Bioquimica Aplicada A La Biotecnología 1

BIOQUÍMICA APLICADA A LA
BIOTECNOLOGÍA I
1
DIRECTORIO
DR. JOSÉ ALFREDO MIRANDA LÓPEZ

RECTOR
MTRO. RICARDO LÓPEZ FABRE

VICE-RECTOR ACADÉMICO
M. en C. MARIANO SÁNCHEZ CUEVAS

DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS
M. en C. MARÍA CRISTINA MIRANDA VERGARA

COORDINADORA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
M. en C. ALFREDO CESAR BENÍTEZ ROJAS

AUTOR
2
INDICE PAG
INTRODUCCION……………………………………………………………………….. 4
NORMAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS ………………………….. 5
REGLAS DE LABORATORIOS DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS….....……. 6
CRITERIOS DE EVALUACIÓN……………………………………………………… 7
PROPÓSITO DEL LABORATORIO…………………………………………………. 8
Práctica 1: Principios Básicos de laboratorio; uso de micropipetas y cálculos de

utilidad en Bioquímica…………………………………………………………………. 10
Practica 2: El agua como solvente polar……………………………………...……. 17
Practica 3: Identificación de carbohidratos.……………………………………….. 21
Práctica 4: Identificación de aminoácidos..………..……………..…………….…. 28
Práctica 5: Cuantificación de proteínas I…………………………………………… 35
Practica 6: Cuantificación de proteínas II.………..………………………………… 43
Práctica 8: Cinética enzimática………………………………………………..…........ 47
3
INTRODUCCION
La biotecnología consiste en la manipulación de organismos vivos o de productos de organismos

vivos con el fin de obtener productos deseables para el uso humano. Desde esta perspectiva, la
ganadería y el cultivo de abejas se consideran prácticas biotecnológicas. El término se utiliza
también para expresar la interacción de la biología con la tecnología humana. A pesar de que en
el uso común se asocie el término a las partes de la industria que crean, desarrollan, o comercian
productos generados a través de la manipulación intencional, en un nivel molecular, de formas de
vida (DNA recombinante, por ejemplo), limitar el término a estos aspectos se considera un error.
De hecho, la biotecnología ha sido usada por el hombre desde el comienzo de la historia en
actividades como la producción de bebidas alcohólicas, la elaboración de pan y el mejoramiento
de cultivos domésticos.
Si bien no se ha dejado de elaborar pan, cerveza, cultivar papas y producir quesos, en la

actualidad ha sido la introducción de técnicas como la de DNA recombinante, las que han hecho
que las posibilidades de manipulación de especies que tenía el hombre se amplíen enormemente.
Por ejemplo, la capacidad de introducir en cultivos como manzanas o maíz, ciertos genes que los
hagan más grandes o más coloridos, o incluso que permitan que los cultivos produzcan por sí
mismos los plaguicidas que comúnmente se rociaban, sin duda representa una revolución en la
agricultura. Se habla también de la introducción a los alimentos de gran consumo en países en
vías de desarrollo (como el arroz o el fríjol), vitaminas en las que la población sea deficiente, para
evitar problemas de salud.
Resulta evidente que para comprender todas las posibilidades que ofrece la biotecnología es
necesario un profundo conocimiento de las ciencias básicas que se encuentran en ella
implicadas, de todas ellas, la Bioquímica juega un papel central ya que la comprensión de esta
disciplina abre todas las puertas a tan variadas y por momentos inimaginables aplicaciones de la
biotecnología.
Entre estas aplicaciones encontramos el uso de microrganismos como “fabricas” de metabolitos

(proteínas, enzimas, vitaminas, etc), el diseño y aplicación de herramientas diagnósticas
(anticuerpos monoclonales, electroforesis de proteínas y DNA, western blot, etc.) e inclusive la
agricultura y la ganadería se están beneficiando a través de la Ingeniería Genética o Tecnología
de DNA recombinante que ya se ha mencionado, pues todos estos procesos son esencialmente
procesos bioquímicos.
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NORMAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS DE BIOQUIMICA Y
BIOLOGIA MOLECULAR
Localizar los dispositivos de seguridad más próximos.
Estos dispositivos son elementos tales como extintores, lavaojos, ducha de seguridad, mantas
antifuego, salida de emergencia. etc. Infórmate sobre su funcionamiento.
En caso de accidente.
Considerar la seguridad de sus compañeros, por ello el laboratorio es un lugar para trabajar
con seriedad. En caso de cualquier accidente personal o del material de trabajo, notifíquese
inmediatamente al maestro.
Manejo de reactivos
Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la

característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por
lo tanto siempre se deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos.
Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y
proteínas deben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso
combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
El revelado de geles
La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con
8W de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá
contar con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de
observación. Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material.
Corriente eléctrica
El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica.
Aunque la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto
directo con la electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o
desconectada al momento de manipular el equipo.
Desnaturalización de proteínas y DNA
El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio
resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para
colocar los viales.
Uso de guantes
Se deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas. Este
paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o
proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el
laboratorista se exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.
5
Material biológico
El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los
productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a -
20°C. Las proteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras
biológicas deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de
descongelamiento o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las
moléculas.
Micropipetas
Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de

electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10,
20, 200 y 1000 μl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio,
cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO
8655, DIN 12650). Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que
tienen contacto directo con las moléculas de DNA sean nuevas y estériles, a fin de evitar una
posible contaminación de la muestra con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar
con puntas previamente usadas, siempre y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido
previamente esterilizadas en autoclave (121°C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las
proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas pero sí se recomienda esterilizarlas previamente.
Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual
cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO
8655, DIN 12650).
REGLAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA
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1. Todos los estudiantes deberán usar bata blanca del laboratorio, guantes, gafas de seguridad y
mascarilla (cuando aplique).
2. Está prohibido fumar, comer, beber o introducir alimentos al laboratorio aún fuera de la hora
de práctica.
3. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, después no se permitirá el acceso al

laboratorio.
4. Colocar los objetos personales en el lugar que te indique tu profesor, esto es para evitar que el
acumulo de cosas en el área de trabajo
5. Mantener el orden durante el transcurso de la práctica y respeto a la clase y a los

compañeros.
6. Se formarán equipos permanentes de trabajo y las faltas de asistencia a alguna práctica no

podrán ser repuestas con otro grupo.
7. Por cada práctica que se realice los alumnos tendrán que entregar un reporte por equipo de la
misma, que entregarán cada 8 días.
8. Cada material que se rompa o extravíe, deberá ser repuesto con material nuevo (amparado
con la nota de compra).
9. Todos y cada uno de los alumnos deberán llevar la práctica impresa a la sesión de laboratorio
10. Antes de iniciar la práctica se realizará un examen pre-laboratorio que será calificado en la
misma sesión.
11. Cada equipo deberá responsabilizarse por la limpieza inmediata del material y área de trabajo,
no podrá retirarse ningún miembro del equipo hasta que la zona de trabajo esté
completamente limpia y ordenada
12. Al destapar cualquier frasco de sustancias, tapar de inmediato después de utilizarlo y evitar
cambiar los tapones.
13. No arrojar sólidos al lavadero o canales de desagüe.
14. Queda estrictamente prohibido sacar cualquier instrumento o equipo del laboratorio.
15. Al final de la práctica entregar todo el material o equipo al maestro, entregar las notas y
practica impresa para firma y calificación y colocar los bancos en su lugar y lavarse las manos
con agua y jabón.
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CRITERIOS DE EVALUACIÓN
Código de conducta
 Tolerancia de 10 minutos para entrar al laboratorio. Después de este tiempo no se

permitirá el acceso de los alumnos.
 No se permite el uso de celulares durante las sesiones de laboratorio.
 Asistencia a todas las prácticas con uso de bata blanca, y elementos de seguridad
descritos en el apartado correspondiente. Los alumnos que no cumplan con alguna de
estas reglas no podrán realizar la práctica.
 El alumno se compromete a leer previamente las prácticas del laboratorio y contestar su

examen pre-laboratorio
 Las inasistencias se justifican solamente con la carta expedida por los Directivos de su
Facultad.
 El alumno que falte a la práctica de laboratorio pierde derecho a sus evaluaciones
Requisitos para hacer el reporte
 PROPOSITO: Conoce los propositos (propios del equipo) de la práctica
 RESULTADOS: Obtiene los resultados esperados (dibujos o valores)
 DISCUSIÓN FUNDAMENTADA: Discute los resultados y/o cambios que se obtuvieron en

la práctica y fundamenta con los conocimientos teóricos, bibliográficos y de artículos
correspondientes al tema de la práctica, explica con excelente redacción sobre si se
alcanzaron o no los propósitos de la misma.
 CONCLUSIÓN: Concluye con un comentario o idea final que resuma los aspectos más
importantes tanto del tema que se trabajo como de los resultados de la actividad que se
realizó en la práctica, explica con excelente redacción porque se alcanzaron o no los
propósitos de la misma y propone soluciones o alternativas cuando los propósitos no se
alcanzaron
8
PROPÓSITO DEL LABORATORIO
FACILITAR AL ALUMNO DE BIOTECNOLOGÍA LA COMPRENSIÓN DE ALGUNOS

PRINCIPIOS BIOQUIMICOS; REACCIONES, PROCESOS Y TECNICAS ANALITICAS DE
USO COMUN EN LOS LABORATORIOS DE BIOINGENIERIA ALREDEDOR DEL MUNDO.
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Práctica 1: Principios básicos de laboratorio, uso de micropipetas y cálculos de utilidad en
Bioquímica.
Introducción
En el año de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de

Pesas y Medidas con sede en París, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y
Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de información cuantificable y
universalizar su uso. El SI es básicamente una versión ampliada del sistema métrico decimal y
consta de siete unidades básicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes físicas.
En el Cuadro 1 se describen estas unidades, además de los símbolos que se deben utilizar
cuando se hace mención a éstas.
Dos o más unidades básicas pueden ser combinadas mediante multiplicación o división para
generar unidades SI derivadas. Algunas de estas unidades poseen nombres particulares en honor
a científicos que contribuyeron al conocimiento de un tema en particular. En el Cuadro 2 se
presentan algunos ejemplos de unidades SI derivadas.
Muchas veces las unidades básicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeñas para
representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de
prefijos que permiten formar múltiplos o submúltiplos decimales de las unidades del SI. Estos
prefijos se muestran en el Cuadro 3.
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Los prefijos se anteponen directamente al nombre o símbolo de la unidad en cuestión, por
ejemplo nanogramo o ng y no nano-gramo o n-g. Si bien es cierto, el uso del SI es la regla hoy en
día, existen excepciones que la Oficina Internacional de Pesas y Medidas debió adoptar debido a
su uso generalizado. Algunas de estas excepciones de uso en ciencias médicas se muestran en
el Cuadro 4.
Debido a su uso rutinario en la bioquímica experimental, vale la pena mencionar algunas normas
sobre la expresión de concentraciones de sustancias. La concentración de sustancias cuya masa
molecular se conoce, se expresa como cantidad de sustancia (moles o submúltiplos como mmol,
nmol) por litro (l).
Ejemplo: concentración de glucosa en suero humano: 3.6 mmol/l a 6.1 mmol/l. Los términos
concentración molar, molaridad o M, normalidad o N son obsoletos y en su lugar debe usarse el
término “cantidad de sustancia concentración de X” o más comúnmente, “concentración de X”. El
término molal y su símbolo m no deben ser más utilizados y en su lugar se utiliza el término
“cantidad molalidad del soluto X” con las unidades SI mol/kg.
La Conferencia General de Pesas y Medidas no recomienda el uso de la escala de pH y en su

lugar, la concentración de iones hidronio en una solución debe ser reportada como nmol/l. Sin
embargo, la eliminación de la escala de pH no ha sido aceptada por la mayoría de la comunidad
científica. En el año 2002, la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) elaboró
una propuesta para que dicha medida cumpliera con los requisitos solicitados por la Conferencia.
A la fecha, esta propuesta se encuentra en discusión.
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A continuación se enumeran algunas reglas para la consignación de símbolos y cifras del SI:
 Los símbolos se escriben siempre en singular. Ejemplo: 2 mm y no 2 mms.

 El nombre completo de una unidad se pluraliza si es necesario. Ejemplo: 35 kilogramos.
 Los prefijos no deben usarse solos, sino siempre acompañados de una unidad.
 Ejemplo: 14 gigawatts y no 14 gigas.
 El punto no debe usarse después de un símbolo, a menos que éste se encuentre
 al final de una frase. Ejemplo: 55 kg de masa y no 55 kg. de masa.
 Siempre se deja un espacio entre el número que denota la cantidad y el símbolo de la
unidad. Ejemplo: 15 s y no 15s.
 Números muy grandes pueden ser separados en grupos de tres para facilitar su lectura, sin
puntos o comas. Los puntos o comas se utilizan para las notaciones decimales. Ejemplo: 1
000 257, 35 y no 1.000.257,35.
 Siempre se coloca un cero a la izquierda de la coma o el punto decimal para los números
menores de uno. Ejemplo: 0.38 o 0,38 y no .38 o ,38.
 Los símbolos de las unidades o sus nombres no deben ser modificados mediante adición
de subíndices. Ejemplo: Vmax= 1000 V y no V= 1000 Vmax.
 La redacción de la información no debe ser mezclada con los símbolos de las unidades o
sus nombres. Ejemplo: “el contenido de agua es de 20 ml/kg” y no “20 ml H 2O/kg” o “20 ml
de agua/kg”.
 Debe quedar explícito cuál símbolo pertenece a cuál valor numérico y qué operación
matemática debe ser aplicada a cada valor numérico. Ejemplos:
 45 cm X 46 cm y no 45 X 46 cm
 20 °C a 30 °C o (20 a 30) °C y no 20 °C-30 °C o 20 a 30 °C
 Los símbolos de las unidades o sus nombres no pueden ser mezclados y las operaciones
matemáticas no son aplicadas a los nombres de las unidades sino a los valores numéricos.
Ejemplos: pueden ser usadas formas como: kg/l, kg • l o kilogramo por litro y no formas
como: kilogramo/l, kg/litro, kilogramo/litro o kg por l.
 Los valores de cantidades son expresados en forma numérica y con los símbolos de las
unidades. Ejemplos: m= 5 kg y no m= cinco kilogramos o m= cinco kg, o “la corriente fue
de 15 A” y no “la corriente fue de 15 amperios”.
Uso correcto de las micropipetas.
Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños que van desde 1 μl
hasta 1 ml o más. Al igual que las pipetas éstas pueden ser para contener o para verter
volúmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un volumen fijo o un
volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un
rango de valores determinado.
La micropipeta más comúnmente usada en los laboratorios de análisis fue introducida por la
compañía Eppendorf y este nombre se adoptó de forma genérica para estos dispositivos, aunque
hoy en día existen una gran cantidad de compañías y modelos similares que funcionan bajo un
mismo principio de pistones para operar.
Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de
cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan puntas o “tips” descartables plásticos que se
ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plástico es donde se deposita el líquido
a medir.
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Para absorber el líquido, el pistón es presionado hasta una primera posición, el tip es puesto en
contacto con el líquido y luego, lentamente, se permite que el pistón vuelva a su posición original.
Este paso permite el llenado del tip con el volumen correspondiente. El tip de plástico
generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe líquido. A
continuación se describen las instrucciones específicas para los modelos de micropipetas que se
utilizarán durante el curso.
1. Selección de la micropipeta a utilizar según el volumen a dispensar. Para este paso, se

aplican las mismas reglas que se utilizan para el manejo de las pipetas. El Cuadro 5
muestra los rangos de volúmenes que se pueden pipetear con cada modelo de micropipeta
de la marca Biorad, además de los usos más comunes. La mayoría de la micropipetas
indican en el botón pulsador el rango o volumen máximo que pueden pipetear. Para
prevenir un daño en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar
los volúmenes máximos permitidos para cada micropipeta.
1. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario seleccionar

el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen, compuesto de tres
dígitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte más baja del indicador hay una
escala que permite el ajuste del volumen al último dígito o decimal permitido según el caso.
2. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botón pulsador (Figura 3, A2) o la rueda
de graduación del volumen (Figura 3, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado.
Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado
prestando atención para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el
procedimiento de ajuste. Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un
volumen más alto disminuyendo las indicaciones del indicador.
3. Seleccionar la punta o tip plástico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al
cono de la micropipeta. Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que aplicar una
fuerte presión con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta
con líquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plástica se encuentre en una
caja también plástica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no está en
caja, deberá ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estará en contacto con la
solución a extraer.
4. Aspiración: apretar el botón pulsador hasta el primer tope.
5. Con la pipeta en posición vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra.
6. Lentamente se aspira el líquido al relajar la presión del dedo sobre el botón pulsador. Si
este paso no se realiza con atención, puede entrar aire en la punta y la cantidad de
muestra aspirada no es la adecuada.
7. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido.
8. Dosificación: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente
donde se depositará el líquido, con un ángulo entre 10° y 40°.
9. Apretar el botón pulsador suavemente hasta el primer tope y esperar un segundo.
10. Apretar el botón pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del líquido.
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11. Manteniendo apretado el botón pulsador en el segundo tope, retirar la pipeta deslizando la
punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botón pulsador.
12. Expulsar la punta apretando el botón del expulsor.
Para no dañar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:
 El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta

 Nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo
 Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido
 Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta
Cálculo y expresión de diluciones.
Una dilución consiste en preparar una solución menos concentrada a partir de una más
concentrada. Esta práctica es muy común en los laboratorios y de ella depende en gran parte el
resultado final analítico que se obtenga. Por lo tanto es imperativo el manejo de este tipo de
cálculos para cualquier persona que trabaje dentro de un laboratorio. Las diluciones generalmente
se expresan como una razón matemática, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso
de una dilución 1:5, ésta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un
volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volúmenes.
Nótese que el volumen total o final estará compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4
volúmenes del disolvente. Para calcular la concentración final de una solución diluida, se
multiplica la concentración de la solución original por la dilución expresada como fracción.
Ejemplo: una solución de urea cuya concentración es de 5 mg/ml es diluída 1/10. La

concentración final de la solución diluida es 5 X 1/10= 0.5 mg/ml.
La ecuación más comúnmente utilizada para preparar soluciones es:
V1C1=V2C2
Donde V1 es el volumen de la solución concentrada que se debe añadir para preparar la solución
diluida,
C1 es la concentración de la solución concentrada
V2 es el volumen de la solución diluida
C2 es la concentración de la solución diluida.
Al utilizar esta ecuación debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V 1 y V2 así como las
de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente. Ejemplo: prepare
500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l a partir de una solución de glucosa a 45 mol/l.
Aplicando la ecuación antes presentada tenemos:
x(45 mol/l)= 500 ml(5 mol/l)

x= 55.56 ml de glucosa 45 mol/l
Entonces, para preparar 500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l, se requieren 55.56 ml de
glucosa 45 mol/l y llevar a 500 ml con agua. Nótese que la solución original fue diluida 1/9 o en
otras palabras, se utilizó un factor de dilución de 9:
45(1/x)= 5
x= 9
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El factor de dilución representa el número de veces que fue diluida la solución concentrada. Si se
hace no una sino una serie de diluciones, la concentración de la solución final se obtiene al
multiplicar la concentración original por el producto de los factores de dilución. Ejemplo: si la
solución de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la
concentración final de la solución será 45(1/9)(1/100)= 0.05 mol/l, con un factor de dilución de
900.
Las diluciones seriadas son también muy útiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas
las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de
dilución. Ejemplo: para determinar la concentración de proteínas en un suero animal, la muestra
es diluida 1:5 o 1/5 mediante la adición de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solución salina en el
tubo número 1. Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solución salina como diluyente. La dilución
seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar y transferir 0.5 ml del tubo 2 al
tubo 3 y así sucesivamente hasta el tubo 8. La concentración de suero en los tubos 2 al 8 decrece
por un factor de 2, siendo cada dilución: tubo 1: 1/5, tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo
5: 1/80, tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y tubo 8: 1/640.
Propósito
1. Que el estudiante se familiarice con la metodología, equipo y forma de trabajo dentro del
laboratorio de Bioquímica.
Materiales y equipo Reactivos

 Bolsa de 100 tubos eppendor de  Agua destilada
3 mL  KMnO4
 Pinzas de disección
 Micropipetas de volumen
variable
 2-200 ul, 100-1000 ul
 Puntas para micropipeta
 Balanza analitica
 Estufa de incubación
Procedimiento
1. Colocar 24 horas antes 25 tubos eppendorf por persona a peso constante (en estufa a
100° C durante las 24 hpras).
2. Identificar 5 series con 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
Tubo/volumen 5 10 50 150 925

1
2
3
4
5
3. Registrar el peso de cada tubo vacío a peso constante con una sensibilidad de hasta
tres decimales
15
4. Pipetear con la técnica descrita en el apartado de teoría el volumen indicado en la tabla
(5 replicas por volumen)
5. Pesar nuevamente los tubos eppendorf con el liquido
6. Por diferencia calcular el peso y volumen del liquido
Preparar por todo el grupo 50 ml de KMnO4 0.1 M
A partir de esta solución preparar una serie de diluciones 1:5 de 5 ml.
Tomar fotografías de los tubos con las diluciones.
Cuestionario
1. ¿Por qué es importante contar con un sistema estandarizado de unidades? Fundamenta tu

respuesta.
2. Investiga quien es en México la institución encargada de difundir, vigilar y aplicar el SIU y

cual es la Norma Oficial Mexicana que establece el uso del SIU en nuestro país.
3. En tu reporte incluye las fotografías de las diluciones seriadas.
4. Con los volúmenes medidos calcula la desviación estándar, volumen promedio y

coeficiente de variación, reporta estos datos.
5. Calcula el volumen necesario para preparar las siguientes soluciones a partir de las
propuestas
Concentración final: A partir de:

 Glucosa 0.1 M  0.5 M
 Fenilalanina 0.5 M  1M
 KMnO4 0.2 M  0.5 M
 Sacarosa 0.25 M  0.8 M
 Albumina 0.1M  2M
EXAMEN PRELAB DESEMPEÑO FIRMAS FECHA
ALUMNO
DOCENTE
REFERENCIAS
 Angulo Ugalde, Y. (1999) Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica,

San José de Costa Rica.
 Switzer, R. y L. Garrity. (1999). Experimental Biochemistry: Theory and exercises in

fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York
16
Práctica 2: El agua como solvente polar
Introducción
El agua, el líquido más común de la superficie terrestre, el componente principal en peso de
todos los seres vivos, tiene un número de propiedades destacables. Estas propiedades son
consecuencia de su estructura molecular y son responsables de la "aptitud" del agua para
desempeñar su papel en los sistemas vivos.
La estructura de la molécula de agua está dada por dos átomos de hidrógeno y un átomo de
oxígeno que se mantienen unidos por enlaces covalentes, la geometría molecular corresponde a
un tetraedro deformado originando un efecto dipolar (2 polos) en la molécula (Figura 1 a).
Como una consecuencia del fenómeno anteriormente explicado, forma enlaces -llamados
puentes de hidrógeno- con otras moléculas. Aunque los enlaces individuales son débiles -se
rompen y se vuelven a formar continuamente- la fuerza total de los enlaces que mantienen a las
moléculas juntas es muy grande. Los puentes de hidrógeno determinan muchas de las
extraordinarias propiedades del agua.
Entre ellas están su gran cohesión, su alta tensión superficial y su alto calor específico, de
vaporización y de fusión. Los fenómenos de capilaridad e imbibición están también
relacionados con la presencia de puentes de hidrógeno (Figura 1 b).
Figura 1 (a) Estructura molecular del agua
Figura 1 (b) Formación de puentes de hidrógeno
17
La polaridad de la molécula de agua es, además, responsable de su adhesión a otras sustancias
polares, de ahí, su tendencia al movimiento capilar. También debido a su polaridad el agua es un
buen solvente para iones y moléculas polares. Las moléculas que se disuelven fácilmente en
agua se conocen como hidrofílicas. Las moléculas de agua, a raíz de su polaridad, excluyen
activamente de la solución a las moléculas no polares. Las moléculas excluidas de la solución
acuosa se conocen como hidrofóbicas.
El agua tiene una ligera tendencia a ionizarse, o sea, a separarse en iones H+ (en realidad iones
hidronio H3O+) y en iones OH-. En el agua pura, el número de iones H+ y el número de iones
OH- es igual a 10-7 mol por litro (M). Una solución que contiene más iones H+ que iones OH-
es ácida; una solución que contiene más iones OH- que iones H+ es básica o alcalina. La escala
de pH refleja la proporción de iones H+ a iones OH- (Figura 2).
Figura 2. Fenómeno de ionización del agua. En el agua pura [H3O+] = [OH-] =10-7 M
Una solución ácida tiene un pH inferior a 7; una solución básica tiene un pH superior a 7. Casi
todas las reacciones químicas de los sistemas vivos tienen lugar en un estrecho intervalo de pH
alrededor de la neutralidad. Los organismos mantienen este estrecho intervalo de pH por
medio de buffers, que son combinaciones de formas de ácidos débiles o bases débiles; dadores y
aceptores de H+.
5 Vasos de precipitados de 100 ml Agua destilada

2 matraces aforados de 50 ml Sacarosa
1 foco de lámpara de 9 v NaCl
1 probeta graduada de 100 ml Aceite común de cocina
1 socket para el foco Hexano
1 m de cable para bocina
1 pila de 9 v
1 Cutter
1 Potenciometro con medidor de
conductividad.
Propósitos
1. Analizar la importancia que el agua tiene para los seres vivos y explicar los
fundamentos fisicoquímicos que le confieren tal importancia.
2. Comprender la las propiedades fisicoquímicas del agua como solvente polar.
3. Explicar la relación entre la estructura química del agua y sus propiedades

fisicoquímicas.
18
Cortar el cable y conectarlo al socket de tal forma que se cree un circuito como lo muestra la
Figura 3.
Verter 50 ml de cada una de las siguientes substancias en un vaso de

precipitados (1 vaso para cada substancia):
 Agua destilada
 Agua de llave
 Aceite de cocina
 Hexano
 Solución 0.01 M de NaCl
 Solución de 0.1 M de NaCl
 Solución 0.5 M de NaCl
 Solución 1 M de NaCl
 Solución 0.01 M de Sacarosa
 Solución 0.1 M de Sacarosa
 Solución 1 M de sacarosa
Figura 3. Esquema del circuito eléctrico para prueba de

conducción eléctrica en disoluciones
Registrar los resultados en la siguiente tabla
Substancia Intensidad Conductividad (µS)

Agua destilada luminosa
Agua de llave
Aceite de cocina
Hexano
NaCl 0.01 M
NaCl 0.1 M
NaCl 0.5 M
NaCl 1 M
Sacarosa 0.01 M
Sacarosa 0.1 M
Sacarosa 1 M
19
Cuestionario
1. ¿Por qué si el agua destilada pura no logro encender el foco, la conductividad no es 0?
2. ¿Por qué el aceite y el hexano que tampoco encendieron el foco presentan

conductividades cercanas a 0?
3. ¿Que tipos de enlace presentan las moléculas de esta práctica y como se relaciona el tipo
de enlace con las observaciones experimentales?
4. Grafica la concentración de NaCl vs conductividad y obtén la ecuación que describe esta

relación.
5. Con base a la ecuación del punto anterior calcula cual sería la conductividad de una
solución de NaCl 1.5 M
6. ¿Porque se dice que “lo polar disuelve a lo polar y lo no polar disuelve a lo no polar”?
Fundamenta tu respuesta
7. ¿Que importancia biológica tiene que el agua sea un solvente polar?
8. ¿Porque es indispensable el agua para los seres vivos? (Razón bioquímica)
9. Si las membranas celulares están constituidas por substancias lipídicas, ¿Puede el agua
atravesar estas membranas? Fundamenta tu respuesta
10. En base a la respuesta de la pregunta 8 ¿Qué implicaciones habría para la vida si el

agua fuese un compuesto no polar?
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
1. Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999
 Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in

fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999
Notas al estudiante:
20
Practica 3: Identificación de carbohidratos
Introducción
Los carbohidratos son compuestos de carbono que contienen oxígeno e hidrógeno en relación 2
a 1 con una fórmula general (CH2O)n, aunque el término también se emplea para
compuestos derivados de los carbohidratos que no cumplen esta definición estrictamente.
Pueden clasificarse según su estructura en: monosacáridos o azúcares simples, oligosacáridos y

polisacáridos. Los monosacáridos son polihidroxialdehídos (aldosas) o polihidroxicetonas
(cetosas).
Figura 1. Estructura de los carbohidratos
Se nombran de acuerdo al número de carbonos en la cadena, de forma que las tetrosas

contienen cuatro, las pentosas cinco y las hexosas seis átomos de carbono. La forma abierta de
estas moléculas está en equilibrio con las formas cíclicas formadas al reaccionar un grupo alcohol
con el aldehído o cetona de la misma molécula para formar un enlace hemiacetal. Esta forma
cíclica para el caso de la glucosa se llama forma piranosica (del pirano).
Figura 2. Estructura cíclica de la glucosa (2 isomeros)
21
Los monosacáridos pueden unirse entre sí por medio de enlaces glucosídicos que se forman
cuando el grupo hidroxi del carbono 1 reacciona con el OH de otra molécula con la eliminación de
agua. El enlace cetal se llama también enlace glucosídico (Figura 3).
De esta forma se forman oligosacáridos (2-10 monosacáridos) y moléculas de alto peso

molecular o polisacáridos. Son ejemplos de este tipo de macromoléculas: el almidón, el
glucógeno y la celulosa, todos ellos formados por glucosa.
Figura 3. Disacaridos de importancia biológica
Los polisacáridos también pueden estar formados por dos o más diferentes monosacáridos o
derivados de ellos, como la N-acetilglucosamina, el ácido glucurónico o el ácido N-
acetilmurámico que forman parte, respectivamente, del ácido hialurónico, en la heparina y en la
mureina (Figura 4). Muchos de estos heteropolisacáridos se encuentran asociados a
proteínas formando los proteoglicanos y las glicoproteínas.
Uno de los monosacáridos más abundantes en la naturaleza es la glucosa que se forma en las
plantas y algas a partir de agua y CO2 usando la energía de la luz del sol en el proceso llamado
fotosíntesis. Muchas plantas contienen grandes cantidades de carbohidratos como reservas de
energía, que después sirven de alimento a otros organismos como los animales. Después de su
ingestión, los carbohidratos de las plantas se hidrolizan para formar glucosa a partir de la cual se
forma glucógeno.
En los animales, los carbohidratos almacenados se convierten en glucosa que se transporta a las
células donde se oxida a CO2 y O2 en la respiración celular. La energía liberada es “capturada” y
utilizada para llevar a cabo las actividades metabólicas. En el caso del hombre, más del 60% de
sus requerimientos de energía se obtienen de la oxidación de los carbohidratos. De esta
22
manera la energía luminosa del sol se hace accesible al reino animal, que no lleva a cabo el
proceso de fotosíntesis.
Se han desarrollado un gran número de pruebas químicas que se utilizan comúnmente para la
identificación cualitativa de diversos azúcares o grupos de ellos.
Figura 4. Monosacaridos derivados
En la práctica se trabajará con las siguientes:
La reacción de Molisch es la prueba más general para carbohidratos. Los compuestos que se
deshidratan con ácido sulfúrico para formar furfural o hidroximetilfurfurtal, reaccionan con (α-
naftol) para dar un producto de condensación de color púrpura (Figura 5).
El grupo más numeroso de reacciones generales de los carbohidratos es el constituido por las
que detectan la presencia de materiales relativamente reductores, como son los
monosacáridos y muchos disacáridos.
Algunas de estas pruebas se basan en la capacidad de los hemiacetales y aldehídos de reducir

las sales cúpricas a óxido cuproso, generalmente en medio alcalino, en el que los compuestos se
encuentran disueltos o complejados con tartrato, citrato, etc.
La adición de una base diluída cataliza el tautomerismo ceto-enol, de forma que aldohexosas en
solución, como la glucosa, resultan en la formación de una mezcla de glucosa, fructosa y manosa:
23
Figura 5. Reaccion de Molisch
Entre las pruebas que identifican azúcares reductores, se encuentra la prueba de Benedict. Esta
prueba se lleva a cabo en condiciones levemente alcalinas y es una prueba muy sensible. La
formación de un precipitado de óxido de cobre es el criterio para que la prueba sea positiva. Esta
prueba no es específica para azúcares, pues los aldehídos en general pueden oxidarse en las
condiciones de la reacción.
Figura 6. Reacción de Benedict
La prueba de Barfoed, aunque utiliza básicamente el mismo procedimiento, sirve un fin

distinto; aquí el cobre está en una disolución débilmente ácida, de forma que en el tiempo de la
reacción (10 minutos) sólo los monosacáridos reducirán los iones cúpricos del reactivo pues, pues
por ser moléculas más pequeñas, tienen mayor reactividad. Si el tiempo de calentamiento se
prolonga, los disacáridos pueden hidrolizarse y los monosacáridos resultantes pueden ya dar la
prueba positiva. La sacarosa, que no es reductora, puede dar resultados equívocos debido a la
labilidad de su molécula, que en parte se hidroliza a fructosa y glucosa.
Las reacciones de Bial y Seliwanoff se basan, al igual que la de Molisch, en la formación de

furfural o sus derivados en caliente. En la prueba de Bial este furfural reacciona con orcinol dando
compuestos coloridos cuando el monosacárido es una pentosa. En la reacción de Seliwanoff, es
el resorcinol el que se combina con los derivados del furfural, lo que permite identificar
cetohexosas.
24
La prueba de yodo se basa en que una solución de yodo-yoduro forma complejos coloridos con
los polisacáridos, de diferente color según su estructura química: azul para almidón, rojizo para
glucógeno. La correcta identificación de un azúcar desconocido, tanto en disolución como en una
muestra sólida es un problema que puede ser banal o muy complejo, dependiendo del tipo de
muestra, de su supuesta composición aproximada y de si es una muestra pura o compleja. En
este experimento, se identificarán muestras puras de modo que las dificultades se minimicen.
Tubos de ensaye α-naftol

Micropipeta 1000 uL Carbonato de sodio
Puntas Citrato de sodio
Parrilla Sulfato de cobre II
Guantes de latex Acetato cúprico
Acido acético glacial
Orcinol
HCl concentrado
Cloruro ferrico
Resorcinol
Yoduro de potasio
Yodo sublimado
H2SO4 concentrado
NaCl
Propósitos
 Identificar diversos carbohidratos en base a reacciones específicas de carbohidratos

azúcares reductores, pentosas, cetohexosas, etc.
Procedimiento
Prueba de Molisch
1. En un tubo de ensaye se agrega 1 ml de la solución problema

2. En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua. (este tubo será el blanco)
3. Adicionar, a ambos tubos, 0.5 ml del reactivo de Molisch y agitar perfectamente
4. Añadir unas gotas de H2SO4 concentrado, resbalando por las paredes del tubo y
observar la coloración.
5. Si aparece un anillo color violeta en la interfase de los líquidos la prueba es positiva.
Prueba de Benedict

2. En otro tubo de ensaye, se agrega 1 ml de agua (este tubo será el blanco)
3. Añadir, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Benedict y agitar perfectamente
4. Dejar en baño de agua hirviendo por unos minutos.
5. La reacción es positiva si aparece un precipitado rojo-amarillo.
Prueba de Barfoed
25
3. Agregar, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Barfoed y agitar perfectamente
5. La reacción es positiva si aparece un precipitado rojo-amarillo.
Prueba de Bial

3. Añadir, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Bial y agitar perfectamente
5. La reacción es positiva si aparece una coloración verde-azul.
Prueba de Seliwanoff

3. Agregar, a ambos tubos, 1 ml del reactivo de Seliwanoff y agitar perfectamente
5. La reacción es positiva si hay precipitación de color rojo.
Prueba de Yodo
1. Colocar 0.25 ml de solución de carbohidrato.

2. Añadir 2 ml de solución de NaCl al 1% y dos gotas de solución de
3. Yodo-yoduro. Observar la coloración; si es azul obscuro la prueba es positiva. Si es rojiza, es
glucógeno.
Cuestionario
1. Escribe las estructuras de 2 aldohexosas y 2 aldopentosas. Dos cetohexosas y 2

cetopentosas.
2. Represente la formación del hemiacetal de la glucosa (abierta) y en su forma

piranosica.
3. Escribe el nombre IUPAC de los siguientes disacáridos

a. Sacarosa
b. Lactosa
c. Maltosa
4. Explica que es un azúcar reductor y cómo actúa el reactivo de Benedict.
5. Investiga cual es la reacción de enolización que se lleva a cabo en los azúcares como la
glucosa.
6. Elabora un cuadro con los resultados de las reacciones realizadas.
7. Reporta que sustancia (s) encontraste en el problema dado.
26
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
 Horton, H.R. et al. 1995. BIOQUÍMICA. México: Prentice Hall

 Hernández M., L. R. 1979. BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL. México: Limusa.
 Ortega D., M.L.; Hernández U., H.Y. 1986. MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA.
México: Colegio de Postgraduados.
 Santos M. A.; Esparza T., F. 1995. MANUAL DE PRÁCTICAS DE QUÍMICA Y
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS. México: U.A.CH.
 Alemany L., M.; Fonts., S. 1983. PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA. España: Alhambra.
27
Practica 4: Identificación de aminoácidos; Cromatografía de capa delgada
Introducción
El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos
nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas
complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas
bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye
una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico
en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de
filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo
(cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).
Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las distintas
biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas propiedades podríamos
citar:
i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos.

ii) Diferencias en tamaño y forma.
iii) Diferencias en carga.
iv) Diferencias en afinidad por otras biomoléculas.
Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas
por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerza iónica e hidrofobicidad.
De forma general, en las técnicas cromatográficas existe una distribución de las moléculas entre
dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y
la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta.
Cromatografía de reparto
En la cromatografía de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una

distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las
moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas
de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase
estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado
pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción.
La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se

encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se
distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas.
Dicho fenómeno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto,

que es la relación entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la
cromatografía de reparto tenemos un soporte inerte al que está unida la fase estacionaria líquida.
La mezcla a separar junto con la fase móvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad.
En dicho avance, la fase móvil arrastrará consigo un porcentaje de moléculas de cada

componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia
recorrida por cada uno de los componentes de la muestra dependerá de la cantidad de solvente o
eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si éstos son
diferentes aquélla también lo será, siendo posible la separación si se utiliza el volumen de
28
eluyente apropiado. En su desplazamiento, las moléculas de soluto se distribuirán no
puntualmente, sino formando un área debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y
a otros fenómenos tales como la difusión.
En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón,

celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden
generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte,
debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como
fuerza de frenado.
La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado;

éste recubre las partículas del soporte y es retenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio
entre las partículas del soporte será utilizado por la fase móvil para su desplazamiento. Debemos
de tener en cuenta que como fase móvil se suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que
separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias
polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la
móvil, suele ser por lo general hidrofílica, aunque también pueden utilizarse compuestos
hidrófobos.
Cromatografía en capa fina
En la cromatografía en capa delgada, CCD o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminología

inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas
y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de
sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa,
poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de
compuestos no polares (lípidos, por ejemplo).
En la CCD, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma

uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales
suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos
especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la
suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse
secar antes de su utilización.
Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican

puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El
volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación de los
componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o
compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una cantidad muy
pequeña (rango de µl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a
saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica.
Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para
asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de interés. En este caso conviene hacer la
aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición hasta
haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy
grande, distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de
aplicación).
Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque
cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un
disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la
29
línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un
reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas
(coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro
extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada
compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se
determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el
correspondiente valor de Rf.
La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en
base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos
específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar
comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química
conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un
método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y
extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado.
Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil,
que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y
algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya
finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola
dirección, la CCD puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una
única muestra, que se dispone en uno de los vértices de la placa y se eluye dos veces,
normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares.
La CCD presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas, como

es la de papel, tales como las siguientes:
i) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas.

ii) Una mayor velocidad de separación.
iii) Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes.
iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy
simple.
La mayor resolución obtenida por CCD se debe a que pueden formarse partículas muy finas
del soporte, por lo que la relación superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran
área superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se
puede aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografía en
papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a
aumentar la difusión de las moléculas.
Reacciones coloreadas de aminoácidos
Los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos se basan en la reacción específica

de éstos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formación de color se
toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es
indicativo de que no está presente. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también
denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente
adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo la determinación cualitativa de
aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden
también ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas.
Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y
cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten
30
discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de
aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos
aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptófano; reacción con
el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados
(cisteina; reacción con nitroprusiato sódico). En todos los métodos, el aminoácido reacciona con
otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por
espectroscopía visible.
De todos los métodos reseñados, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino
libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo
(ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1).
Figura 1. Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.
La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un
compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la
prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está
sustituido). El derivado coloreado presenta máximo de absorción en torno a 570 nm.
La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas

primarias (R-CH2-NH2) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se
libera CO2. La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas
de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones
procedentes de otras técnicas de separación. La presencia de aldehídos resultantes de la
degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas condiciones,
el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.
Gradillas con tubos de ensayo. Glutamato.

Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 y 25,0 Glicina.
ml). Lisina.
Propipetas. Prolina.
Micropipetas 1000 uL Leucina.
Puntas Solución problema de aminoácidos.
31
Probetas (100 y 250 ml). Etanol.
Vasos de precipitado (100 y 500 ml). Hidróxido amónico.
Frasco lavador con agua destilada (piseta) Silica gel en polvo
Recipientes de muestras biológicas de 50 ml. Ninhidrina
Papel de filtro.
Capilares para aplicar muestras.
Papel de parafilm..
Pipetas Pasteur de plástico.
Guantes de látex.
Frascos pulverizadores.
Tijeras.
Secadora de pelo.
Caja de portaobjetos (usados)
Agitador de tubos (vórtex)
Cámara cromatográfica
Frasco atomizador
Propósitos
1. Separar diferentes aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice.
2. Revelar las corridas de aminoácidos mediante la reacción coloreada con la ninhidrina.
3. Calcular el valor de Rf para cada uno de los aminoácidos.
4. Justificar las diferencias en Rf de los distintos aminoácidos.
5. Identificar la naturaleza de aminoácidos desconocidos.
Procedimiento
Paso primero
Sobre una placa de silicagel de 20 x 20 cm se traza con un lápiz una recta paralela a uno de los
bordes y a una distancia de éste de 2 cm. Sobre esta línea se pone 6 puntos equidistantes entre
si y sobre los bordes.
ADVERTENCIAS: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que la
contaminaríamos con aminoácidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolígrafo ni
rotulador. No horadar la placa cuando la marques.
Paso segundo
En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminoácidos) se aplicarán tres
gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un aminoácido en cada punto y en el
último la solución problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con
mucho cuidado). Se seca con un secador de pelo después de haber aplicado cada gota. Se
marca con lápiz, y en el extremo opuesto de la placa, algún indicativo del grupo que realiza la
cromatografía.
Paso tercero
Se añade a la cámara cromatográfica eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que
éste alcance la zona de aplicación de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se
deja desarrollar la cromatografía hasta que el eluyente alcance el borde superior, sin llegar a
sobrepasarlo (2-3 h aproximadamente).
32
ADVERTENCIA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es tóxico.
Paso cuarto
Terminada la cromatografía se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se

seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un
atomizador que contiene la solución reveladora (en la campana de gases). La placa se secará
haciéndole llegar aire caliente con el secador.
ADVERTENCIA: Esta operación debe de hacerse en la campana extractora de gases.
Cuestionario
1. Explica la diferencia entre cromatografía de partición (de reparto) y cromatografía de

adsorción
2. Explica la importancia que tiene la polaridad del eluyente con respecto a los compuestos
que se desean separar
3. ¿Cuales son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa delgada?
4. ¿Qué otros agentes reveladores a parte de la ninhidrina son de uso común en la

cromatografía de capa fina?
5. Describe a detalle el principio de funcionamiento de las siguientes cromatografías:

a. Cromatografía en columna
b. Cromatografía de gases
c. HPLC
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
• Smith I, Feinberg JG (1965) “Paper & Thin Layer Chromatography and

Electrophoresis”. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histórico de la técnica y
aplicaciones.
• Bermúdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceño I, Prieto JC, Arrieta L Propuesta

para un protocolo de diagnóstico de homocistinuria.
ANEXO 1: SOLUCIONES
33
1. Soluciones de los distintos aminoácidos (glutamato, glicina, lisina, prolina y
leucina) al 1%
Solución de aminoácido al 1 %
100 ml
Aminoácido 1g
n-Propanol 10 ml
Agua destilada Hasta 100 ml
2. Solución eluyente
2.1. Solución de hidróxido amónico al 34 %
Solución de hidróxido amónico

100 ml
Hidróxido amónico 34 g
2.2. Solución eluyente (etanol: hidróxido amónico, en una proporción 7:3)
Solución de eluyente
200 mL
Etanol 210 mL
Solución de hidróxido amónico 90 mL
3. Solución reveladora (se prepara el día de uso)
Solución de ninhidrina
100 ml
Ninhidrina 0,2 g
34
Practica 5: Cuantificación de Proteínas I: Elaboración de curva patrón
Introducción
La luz es una forma energética que presenta un comportamiento tanto de partícula como de
onda. En éste último comportamiento, puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda
dentro del espectro electromagnético (Fig. 1).
Fig. 1. Clasificación de la luz dentro del espectro electromagnético.
La luz con una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta,
mientras que aquella que posee una longitud de onda más larga, entre 700 nm y 900 nm se
conoce como luz infrarroja cercana.
La luz con longitudes de onda de entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de
diferentes colores visible al ojo humano. ¿Qué ocurre cuando una radiación electromagnética
atraviesa la materia? Si la radiación tiene energía adecuada con la estructura de la materia,
ésta última podrá absorberla.
La medición de la cantidad de luz absorbida puede ser usada para detectar, identificar
moléculas y medir su concentración en solución. Esta medición se basa en la Ley de Lambert-
Beer o simplemente Ley de Beer.
Esta ley establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la

cantidad de energía radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al
logaritmo de la energía radiante transmitida por la sustancia. Considérese un rayo de energía
radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio
cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta
longitud de onda (Fig. 2).
35
Fig 2. Transmisión de energía radiante a través de una celda de vidrio, donde Io representa la intensidad de la luz incidente e l1 representa la
intensidad de luz transmitida
La intensidad de la energía radiante transmitida I1 es menor a la intensidad inicial lo debido

precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta cantidad de energía radiante. La
transmitancia para un compuesto en solución es definida como la proporción de luz incidente que
es transmitida (T):
Esta proporción generalmente es expresada como un porcentaje de la siguiente forma:
El concepto de transmitancia es importante porque solo la luz transmitida, no la

absorbida, puede ser medida directamente en el laboratorio.
Conforme la concentración del compuesto en solución aumenta, más luz será absorbida por el
mismo y por lo tanto menos luz será transmitida. El porcentaje de transmitancia (%T) varía de
forma inversa y logarítmica con respecto a la concentración (Fig. 3B). A esta relación se le
llama absorbancia o A. La relación entre absorbancia (A) y Transmitancia (T) es la siguiente:
( )
( )
Para convertir T en %T, tanto el denominador como el numerador deben ser multiplicados por
36
100:
( )
( ) ( )
( ) Ec. (1)
Mediante esta transformación matemática se obtiene entonces una relación entre la

absorbancia y el porcentaje de transmitancia.
En el laboratorio, una vez determinado el porcentaje de transmitancia, éste se transforma a

absorbancia, la cual, según la ley de Beer es directamente proporcional a la concentración de
una sustancia, como se observa en la Figura 3A. La mayoría de los instrumentos utilizados hoy
en día para estas determinaciones, llamados espectrofotómetros, realizan esta conversión
automáticamente, de forma tal que el valor reportado es la absorbancia, no la transmitancia.
Fig. 3. A) Representación gráfica de la relación que existe entre la absorbancia (A) y la concentración de un analito, según lo establece la ley
de Lambert-Beer. B) Representación grafica de la relación que existe entre la concentración de un analito y el porcentaje de transmitancia
(%T).
La mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color. Por lo tanto es

necesario acoplar algún tipo de reacción química que involucre la aparición o desaparición de un
cromógeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo
coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por
tanto la técnica tendrá mayor sensibilidad.
El siguiente paso es corroborar bajo qué condiciones se cumple la ley de Beer, es decir
cuál es la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son
las adecuadas.
Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestión a diferentes concentraciones.

Las soluciones de concentración conocida que se preparan para este propósito se conocen
como patrones o estándares. La relación absorbancia versus concentración debe generar un
gráfico que demuestre una línea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas
es cero (Figura 3A).
Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de una
solución midiendo su absorbancia y despejando dicho valor en la ecuación de la recta.
37
La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones
de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la
concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando:
1. La concentración de la solución a medir es muy elevada.

2. La luz incidente no es monocromática.
3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en
solución que se desea medir.
4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar.
5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos.
6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las
especies “competirán” entre sí por la luz, cada una con diferente absortividad.
Cada uno de los puntos mencionados anteriormente puede evitarse haciendo un uso correcto del
espectrofotómetro como se enseñará en la práctica de laboratorio de hoy, además de una buena
aplicación de la teoría de la ley de Beer en la práctica.
En el caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta situación es diluyendo la muestra a
cuantificar. En el caso del punto dos, es necesario tener una buena fuente de energía radiante.
La mayoría de los instrumentos de buena calidad la poseen hoy en día.
Para el punto tres, es necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es
significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinación
espectrofotométrica el blanco reactivo.
El blanco reactivo es una muestra más que contiene todos los componentes utilizados para la
determinación (por ejemplo agua, reactivo, etc) excepto el compuesto a medir (ver sección de
procedimiento). La cantidad de luz transmitida por este blanco no debe ser detectada por el
aparato. Para ello, el espectrofotómetro se ajusta manualmente de forma tal que esta
cantidad de luz no sea medida.
Este procedimiento se conoce comúnmente como “calibración del cero”, es decir, la cantidad de
absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero por el aparato. En el caso del
punto cuatro, es necesario asegurarse de que no existan otras fuentes de luz cercanas cuando
se hace la medición.
Para evitar la situación expuesta en el punto cinco, se deben utilizar celdas certificadas, las
cuales son hoy en día fáciles de conseguir a un precio razonable. Por último, para evitar el
aspecto mencionado en el punto seis, es necesario asegurarse de que el compuesto a medir se
encuentre en solución de forma pura o en presencia de otros compuestos que no absorben a la
misma longitud de onda.
Es también imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de luz ultravioleta es

necesario utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe luz a esas longitudes de onda.
Las proteínas son una clase importante e insustituible de macromoléculas celulares presentes en
todos los organismos vivos. En consecuencia, la importancia para medir sus
concentraciones es vital para la biotecnología.
Son las macromoléculas más versátiles de los sistemas vivos y desempeñan funciones cruciales
en prácticamente todos los procesos biológicos. Funcionan como catalizadores, que
transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y
38
protección inmunológica, generan el movimiento, transmiten impulsos nerviosos, y controlan el
crecimiento y diferenciación celular.
Varias propiedades clave de las proteínas les permiten participar en esta tan amplia gama de
funciones:
1. Las proteínas son polímeros lineales construidos de unidades monoméricas llamadas

aminoácidos. Notablemente, las proteínas se pliegan en forma espontánea en
estructuras tridimensionales que son determinadas por la secuencia de aminoácidos en
la proteína polimérica.
2. Las proteínas contienen una amplia gama de grupos funcionales. Estos grupos
funcionales incluyen alcoholes, tioles, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas, y
una variedad de grupos de base. Cuando se combinan en varias secuencias, este
conjunto de grupos funcionales determina el amplio espectro de la función de la
proteína. Por ejemplo, la reactividad química asociada con estos grupos es esencial
para el funcionamiento de las enzimas (las proteínas que catalizan reacciones
químicas).
3. Las proteínas pueden interactuar entre sí y con otras macromoléculas biológicas para
formar conjuntos complejos. Estos complejos son las máquinas macro-moleculares
que llevan a cabo la réplica exacta de DNA, la transmisión de señales dentro de las
células, y muchos otros procesos esenciales.
4. Algunas proteínas son muy rígidas, mientras que otras muestran una flexibilidad
limitada, pueden funcionar como elementos estructurales en el citoesqueleto (el
andamiaje interno dentro de las células) o en el tejido conectivo. Las partes de las
proteínas con una flexibilidad limitada puede actuar como bisagras, resortes o
palancas que son cruciales para la función de la proteína.
Un método para cuantificar proteínas es el desarrollado por Biuret y colaboradores. La

reacción de Biuret involucra un agente que contiene iones de cobre (Cu ++) en solución alcalina.
Las moléculas que contienen 2 o más enlaces peptídicos se pueden asociar a los iones de cobre
para formar un complejo de coordinación organometálico que imparte un color púrpura
azulado a la solución (Fig. 4). Tal complejo absorbe a 540 nm y puede ser cuantificado con un
espectrofotómetro.
Fig. 4. Complejo de coordinación tetravalente formado por las proteínas en presencia del reactivo de Biuret.
39
2 Matraces erlenmeyer de 100 ml. Reactivo de Biuret

2 Vasos de precipitados de 100 ml. Albunima de suero de bovino
5 Matraces volumétricos de 10 ml.
2 Pipetas volumétricas de 2 ml.
1 Perilla.
1 Espectrofotómetro.
2 Celdas para espectrofotómetro.
Propósitos
1. Aprender el método espectrofotométrico (Biuret) para la cuantificación de proteína total

en muestras biológicas.
2. Cuantificar el contenido de proteínas en diferentes muestras biológicas
3. Desarrollar habilidad en el manejo de muestras biológicas
Procedimiento
Preparar 100 ml de una solución de albumina al 2% (solución concentrada)
 Pesar 2 g de albumina en la balanza analítica y agregar a un matraz a forado de 100 ml

 Agregar 50 ml de agua destilada y agitar hasta disolver completamente
 Aforar
Preparación de las diluciones seriadas
Preparar 5 diluciones seriadas 1:2 a partir de la solución concentrada
Primera dilución (1:2)
 Tomar 5 ml de la solución concentrada y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.
Segunda dilución (1:4)
 Tomar 5 ml de la solución 1:2 y transvasar a un matraz de 10 ml, aforar.
Tercera dilución (1:8)
Cuarta dilución (1:16)
Quinta dilución (1:32)
Calcular la concentración de las diluciones y llenar la siguiente tabla

40
Dilución [proteina] (%) [proteína] (mg/ml) [proteína] (g/L)
Sol concentrada 2 20 0.2
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
Lectura en el espectrofotómetro
Preparación del blanco
 En un tubo de ensaye mezclar 2 ml de reactivo de biuret más 1 ml de agua destilada
 Agitar con el vortex y esperar 5 minutos
 Ajustar la absorbancia a cero en 540 nm con este blanco
Preparación de los estándares
• En 6 tubos diferentes (del 1 al 6), agregar 2 ml de reactivo de biuret y 1 ml de la solución

concentrada y de cada dilución.
• Agitar con el vortex y esperar 5 minutos
• Leer a 540 nm
• Realizar por triplicado
# tubo Dil. Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs prom [proteína] (mg/ml)

1 Conc
2 1:2
3 1:4
4 1:8
5 1:16
6 1:32
Graficar [proteína] vs. Abs (Abs x) y realizar la regresión lineal.
Cuestionario
1. Escribir la ecuación de regresión, compárala a la de los otros equipos.
2. ¿Qué representa la variable y?
3. ¿Qué representa la variable x?
4. ¿Cuál sería la absorbancia de un solución cuya concentración de proteína fuera 1.5

mg/ml?
5. Investiga cual es la linealidad y sensiblilidad del método.
41
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
• Stryer L. Biochemistry. Protein Structure and function. Edit. W.H. Edit. Freeman and
Company, 5a Edición.
• Walker J.M. The Protein Protocols Handbook. The Lowry Method for Protein
Quantitation. Edit. Humana Press 2002.
42
Practica 6: Cuantificación de Proteínas II; Muestras problema
Introducción
Las proteínas son una clase importante e insustituible de macromoléculas celulares presentes en
todos los organismos vivos. En consecuencia, la importancia para medir sus
concentraciones es vital para la biotecnología.
Son las macromoléculas más versátiles de los sistemas vivos y desempeñan funciones cruciales
en prácticamente todos los procesos biológicos. Funcionan como catalizadores, que
transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y
protección inmunológica, generan el movimiento, transmiten impulsos nerviosos, y controlan el
crecimiento y diferenciación celular.
Varias propiedades clave de las proteínas les permiten participar en esta tan amplia gama de
funciones:
1. Las proteínas son polímeros lineales construidos de unidades monoméricas llamadas

aminoácidos. Notablemente, las proteínas se pliegan en forma espontánea en
estructuras tridimensionales que son determinadas por la secuencia de aminoácidos en
la proteína polimérica.
2. Las proteínas contienen una amplia gama de grupos funcionales. Estos grupos
funcionales incluyen alcoholes, tioles, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas, y
una variedad de grupos de base. Cuando se combinan en varias secuencias, este
conjunto de grupos funcionales determina el amplio espectro de la función de la
proteína. Por ejemplo, la reactividad química asociada con estos grupos es esencial
para el funcionamiento de las enzimas (las proteínas que catalizan reacciones
químicas).
3. Las proteínas pueden interactuar entre sí y con otras macromoléculas biológicas para
formar conjuntos complejos. Estos complejos son las máquinas macro-moleculares
que llevan a cabo la réplica exacta de DNA, la transmisión de señales dentro de las
células, y muchos otros procesos esenciales.
4. Algunas proteínas son muy rígidas, mientras que otras muestran una flexibilidad
limitada, éstas pueden funcionar como elementos estructurales en el citoesqueleto o en el
tejido conectivo. Las partes de las proteínas con una flexibilidad limitada pueden
actuar como bisagras, resortes o palancas que son cruciales para la función de la
proteína.
Un método para cuantificar proteínas es el desarrollado por Biuret y colaboradores. La

reacción de Biuret involucra un agente que contiene iones de cobre (Cu ++) en solución alcalina.
Las moléculas que contienen 2 o más enlaces peptídicos se pueden asociar a los iones de cobre
para formar un complejo de coordinación organometálico que imparte un color púrpura
azulado a la solución (Fig. 1). Tal complejo absorbe a 540 nm y puede ser cuantificado con un
espectrofotómetro.
43
Fig. 1. Complejo de coordinación tetravalente formado por las proteínas en presencia del reactivo de Biuret.
1 Micropipeta de 1 ml Reactivo de Biuret

Puntas de para micropipeta de 1 ml Leche
10 tubos de ensayo de 5 ml Suero humano
1 gradilla Plasma humano
1 tubo para extracción de sangre humana Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 20%
sin anticoagulante (rojo) NaOH 1M
1 tubo para extracción de sangre humana HCl 1 M
con anticoagulante (morado o azul) Cultivo de E.coli en caldo
1 equipo de extraccion vacutainer Cultivo de S. cerevisiae en caldo
Papel filtro watman # 40 Cultivo de Penicillium sp en caldo
Estufa de incubación
1 Embudo Buchner
1 Matraz kitazato
1 Soporte universal
1 pinzas de tres dedos
1 Bomba de vacio
1 Centrifuga con velocidad de 3500 rpm
1 Piseta con agua destilada
Propósitos
 Aprender el método espectrofotométrico (Biuret) para la cuantificación de

proteína total en muestras biológicas.
 Cuantificar el contenido de proteínas en diferentes muestras biológicas
 Desarrollar habilidad en el manejo de muestras biológicas
Procedimiento
• Extracción del suero y plasma humano
44
 Solicitar al instructor realice la punción necesaria para la extracción de sangre total
de un voluntario en el equipo, las muestras se deben recolectar en los tubos con y
sin anticoagulante (rojo y morado).
 Esperar a que la muestra sin anticoagulante (rojo), coagule durante 15 min.
 Centrifugar ambos tubos a 3500 rpm
 Separar el plasma (sobrenadante del tubo morado) y el suero (sobrenadante del

tubo rojo) del paquete celular en dos diferentes tubos y rotular.
• Extracción de proteína de cultivos celulares
 24 horas antes de la practica

 Pesar un disco de papel watman # 40 y registrar el peso.
 Montar un sistema de filtración al vacío como se muestra en la Fig. 2
 Filtrar todo el contenido del tubo de cultivo.
 Lavar 3 veces con agua destilada.
 Recuperar el filtrado y secar durante 24 horas a 100° C
 Pesar la muestra.
 Con ayuda del peso del papel calcular el peso seco de la muestra.
Fig.2 Aparato para filtración al vacío
El día de la práctica
 A la masa seca obtenida en el punto anterior, agregarla en un tubo de 5 ml y adicionar 1

ml de HCl 1 M e incubar por 5 minutos a 100°C
 Agregar 1 ml de NaOH 1 M y agitar en el vortex
 Agregar 1 ml de SDS (Dodecil sulfato de sodio) al 20% y agitar con el vortex
 Llevar a ebullición por 5 min
 Centrifugar a 13,000 rpm
 Recolectar el sobrenadante en otro tubo de 5 ml
 Filtrar si el sobrenadante no es transparente
 Recolectar el filtrado o sobrenadante y rotular
• Lectura en el espectrofotómetro
 Prepara el blanco con 2 ml de reactivo de Biuret y 1 ml de agua destilada

 Calibrar a cero el equipo con el blanco
45
 En un tubo para cada muestra, tomar 2 ml de Rectivo de Biuret y mezclarlo con 1 ml de
muestra (plasma, suero o extracto celular) agitar con el vortex y esperar 5 min.
 Leer la absorbancia de cada muestra y registrar.
Cuestionario
1. Con ayuda de la ecuación de regresión de la práctica anterior, calcula la concentración de

proteína presente en cada muestra.
2. ¿Existe diferencia entre la cantidad de proteína presente en el suero y plasma

humano? Explica tu respuesta.
3. Expresa el contenido de proteína en las siguientes unidades:

a. mg/ml
b. mg/L
c. g/L
d. %
4. ¿Existe diferencia entre el contenido de proteína entre bacterias, levaduras y hongos

filamentosos? Explica tu respuesta.
5. Con estos resultados calcula el porcentaje de proteína presente en estos

microorganismos en peso seco.
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
46
Practica 8: Cinética Enzimática
Introducción
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especifidad de la enzima. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede
medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la
enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia
de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.
En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La

velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de
los reactivos
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del

tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la
reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación
se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0).
La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De

esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de
forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.
Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad

de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se
simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad
enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto
del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913,
Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de
velocidad que rige la acción enzimática.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración de sustrato sobre la

velocidad de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Para cada una de las
curvas de avance de reacción así obtenidas se calcula la v0 (la pendiente de la curva).
Posteriormente, se representa la velocidad inicial frente a la concentración inicial de sustrato (v0

frente a [S]0). Se observa que cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden con
respecto al sustrato. A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, es decir, todos
los centros activos están ocupados, y un incremento en [S]0 no se traduce en un incremento de la
velocidad. En este punto, la reacción es de orden cero con respecto al sustrato, y la velocidad es
máxima (Vmax).
6 Erlenmeyer 250 mL Urea

2 Vasos de precipitados altos de 100 mL Soluciones para calibración de pHmetro; pH
Pipeta graduada de 25 mL 4.0 y pH 7.0
47
Pipeta automática de 200 µL (0.2 mL) Disolución de Ureasa en Glicerol 50%, 1000
Probeta de 100ml U/ml
Conductímetro 500 ml de NaOH 0.2 M
Termómetro de -2 a 50 °C 500 ml de HCl 0.2 M
pHmetro 2 pisetas
Parrilla con agitación
Agitador magnético
Propósitos
1. Construir la gráfica típica de una cinética enzimática a partir de datos experimentales
2. Obtener las velocidades catalíticas de la ureasa con a diferentes concentraciones
3. Obtener las constates cinéticas Km y V max de la ureasa a 50°C y pH 7.2
Procedimiento
1. Preparar disoluciones de urea con arreglo al siguiente esquema:
Erlenmeyer Disolución [S] = Concentración (%) Preparació

1 1 0.4 0.4 g urea n+ 100 ml H2O
2 2 0.2 50 ml Disolución 1 + 50 ml
3 3 0.1 H2O
50 ml Disolución 2 + 50 ml
4 4 0.05 H2O
5 5 0.025 H2O
6 6 0.0125 H2O
H2O
2. Colocar 40 ml de la disolución 1 en un vaso de precipitados, ajustar el pH a 7.2 y la
temperatura a 50°C.
3. Añadir una barra magnética, colocar el vaso en el agitador e introducir el electrodo del
conductímetro.
4. Añadir 0.2 ml de disolución de ureasa.
5. Medir la conductividad de la disolución a los tiempos marcados en la tabla.
6. Repetir la operación con todas las disoluciones.
7. Ejercicio 1.- Rellenar todas las casillas de la siguiente tabla:
tiempo (s) C = Conductividad (u. a.)

0
15
30
45
60
90
48
120
150
180
210
240
Para calcular V (Velocidad inicial de la reacción), representar C frente a t, trazar una tangente en el origen y calcular
su pendiente. Hacer esto para todas las concentraciones y anotar los valores en las casillas correspondientes
[S] 0.4 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125

V
1/[S]
1/V
Cuestionario
1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de catálisis (reacción) de una enzima?
2. ¿Como afectan estos factores la velocidad de catálisis de una enzima?
3. Explica que es el sitio activo de una enzima
4. ¿Que es una enzima alostérica y como se regula?
5. Menciona y explica al menos 3 estrategias catalíticas que utilizan las enzimas
ALUMNO
DOCENTE
Referencias
49
Nuestra Ciencia comparada con la realidad sigue siendo primitiva e infantil, y
sin embargo, es lo mejor que tenemos.
Albert Einstein
50

Bioquimica Aplicada A La Biotecnología 1

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BIOQUÍMICA APLICADA A LA

DR. JOSÉ ALFREDO MIRANDA LÓPEZ

MTRO. RICARDO LÓPEZ FABRE

M. en C. MARIANO SÁNCHEZ CUEVAS

M. en C. MARÍA CRISTINA MIRANDA VERGARA

M. en C. ALFREDO CESAR BENÍTEZ ROJAS

NORMAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS ………………………….. 5

REGLAS DE LABORATORIOS DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS….....……. 6

PROPÓSITO DEL LABORATORIO…………………………………………………. 8

Práctica 1: Principios Básicos de laboratorio; uso de micropipetas y cálculos de

Practica 2: El agua como solvente polar……………………………………...……. 17

Practica 3: Identificación de carbohidratos.……………………………………….. 21

Práctica 4: Identificación de aminoácidos..………..……………..…………….…. 28

Práctica 5: Cuantificación de proteínas I…………………………………………… 35

Practica 6: Cuantificación de proteínas II.………..………………………………… 43

Práctica 8: Cinética enzimática………………………………………………..…........ 47

La biotecnología consiste en la manipulación de organismos vivos o de productos de organismos

Si bien no se ha dejado de elaborar pan, cerveza, cultivar papas y producir quesos, en la

Entre estas aplicaciones encontramos el uso de microrganismos como “fabricas” de metabolitos

Localizar los dispositivos de seguridad más próximos.

Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la

Desnaturalización de proteínas y DNA

Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de

REGLAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

3. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, después no se permitirá el acceso al

5. Mantener el orden durante el transcurso de la práctica y respeto a la clase y a los

6. Se formarán equipos permanentes de trabajo y las faltas de asistencia a alguna práctica no

13. No arrojar sólidos al lavadero o canales de desagüe.

 Tolerancia de 10 minutos para entrar al laboratorio. Después de este tiempo no se

 No se permite el uso de celulares durante las sesiones de laboratorio.

 El alumno se compromete a leer previamente las prácticas del laboratorio y contestar su

 El alumno que falte a la práctica de laboratorio pierde derecho a sus evaluaciones

Requisitos para hacer el reporte

 PROPOSITO: Conoce los propositos (propios del equipo) de la práctica

 RESULTADOS: Obtiene los resultados esperados (dibujos o valores)

 DISCUSIÓN FUNDAMENTADA: Discute los resultados y/o cambios que se obtuvieron en

FACILITAR AL ALUMNO DE BIOTECNOLOGÍA LA COMPRENSIÓN DE ALGUNOS

En el año de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de

La Conferencia General de Pesas y Medidas no recomienda el uso de la escala de pH y en su

 Los símbolos se escriben siempre en singular. Ejemplo: 2 mm y no 2 mms.

Uso correcto de las micropipetas.

1. Selección de la micropipeta a utilizar según el volumen a dispensar. Para este paso, se

1. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario seleccionar

4. Aspiración: apretar el botón pulsador hasta el primer tope.

5. Con la pipeta en posición vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra.

7. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido.

9. Apretar el botón pulsador suavemente hasta el primer tope y esperar un segundo.

12. Expulsar la punta apretando el botón del expulsor.

Para no dañar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:

 El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta

Cálculo y expresión de diluciones.

Ejemplo: una solución de urea cuya concentración es de 5 mg/ml es diluída 1/10. La

La ecuación más comúnmente utilizada para preparar soluciones es:

x(45 mol/l)= 500 ml(5 mol/l)

Materiales y equipo Reactivos

2. Identificar 5 series con 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubo/volumen 5 10 50 150 925

5. Pesar nuevamente los tubos eppendorf con el liquido

6. Por diferencia calcular el peso y volumen del liquido

Preparar por todo el grupo 50 ml de KMnO4 0.1 M

A partir de esta solución preparar una serie de diluciones 1:5 de 5 ml.

Tomar fotografías de los tubos con las diluciones.

1. ¿Por qué es importante contar con un sistema estandarizado de unidades? Fundamenta tu