik DNA stadium takizoit (sag-1) dan bradizoit (bag-1) T.
 gondii dapat digunakan untuk mendeteksi toksoplasmosis pada ayam buras dengan
hibridasi dot blot (Ida Ayu Pasti Apsari, 2012).
2. Dot blot juga di gunakan sebagai metode pengujian anti protein produksi Bastosis
(Anti-PAG). Hal ini digunakan untuk mencri apakah saling terjadi pengenalan antara
Anti-PAG dan protein PAG yang terdapat dalam serum sapi bunting ( Tita Damayanti
Lestari, 2011)
 BAB III
PENUTUP

3.1 KESIMPULAN
Metode Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis dan
mengidentifikasi protein. Uji dot blot biasanya digunakan sebagai uji untuk mengetahui ada
tidaknya reaksi antigen dan antibodi. Perbedaannya dengan Western Blot, pada dot blot
protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template
sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Dalam bidang kedokteran hewan, Aplikasi
teknik immunodot secara umum digunakan sebagai metode diagnosis dan konfirmasi suatu
penyakit. Contohnya yaitu pengembangan diagnosis molekuler toksoplasmosis berdasarkan
sekuen spesifik deoxyribonucleic acid stadium takizoit dan bradizoit serta sebagai metode
penguji anti protein produksiBastosis (Anti-PAG).

3.2 SARAN
Diharapkan dengan teknik Dot Blotting dapat meningkatkan kompetensi profesi
kedokteran hewan dalam mengembangkan diagnosis dan konfirmasi terhadap penyakit pada
hewan sehingga dapat meningkatkan kesehatan, perlindungan, pencegahan penyakit dan
kesejahteraan hewan dan masyarakat veteriner.
 DAFTAR PUSTAKA

Apsari, Ida Ayu Pasti. 2012. Pengembangan Diagnosis Molekuler Toksoplasmosis

Berdasarkan Sekuen Spesifik Deoxyribonucleic Acid Stadium Takizoit Dan
Bradizoit. FKH UGM Yogyakarta.
Lestari, Tita Damayanti .2011. pengujian anti protein produksi Bastosis (Anti-PAG) melalui
Metode Dot Blot. FP Universitas Padjajaran.