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SIGNIFICADO CLÍNICO Especificidade: A metodologia de Sims-Horn é

A bilirrubina é o produto final da degradação da específica para determinação de bilirrubina, sendo a BILIRRUBINA BIOQUÍMICA CLÍNICA
hemoglobina. Como esse processo ocorre nas células mesma detectada em baixas concentrações.
hepáticas, níveis alterados de bilirrubina indicam FINALIDADE • Pipetas semiautomáticas 50µL ou 200µL.
alterações hepatocelulares, obstrução biliar ou icterícia Sensibilidade: a absorvância encontrada, de 0,005, Sistema colorimétrico para determinação das • Ponteiras descartáveis.
hemolítica. corresponde a 0,125mg/dL de bilirrubina direta e a bilirrubinas no soro ou plasma. • Água destilada ou deionizada.
A hiperbilirrubinemia ocorre nas seguintes condições: absorvância encontrada, de 0,010, corresponde a Somente para uso diagnóstico in vitro. • Cronômetro.
no recém nascido, podendo atingir 12mg/dL, na icterícia 0,25mg/dL de bilirrubina total, quando realizados os
testes em espectrofotômetro, a 530nm. A sensibilidade PRINCÍPIO
obstrutiva, na icterícia hepatocelular (parenquinatosa), A bilirrubina presente no soro é constituida por 4 ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS
nas hepatites por vírus e na necrose hepática aguda, do sistema está diretamente relacionada com a do frações: REAGENTES DE USO
havendo predominância da bilirrubina direta (BD). aparelho utilizado no laboratório. Bilirrubina livre não conjugada - α bilirrubina; Solução aceleradora: armazenar à temperatura de
As icterícias por hemólise são secundárias à anemia Bilirrubina monoconjugada - β bilirrubina;
Bilirrubina diconjugada - γ bilirrubina; 20-30oC. Estável até a data de vencimento indicada
hemolítica, hemoglobinúria paroxística, policitemia, Diluição da matriz: estudos sucessivos de diluição
Bilirrubina ligada covalentemente à albumina - no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
malária, transfusão de sangue incompatível e anemia da matriz mostraram que não há interferência na
δ bilirrubina. armazenamento.
sensibilidade diagnóstica da presente metodologia de As frações β, γ e δ são hidrossolúveis e reagem
hemolítica do recém nascido (eritroblastose fetal). Reagente sulfanílico: armazenar à temperatura de
Sims-Horn. diretamente com o diazo reagente e são chamadas no
Nessas situações a BD está pouco elevada, havendo 20-30oC. Estável até a data de vencimento indicada
Substâncias interferentes: a dosagem de bilirrubina conjunto de bilirrubina direta.
nítida predominância da bilirrubina indireta (BI). no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
total em plasma contendo EDTA apresenta resultados A fração α da bilirrubina é insolúvel na água. Sua
A determinação da bilirrubina no líquido amniótico é solubilidade é alcançada com aditivos (cafeina, álcool,armazenamento.
elevados. O EDTA existente no plasma reage com
de importância fundamental no diagnóstico pré natal cetrimide, etc) chamados de aceleradores e representa Nitrito de Sódio: armazenar à temperatura de 20-
Benzoato de Sódio, com formação de Ácido Benzóico.
da enfermidade hemolítica. Valores menores que 0,1 o que se chama de bilirrubina indireta. 30oC. Estável até a data de vencimento indicada
mg/dL são considerados normais, enquanto que valores A bilirrubina dosada na presença de solução aceleradora
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA é chamada de bilirrubina total pois representa a soma no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
entre 0,1 e 0,27mg/dL são encontrados somente em • Jendrassik, L., e Grof, P.: Biochem. Z.297,81, 1938. das bilirrubinas direta e indireta. armazenamento.
presença de eritroblastose fetal. • Sims, F.H., Horn, C.: Am.J. Clin. Path.29: 412, 1958. Solução padrão: na forma liofilizada, armazenar
• Malloy, H.T. e Evelyn, K.A., J.: Biol. Chem. 119, 481, PARTICULARIDADES DO SISTEMA à temperatura de 20-30oC. Estável até a data de
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Bilirrubina Doles é uma modificação da técnica de
1973. vencimento indicada no rótulo do frasco.
Sims-Horn permitindo a determinação da bilirrubina
Foram realizados 44 testes em amostras cujo teor de • Tibúrcio, H.M.: Controle Interno da Qualidade total e frações em apenas 3 minutos. Os reagentes são
bilirrubina se situava no intervalo de 0,45 a 23mg/dL. Analítica, 1aed. março/1995. todos estáveis à temperatura ambiente. A simplicidade CUIDADOS E PRECAUÇÕES COM O USO DOS
Esses ensaios foram realizados em paralelo com uma • Henry, J.B.: Clinical Diagnosis and Management by da técnica permite que o diazo-reagente seja preparado REAGENTES
metodologia de referência. A comparação do kit de Laboratory Methods, 19a ed, 258-260, 1996. dentro do próprio tubo de reação, através de um Todos os reagentes são somente para uso diagnóstico
Bilirrubina Doles (Y) com a metodologia mencionada sistema de conta gotas.
• BURTIS, Carla., ASHWOOD, Edward R. Tiez Textbook in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-
(X) deu origem à seguinte equação de regressão linear: of Clinical Chemistriz. 3a ed. Philadelphia: Saunder, METODOLOGIA se o contato com pele e mucosas. Em caso de
Y= 0,30 + 1,01X, sendo o coeficiente de correlação 1999.p.1133-1136. Sims-Horn contaminação acidental, lavar a área afetada em água
0,99. • Doles: dados de arquivo. corrente. O descarte do material utilizado deverá ser
Testes de recuperação mostraram índice de REAGENTES
TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA DA Solução aceleradora: solução de Benzoato de Cafeína feito obedecendo-se aos critérios de biossegurança
recuperação equivalente a 97 ± 3,5%.
tamponada. Contém por litro: Benzoato de Sódio 0,13M estabelecidos pelo laboratório, de acordo com as
O erro da média foi de 1,96%. QUALIDADE DO PRODUTO e Cafeína 0,13M. normas locais, estaduais ou federais.
As garantias do fabricante ao consumidor seguem Reagente sulfanílico: solução de Ácido Sulfanílico
Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de 0,04M em Ácido Clorídrico 0,45M. Observar ainda a simbologia
sucessivas, com 2 amostras, obtendo-se os seguintes setembro de 1.990 - Código de Defesa do Consumidor. Nitrito de Sódio: cada frasco contém 0,45mmol de
constante nos rótulos do produto:
Os reagentes que compõem este sistema para Nitrito de Sódio. Corrosivo Irritante
resultados: Solução padrão: cada lote contém concentrações
diagnóstico são garantidos na sua performance, variáveis de cloreto de Naftiletilenodiamino em meio AMOSTRA
reprodutibilidade e qualidade até a data de vencimento. a substâncias inertes. Uma solução 0,789mmol de Soro ou plasma (colhido com heparina), isento de
Amostra 1 Amostra 2
Os produtos que apresentarem problemas Naftiletilenodiamino frente ao diazo-reagente gera
técnicos comprovados serão substituídos, sem uma coloração equivalente à aquela desenvolvida por hemólise e lipemia. Até a realização do teste, o soro
Concentração (mg/dL) 1,21 16,00
ônus para o consumidor. solução de bilirrubina 10mg/dL em meio proteico, deve ser mantido refrigerado e ao abrigo da luz.
segundo Sims-Horn. A concentração do padrão Se protegida da luz, a bilirrubina permanece estável por
Desvio padrão 0,06 0,32 varia de lote a lote entre 8 e 12mg/dL. (Vide rótulo 3 dias, entre 2-8oC, e por 3 meses a 10oC negativos.
Doles Reag. Equip. para Laboratórios Ltda. do frasco).
CNPJ: 01.085.513/0001-05 Todas as amostras biológicas devem ser
Coeficiente de variação (%) 4,96 2,00
Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 APRESENTAÇÃO consideradas como sendo potencialmente
Chácara Retiro, Conjunto Palmares. Solução aceleradora 1 x 210mL infectantes.
Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, Reagente sulfanílico 2 x 32mL
durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes CEP: 74775-027
Nitrito de Sódio 1 x 21mL
resultados: Goiânia - GO – Brasil Solução padrão (após reconstituição) 1 x 5mL PROCEDIMENTO TÉCNICO
e-mail: doles@doles.com.br Solução padrão: reconstituir a solução pela adição
NÚMERO DE TESTES de 5mL de água destilada e agitar. Após 10 minutos,
Amostra 1 Amostra 2 Técnica Macro - 104 testes
M.S.: no 10231810035 a solução está pronta para uso. Estável por 8 dias, se
Técnica Micro - 208 testes
Concentração (mg/dL) 1,21 17,90 armazenada entre 2-8oC.
Revisão: 19 (11/2018) EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS
Desvio padrão 0,06 0,54 NÃO FORNECIDOS DETERMINAÇÃO DO FATOR (F)
• Espectrofotômetro ou fotocolorímetro capaz de medir Como a diluição do soro é diferente nas técnicas
a absorvância em 530nm ou filtro verde.
Coeficiente de variação (%) 4,96 3,01 macro e micro, faz-se necessária a determinação
• Tubos de ensaio.
• Pipetas graduadas. de um fator para cada modalidade.

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TÉCNICA MACRO Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra • A ordem de adição dos reagentes é de fundamental A literatura relata que a bilirrubina α possui uma
Rotular 3 tubos de ensaio de P (padrão) e adicionar com solução fisiológica e procede-se à nova dosagem. importância para a obtenção de resultados estrutura conformacional chamada trans. Na
a cada um: Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluição. satisfatórios. A alteração da adição dos reagentes presença de luz a conformação desta molécula
• O kit de Bilirrubina Doles possui padrão no compromete a formação do diazo-reagente muda de trans para cis (posição que torna a
Nitrito de Sódio 2 gotas intervalo de linearidade da metodologia de tendo como consequência resultados falsamente bilirrubina hidrossolúvel). Nestas condições, porções
Sims-Horn. O laboratório deve realizar o ensaio diminuídos. de bilirrubina indireta, solubilizadas, reagem de
Reagente sulfanílico 4 gotas com o padrão que acompanha o kit e calcular • No gotejamento dos reagentes nitrito de sódio e maneira idêntica à bilirrubina direta.
seu fator de calibração (F), de acordo com o sulfanílico, o frasco deve ser mantido na posição Em pacientes anictéricos pode haver um aumento
Água destilada 4 mL exemplo acima. vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas artificial da bilirrubina direta, tendo resultados finais
• A concentração do padrão é variável de lote paredes do tubo, o que levará ao comprometimento de bilirrubina direta próxima ou até superior a total.
Solução Padrão 200µL a lote. O fator deve ser refeito a cada lote do da formação do diazo-reagente. • Amostras com teor de Triglicérides maior de 200mg/
produto. dL produzem resultados falsamente diminuidos.
Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD • Amostras com teor de Hemoglobina acima de 30
P, zerando o aparelho com água destilada, em DETERMINAÇÃO DA AMOSTRA (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). mg/dL produzem resultados falsamente elevados
530nm ou filtro verde. na Bilirrubina total e falsamente diminuidos na
TÉCNICA MACRO Proceder como segue: determinação da Bilirrubina direta.
TÉCNICA MICRO Antes de iniciar as dosagens, ler atentamente os • Avaliação da concentração de Hemoglobina em
Rotular 3 tubos de ensaio de P (padrão) e adicionar itens a seguir: B BD BT uma amostra hemolisada (estimativa):
a cada um: • A ordem de adição dos reagentes é de fundamental 1- Adicionar 50µL da amostra em 2,0mL de
importância para a obtenção de resultados Nitrito de Sódio - 1 gota 1 gota solução fisiológica.
satisfatórios. A alteração da adição dos reagentes 2-Ler a absorvância em 405nm. Zerar o aparelho
Nitrito de Sódio 1 gota compromete a formação do diazo-reagente tendo com água.
Reagente sulfanílico 2 gotas 2 gotas 2 gotas
como consequência resultados falsamente diminuídos.
Reagente sulfanílico 2 gotas • No gotejamento dos reagentes nitrito de sódio e Hb (mg/dL) Absorvância x 601
Água destilada 2 mL 2 mL - 405
sulfanílico, o frasco deve ser mantido na posição
Água destilada 2 mL vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas Solução aceleradora - - 2 mL • A bilirrubina é extremamente fotossensível,
paredes do tubo, o que levará ao comprometimento devendo o soro ser mantido ao abrigo da luz e
Solução Padrão 50µL
da formação do diazo-reagente. Amostra 50µL 50µL 50µL refrigerado.
• O uso de plasma cujo sangue foi colhido com
Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD anticoagulante à base de EDTA é contra-indicado.
P, zerando o aparelho com água destilada, em (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). Misturar por agitação o conteúdo dos 3 tubos e deixar O sal EDTA reage com Benzoato de Sódio
530nm ou filtro verde. repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvâncias formando-se Ácido Benzóico. Este, insolúvel,
Proceder como segue: de BD e BT, ajustando o zero do aparelho com o precipita-se e turva a solução. À leitura,
CÁLCULO DO FATOR respectivo branco em 530nm ou filtro verde. A cor no espectrofotômetro, teremos resultados
B BD BT final permanece estável por 30 minutos, à temperatura falsamente elevados.
concentração P de 20-30oC.
Fator (F) = Nitrito de Sódio - 2 gotas 2 gotas CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA
absorvância P CÁLCULO DA AMOSTRA
1. A limpeza e a secagem adequada do material a
Reagente sulfanílico 4 gotas 4 gotas 4 gotas ser utilizado são de fundamental importância para a
EXEMPLO: Bilirrubina total (mg/dL) = absorvância BT x F
estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados
Absorvância Padrão (P): 0,396; 0,394; 0,395 Água destilada 4 mL 4 mL - Bilirrubina direta (mg/dL) = absorvância BD x F
corretos. Resquícios de produtos de limpeza nos
Média aritmética: 0,395 Bilirrubina indireta (mg/dL) = BT - BD
tubos de ensaio podem ocasionar resultados
Solução aceleradora - - 4 mL falsamente elevados.
Concentração do Padrão (P): 9,4mg/dL Exemplo:
2. A água utilizada na limpeza do material, no preparo
Amostra 200µL 200µL 200µL dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade.
9,4 BD: 0,010 BT:0,040
F= = 23,80 Bilirrubina total (mg/dL) = 0,040 x 25,31 = 1,01
3. Colunas deionizadoras saturadas liberam íons
Misturar por agitação o conteúdo dos 3 tubos e deixar diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram
0,395 Bilirrubina direta (mg/dL) = 0,010 x 25,31 = 0,25
repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvâncias os reagentes.
Bilirrubina indireta (mg/dL)= 1,01 - 0,25 = 0,76
de BD e BT, em espectrofotômetro ou fotocolorímetro, 4. As pipetagens devem ser precisas.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
ajustando o zero do aparelho com o respectivo branco 5. O uso de soro controle de referência deve ser uma
Padrão Absorvância
Conc.
em 530nm ou filtro verde. A cor final permanece LIMITAÇÕES DO SISTEMA
(gm/dL) • Para se obter ótimo desempenho do sistema, prática rotineira do laboratório. Recomenda-se utilizar
estável por 30 minutos, à temperatura de 20-30oC. um soro controle com valor na faixa de normalidade
1 0.000 0 A sensibilidade do sistema está diretamente é necessário que o procedimento técnico seja
2 0.078 2 rigorosamente seguido conforme instruções de uso. (soro controle N - Doles) e outro soro controle de
relacionado com a sensibilidade do equipamento valor elevado (soro controle P - Doles).
3 0.198 5
de leitura. Qualquer alteração poderá levar a resultados errôneos.
4 0.395 10 • A bilirrubina indireta não é hidrossolúvel e para reagir 6. A sensibilidade do sistema está diretamente relacio-
5 0.590 15 com o diazo-reagente é necessário a adição de um nada com a sensibilidade do equipamento de leitura.
TÉCNICA MICRO
6 0.800 20 componente que a torne hidrossolúvel. A solução
Antes de iniciar as dosagens ler atentamente os
7 0.910 25
aceleradora torna a fração indireta hidrossolúvel, VALORES DE REFERÊNCIA
itens a seguir:
possibilitando a reação com o diazo-reagente. Além É recomendado que cada laboratório estabeleça sua
• Utilizar a técnica micro somente para dosagens
• A curva de calibração demonstra a linearidade da reação em amostras com bilirrubinas elevadas (amostras da aceleradora fatores interferentes podem torná-la própria faixa de valores de referência na população
até uma determinada concentração, na qual pode ser ictéricas). hidrossolúvel antes mesmo de proceder a reação, atendida.
determinado um fator de calibração (F),de acordo com a Lei Atenção! A técnica micro é inadequada para dosagem o que levaria neste caso uma BD alterada não por Como orientação sugerimos os seguintes valores:
de Beer. de bilirrubinas em amostras de soro com aspecto motivos biológicos. Os interferentes mais conhecidos Bilirrubina direta até 0,4mg/dL
• A reação é linear entre 0 e 20mg/dL (ver curva acima). físico normal. são luz e temperatura. Bilirrubina total até 1,2mg/dL

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