Anda di halaman 1dari 13

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI PENGHAMBATAN ENZIM ELASTASE DAN UJI MANFAAT DARI


SEDIAAN EMULGEL YANG MENGANDUNG EKSTRAK WARU
KETEK (MYRICA JAVANICA BLUME)

PROTOKOL PENELITIAN

Disusun oleh :
Varda Arianti
1706125336

FAKULTAS FARMASI
PROGRAM STUDI MAGISTER HERBAL
DEPOK
JUNI 2019
PROTOKOL PENELITIAN

1. Judul:
Uji Penghambatan Enzim Elastase dan Uji Manfaat dari Sediaan Emulgel yang Mengandung
Ekstrak Waru Ketek (Myrica javanica Blume)

2. Tempat Pelaksanaan Penelitian:


Laboratorium Pengembangan Formulasi Farmasetika, Laboratorium Kimia Farmasi
Kuantitatif bertempat di Fakultas Farmasi Universitas Indonesia, Kampus UI Baru, Depok
16424, Jawa Barat, Indonesia.

3. Waktu Pelaksanaan
Juli – September 2019

4. Identitas Pengusul
Peneliti Utama
Nama : Varda Arianti
NPM : 1706125336
Program Studi : Magister Herbal
Institusi : Universitas Indonesia
Nomor HP : 085714220745/0895341635703

5. Latar Belakang
Aging atau penuaan adalah proses umum dari manusia di mana terjadi kehilangan elastisitas
kulit dan serat kolagen secara bertahap. Diatas usia 20 tahun gejala aging muncul sebagai konten
kolagen per unit area mulai menurun, ada 1% penurunan konten kolagen per unit area kulit setiap
tahun (Hooda, 2015). Penuaan kulit dipengaruhi oleh kombinasi faktor endogen atau intrinsik
(genetika, metabolisme seluler, hormon, dan metabolisme) dan eksogen atau ekstrinsik (paparan
cahaya kronis, polusi, radiasi pengion, bahan kimia, racun). Subjek mayoritas penelitian tentang
antipenuaan dan upaya untuk strategi estetika-antipenuaan yang berkaitan dengan kulit adalah tiga
komponen struktural utama dari dermis, yaitu kolagen, elastin, dan Glycosaminoglycans (GAGs)
(Ganceviciene et al, 2012).
Elastisitas dan kekencangan kulit diperoleh dengan adanya kolagen dan elastin pada lapisan
kulit. Kolagen dan elastin dipecah oleh adanya MMP-1 dan enzim elastase yang meningkat karena
adanya paparan sinar matahari yang berlebihan. Sinar UV yang diserap menyebabkan peningkatan
radikal oxygen species (ROS) dan menginduksi stress oksidatif. Jumlah ROS yang tinggi
meningkatkan aktivitas elastase. Peningkatan aktivitas enzim elastase memicu berbagai penyakit
seperti rheumatoid arthritis, cystic fibrosis, penyakit kronis jalur pernafasan, psoriasis,
penyembuhan luka yang tertunda dan penuaan kulit dini dengan pembentukan kerut. Oleh karena
itu, antioksidan dan antielastase dapat berpotensi menjadi kosmetik dalam memerangi penuaan
kulit (Azmi et al, 2014; Ndlovu et al, 2013).
Beberapa suku tanaman yang telah diteliti memiliki aktivitas penghambatan enzim elastase
yang baik antara lain Lauraceae (tanaman Machilus japonica, Machilus thunbergii), Cupressaceae
(tanaman Crytomeria japonica), Pentaphylacaceae (tanaman Cleyera japonica), Theaceae
(tanaman Camellia sasanqua), Anacardiaceae (tanaman Rhus javanica), dan juga termasuk
Myricaceae (tanaman Myrica rubra, Myrica carifera). Pada penelitian ekstrak daun dan kulit
batang Myrica rubra menghasilkan penghambatan enzim elastase masing-masing sebesar
78,4±1,7 % dan 45,3% (Moon et al, 2010) (Kim et al, 2007), dan extrak etanol 50% kulit akar
Myrica cerifera memberikan konsentrasi penghambatan enzim elastase (IC50) sebesar 192,7
μg/mL dan tanaman Myrica carifera telah dipatenkan sebagai antiaging (Tohi and Iwahashi,
2011).
Marga Myrica contohnya Myrica rubra juga memiliki efektifitas sebagai antioksidan,
antiinflamasi, antihiperpigmentasi, antivirus, antialergi, antikanker, antidiare, antimikroba dan
antidiabetes. Diketahui juga tanaman Myrica esculenta, Myrica faya dan Myrica gale memiliki
aktifitas sebagai antioksidan karena mengandung mengandung metabolit sekunder seperti
polifenol (seperti asam fenolik dan flavonoid) (Rawat et al, 2011; Spinola et al, 2014; Mathiesen
et al, 1995), dan beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa polifenol dan flavonoid
memiliki aktivitas kuat dalam menghambat aktivtas enzim dan antioksidan (Lee et al, 2001; Thring
et al, 2009). Beberapa senyawa yang terdapat pada genus Myrica dilaporkan memiliki aktivitas
penghambatan elstase antara lain myricetin, quersetin (Kanashiro et al, 2007). Dalam penelitian
ini akan menguji aktivitas antielastase dan uji manfaat sediaan emulgel yang mengandung ekstrak
Waru Ketek kepada kulit sukaelawan.

6. Tujuan Penelitian
Memperoleh aktifitas antielastase dan formulasi emulgel anti-aging yang mengandung
ekstrak etanol Waru Ketek yang stabil dan menjamin keamanan serta manfaat dari emulgel sebagai
anti-aging setelah diaplikasikan langsung kepada kulit sukarelawan.

7. Tinjauan Pustaka
Penuaan merupakan suatu proses yang sangat kompleks dimana beberapa teori juga
menjelaskan bahwa manifestasi seluler proses terjadinya penuaan juga dipengaruhi oleh factor
reactive oxygen species (ROS) yang dihasilkan dalam sel. ROS adalah produk sampingan dari
respirasi aerobik yang terlibat dalam beberapa modifikasi reaksi seluler seperti paparan logam
berat, radiasi pengion maupun zat oksidan. Secara normal, ROS dapat dihilangkan oleh adanya
antioksidan endogen seperti superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutathione
peroxidase (GPx ) dan glutathione 6ocal6ura (GR). Akan tetapi oksidatif stress terjadi ketika
keseimbangan antara oksidan dan antioksidan dalam tubuh berubah oleh karena peningkatan ROS
dan penurunan antioksidan dari dalam tubuh maka akan dapat menyebabkan kerusakan sel dan
juga akan mempengaruhi penuaan pada kulit (Jia et al., 2014; Kim et al., 2016).
Penghambatan proses penuaan dapat dilakukan dengan menggunakan produk anti-aging yang
mengandung bahan alam. Pada tanaman terdapat senyawa-senyawa polifenol yang berperan.
Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat ini memiliki tanda khas
yakni memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Polifenol memiliki spektrum luas dengan
sifat kelarutan pada suatu pelarut yang berbeda-beda. Hal ini disebabkan oleh gugus hidroksil pada
senyawa tersebut yang dimiliki berbeda jumlah dan posisinya. Turunan polifenol sebagai
antioksidan dapat menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang
dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas.
Polifenol merupakan komponen yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan dalam
buah dan sayuran (Hattenschwiler dan Vitousek, 2000).
Tanaman Myrica telah dilakukan penelitian terkait dengan potensi mereka untuk bertindak
pada berbagai efek stress oksidatif yang penting menjadi sumber antioksidan. Isolasi dari tanaman
Myrica telah dilakukan pengujian aktivitas antioksidannya (Silva et al, 2015).
Emulgel adalah sediaan emulsi m/a atau a/m yang dicampurkan dengan gelling agent.
Emulgel memiliki stabilitas yang baik, karena stabilitas dari emulsi ditingkatkan dengan
penambahan gelling agent. Emulgel dapat digunakan sebagai pembawa untuk berbagai zat
termasuk zat-zat yang bersifat hidrofob. Untuk senyawa yang bersifat hidrofob pembuatan menjadi
sediaan emulgel dianggap lebih mudah dilakukan dibandingkan menjadi sediaan gel karena
masalah kelarutannya dalam air. Senyawa hidrofob dalam suatu emulgel dibuat dengan
melarutkannya dalam fasa minyak yang kemudian didispersikan dalam fase air yang bercampur
dengan gelling agent (Panwar et al, 2011).

8. Metode Penelitian
8.1 Populasi Penelitian
Populasi pada penelitian ini adalah wanita sehat memiliki rentang usia 30 sampai 45 tahun.
Panelis memiliki kulit yang sehat dan normal.

8.2 Kriteria Sampel Penelitian


a. Kriteria Inklusi
1. Wanita usia 30 – 45 tahun yang memiliki kulit sehat dan normal
2. Sudah dijelaskan mengenai pemeriksaan yang akan dilakukan dan menandatangani
informed consent.
3. Subjek penelitian bersedia untuk tidak menggunakan produk topikal apapun selain produk
uji, 2 minggu sebelum penelitian dan selama penelitian berlangsung
b. Kriteria Eksklusi
1. Panelis memiliki riwayat alergi atopi dan asthma
2. Panelis menderita kelainan kulit kronis ( psoariasis, SLE )
3. Panelis menderita penyakit sistemik ( hipertensi, diabetes mellitus, gagal ginjal kronis,
kanker )
8.3 Kriteria Putus Uji
Bila timbul efek samping serius selama masa penelitian, maka subjek penelitian akan
dikeluarkan dari penelitian. Namun, tetap dilakukan pencatatan mengenai keluhan yang dialami
subjek dan kelainan dari pemeriksaan fisik yang kita lakukan.
Subjek penelitian juga dianggap putus uji jika tidak datang ke tempat penelitian. Kriteria ini
juga berlaku pada subjek yang memilki data yang tidak lengkap. Terminasi penelitian dilakukan
bila subjek penelitian telah selesai mengikuti prosedur penelitian yang telah ditetapkan.

8.4 Besaran Sampel


Besaran sampel yang disarankan untuk penelitian eksperimental yang menggunakan
kelompok kontrol dan uji adalah 10 sampai 20 orang untuk masing – masing kelompok (Taniredja
& Mustafidah, 2012 ).Pada penelitian ini ditentukan jumlah sampel untuk masing – masing
kelompok adalah 13. Besarnya sampel untuk mengantisipasi kemungkinan putus uji pada
penelitian klinis adalah 10% (Sastroamoro & Ismael,2011), maka besaran sampel total yang untuk
masing – masing kelompok pada penelitian ini adalah 15 orang.
Rumus untuk besaran sampel adalah :

ń= n
(1-f)
Keterangan :
ń : besar sampel total
n : besar sampel yang ditentukan
f : perkiraan proporsi drop out

8.5 Uji Keamanan


Sebelum uji manfaat dilakukan terlebih dahulu dilakukan uji iritasi pada subjek penelitian
dengan menggunakan metode patch test berdasarkan Collipa Guidelines 1997. Patch test yang
digunakan adalah finn chambers.Sediaan yang diuji yaitu sediaan yang mengandung basis saja
(kontrol negatif) dan sediaan yang mengandung ekstrak Waru ketek (Myrica javanica Blume)..
Area lengan yang digunakan untuk uji adalah area volar lengan atas. Kulit yang akan ditempel
dengan patch tester dipastikan harus bebas dari dermatitis, keratosis seboroik, jarungan parut,
nevus, tato, terlalu dekat dengan dermatitis yang ada, bebas dari rambut yang lebat, dan bersih dari
kosmetik. Subjek penelitian dilarang melakukan aktivitas berlebih selama pengujian berlangsung
untuk menghindarkan patch tester terlepas. Adapun langkah pengujian adalah sebagai berikut :
1. Kontrol negatif dan basis emulgel ekstrak diletakan dalam chamber yang terpisah. Setelah
ditempel di lengan subjek, patch tester ditutup dengan plester adhesif. Hal ini dilakukan
untuk menjaga patch tester dari kerusakan.
2. Hari pertama pengujian dilakukan pengamatan pada menit ke 30 setelah penempelan.
3. Chamber diangkat pada hari ke 2. Hasil dinilai pada menit ke 15 dan 30 berikutnya.
Kemudian chamber ditempelkan kembali pada tempat yang sama selama 24 jam.
4. Pada hari ke 3 chamber diangkat dan dilakukan penilaian pada menit ke 15 dan 30.
Kemudian chamber ditempelkan kembali.
5. Pada hari keempat dinilai eritema dan edemanya sesuai Tabel 1.1

Tabel 1.1.Penilaian reaksi eritema dan edema


Eritema Nilai Edema Nilai
Tidak ada eritema 0 Tidak ada edema 0
Sedikit eritema 1 Edema sangat ringan 1
Eritema tampak jelas 2 Edema ringan (tepi dan 2
Eritema sedang-kuat 3 pembesaran jelas )
Eritema parah 4 Edema sedang 3
(tebal ± 1mm)
Edema parah 4
(tebal > 1mm)

[sumber : Tardiff,Hubner,&Graves,2003]

Hasil skoring yang didapat dari tabel 1.1 selanjutnya diolah untuk memperoleh Primary
Irritation Index for Human (PII). Nilai yang didapat akan disimpulkan sesuai dengan kriteria pada
tabel 1.2. Adapun perhitungannya sebagai berikut,
PII = jumlah total eritema dan edema pada jam ke- 24 dan 48
Jumlah sukarelawan x jumlah waktu pengamatan
Tabel 1.2. Indeks Iritasi Primer
Kategori Indeks Iritasi Primer
Tidak berarti 0 – 0,4
Iritasi ringan 0,5 – 1,9
Iritasi sedang 2 – 4,9
Iritasi berat 5-8

[sumber : Tardiff,Hubner,&Graves,2003]

8.6 Uji Manfaat


Uji manfaat dilakukan dengan cara pengukuran persentase elastisitas dan kelembaban dengan
menggunakan alat skin analyzer EH 900 U. Subjek penelitian yang mengalami iritasi pada hasil
uji keamanan dianggap putus uji. Pengukuran dilakukan pada area volar lengan atas. Subjek dibagi
menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol ( basis emulgel ) dan kelompok uji (emulgel ekstrak
). Adapun prosedur uji manfaat sediaan adalah sebagai berikut :
1. Pengujian dilakukan setiap 1 minggu sekali selama 4 minggu. Sebelum pengujian ( Hari-0
) dilakukan pengukuran dengan skin analyzer terlebih dahulu untuk memperoleh data
baseline.
2. Sepuluh menit sebelum dilakukan pengukuran, area yang akan diukur dibersihkan dengan
alcohol pad terlebih dahulu.
3. Subjek tidak mengetahui perbedaan isi sediaan
4. Pengolesan gel dilakukan satu kali sehari pada malah hari sebelum tidur dan masing –
masing subjek mendapat 1 tube sediaan 15 gram.
5. Setiap hari sukarelawan melakukan pengolesan sediaan yang diberikan dan mencatat
waktu pengolesan pada lembar laporan harian.
Prosedur penggunaan Skin Analyzer EH 900 U adalah alat dihubungkan ke perangkat
computer yang telah diunduh compact disc driver Skin Analyzer EH 900 U. Selanjutnya, kulit
yang akan dianalisis difoto dengan handset kamera, dan dengan mikroskopi elektronik untuk kulit,
foto dan data kulit dimasukkan ke PC untuk dianalisis. Foto kulit dan hasil analisis kulit
ditampilkan di layar PC. Hasil pengukuran kulit menggunakan skin analyzer EH 900 U memiliki
kriteria seperti terlihat pada Tabel 1.3
Tabel 1.3 Parameter penilaian elastisitas sesuai dengan skala yang ada pada skin analyzer

Pengukuran Parameter

Elastisitas Loose skin Weak Normal Better Best


15 – 35 % 35 – 50 % 50 – 65 % 65 – 70 % 70 – 71 %
Moisture Dry Ageing Normal Higher Shiny moist
3–4% 4 – 10 % 10 – 15 % 15 – 30 % 30 – 65 %

9. Analisis Data
Pengolahan data dan analisis dari uji manfaat ini menggunakan piranti lunak SPSS versi 24.
Data dianalisis distribusi normalnya menggunakan uji normalitas Spahiro Wilk dan
homogenitasnya menggunakan uji Levene. Uji statistic dilakukan untuk mengethaui perbedaan
antara kelompok kontorl dan kelompok uji dengan nilai kepercayaan 95% dan α = 0,05. Hasil
dikatakan bermakna apabila nilai P < 0,05.
Perbedaan antara kelompok kontrol dan uji akan dianalisis dengan menggunakan sampel t-test
apabila data yang diperoleh terdistribusi normal atau Mann-Whitney U test jika data tidak
terdistribusi normal.

10. Daftar Acuan


Azmi, N., Hashim, P., Hashim, D. M., Halimoon, N., Majid, N. M. N. (2014). Anti-Elastase, Anti-
Tyrosinase And Matrix Metalloproteinase-1 Inhibitory Activity Of Earthworm Extracts As
Potential New Anti-Aging Agent. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine; 4(Suppl
1): S348-S352.

Colipa – European Cosmetic, Toiletry, and Perfumery Association. (1997). Product Test
Guidelines Fir the Assessment of Human Skin Compatibility. Brussela: Colipa.
Ganceviciene, R., Liakou, A. I., Theodoridis, A., Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. (2012). Skin
Anti-Aging Strategies. Dermato-Endocrinology 4:3, 308–319.

Hättenschwiler, S., & Vitousek, P. M. (2000). The role of polyphenols in terrestrial ecosystem
nutrient cycling. Trends in Ecology & Evolution, 15(6), 238-243. doi:10.1016/s0169-
5347(00)01861-9.

Hooda, R. (2015). Antiwrinkle herbal drugs – An update. Journal of Pharmacognosy and


Phytochemistry; 4(4): 277-281.

Jia, N., Li, T., Diao, X., Kong, B., 2014. Protective effects of black currant (Ribes nigrum L.)
extract on hydrogen peroxide-induced damage in lung fibroblast MRC-5 cells in relation to
the antioxidant activity. J. Funct. Foods 11, 142–151.

Kanashiro, A., Souza, J. G., Kabeya, L. M., Azzolini, A. E. C. S., Luciano-Valim, Y. M. (2007).
Elastase Release by Stimulated Neutrophils Inhibited by Flavonoids: Importance of the
Catechol Group. Zeitschrift fur Naturforschung 62c, 357-361. DOI: 10.1515/znc-2007-5-
607.

Kim, J. Y., Yang, H. J., Lee, K. H., Jeon, S. M., Ahn, Y. J., Won, B. R., Park, S. N. (2007).
Antioxidative and Antiaging Effects of Jeju Native Plant Extracts (II). J. Soc. Cosmet.
Scientists Korea, 33(3): 165-173.

Kim, D.-B., Shin, G.-H., Kim, J.-M., Kim, Y.-H., Lee, J.- H., Lee, J.S., Song, H.-J., Choe, S.Y.,
Park, I.-J., Cho, J.-H., Lee, O.-H. (2016). Antioxidant and anti-ageing activities of citrus-
based juice mixture. Food Chem. 194, 920–927.

Lee, K. K., Choi, J. J., Park, E. J., Choi, J. D. (2001). Anti-Elastase And Anti-Hyaluronidase Of
Phenolic Substance From Areca Catechu As A New Anti-Ageing Agent. International
Journal of Cosmetic Science, 23, 341-346.

Mathiesen, L., Malterud, K. E., Sund, R. B. (1995). Antioxidant Activity of Fruit Exudate and C-
Methylated Dihydrochalcones from Myrica gale. Pianta Med. 61: 515— 518.

Moon, J. Y., Yim, E. Y., Song, G., Lee, N. H., Hyun, C. G. (2010). Screening Of Elastase and
Tyrosinase Inhibitory Activity from Jeju Island Plants. EurAsian Journal of BioSciences,
4:41-53.
Ndlovu, G., Fouche, G., Tselanyane, M., Cordier, W., Steenkamp, V. (2013). In Vitro
Determination of The Anti-Aging Potential of Four Southern African Medicinal Plants.
BMC Complementary and Alternative Medicine, 13:304.

Panwar, A. S., Upadhyay, N., Bairagi, M., Gujar, S., Darwhekar, G. N., Jain, D. K. (2011).
Emulgel: a Review. Asian Journal of Pharmacy and Life Science, Vol. 1(3).

Rawat, S., Jugran, A., Giri, L., Bhatt. I. D., Rawal, R. S. (2011). Assessment of Antioxidant
Properties in Fruits of Myrica esculenta : A PopularWild Edible Species in Indian Himalayan
Region. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2011, Article
ID 512787, 8 pages, doi:10.1093/ecam/neq055.

Sasroamoro, S., & Ismael, S. (2011). Dasar- Dasar Metodologi Penelitian Klinis, Edisi 4. Jakarta:
Penerbit Sagung Seto.

Silva, B. J. C., Seca, A. M. L., Barreto, M. D. C., Pinto, D. C. G. A. (2015). Recent Breakthroughs
in the Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects of Morella and Myrica Species.
International Journal of Molecular Sciences, 16, 17160-17180; doi:10.3390/ijms160817160.

Spinola, V., Llorent-Martinez, E. J., Gouveia, S., Castilho, P. C. (2014). Myrica faya: A New
Source of Antioxidant Phytochemicals. Journal Agricultural And Food Chemistry, 62,
9722−9735, dx.doi.org/10.1021/jf503540s.

Taniredja, T., & Mustafidah, H. (2012). Ppenelitian Kuantitatif, sebuah Pengantar, Bandung:
Penerbit Alfabeta.

Tardiff, R. G., Hubner, R. P., & Graves, C. G. (2003). Harmonization of Thresholds for Primary
Skin Irritation from Result of Human Repeated Insult Patch Tests and Laboratory Animal
Skin Irritation Tests. Journal of Applied Toxicology, 23(4), 279-281. doi: 10.1002/jat.917

Thring, T., Hili, P., Naughton, D. P. (2009). Anti-Collagenase, Anti-Elastase And Anti-Oxidant
Activities Of Extracts From 21 Plants. BMC Complementary and Alternative Medicine, 9:27
doi:10.1186/1472-6882-9-27.

Tohi, K. and Iwahashi, H. (2011). Skin-Whitening Agent, Anti-Aging Agent and Skin-Care
Cosmetic Agent. United States Patent Application Publication/0212041 A1.