MICROBIOLOGÍA

- VIRUS

Microbiología
Médica

ALUMNA:
Amy Victoria Cueva Cesar
MICROBIOLOGÍA
 LABORATORIO – QUINTO SEGMENTO VIRUS

“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

FACULTAD DE MEDICINA “HIPOLITO UNANUE”

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
TEMA:

INFORME – QUINTO
SEGMENTO

Docente responsable:

Dr. Alcantara Diaz Andres

Alumna:
2 CUEVA CESAR Amy Victoria

Curso:

MICROBIOLOGÍA – LABORATORIO

Segmento: VIRUS

Lima – Perú

2018

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 LABORATORIO – QUINTO SEGMENTO VIRUS

VIRUS
PRÁCTICA N°1

ESTUDIO DE BACTERIÓFAGOS: MÉTODO DE AISLAMIENTO DE VIRUS

BACTERIANO

 EXPERIMENTO 1: FAGOCITOSIS IN VITRO

▪ RESULTADOS

Observación de lisis
generada por los bacte-
riófagos obtenidos a
partir de aguas residua-
les en medios de cultivo
de E. coli.

UFP

▪ INTERPRETACIÓN

De acuerdo con las observaciones realizadas a los cultivos bacterianos, se encontró la

formación de unidades formadoras de placa (UFP) de forma clara y diferenciada, facilitando
una mayor precisión en la cuantificación o titulación fágica para los diferentes experimentos
realizados. El hecho de que se presente un comportamiento de este tipo, facilita la
observación de la lisis que se presenta en cada uno de los cultivos bacterianos y, a su vez,
facilita el proceso de titulación de bacteriófagos, no solo en experimentos de este tipo, sino
en otros como son la caracterización de algunas bacterias a través de bacteriófagos y algunas
relaciones biológicas que existen entre ellos.

El hecho de que se presente una mayor cantidad de unidades formadoras de placa (UFP) en
una dilución especifica permite inferir que los bacteriófagos que se titularon según su efecto
lítico en esta dilución presentaron una mayor tasa de infección a las células bacterianas que
crecieron en este experimento y, por ende, una mayor tasa de replicación de bacteriófagos.

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▪ CUESTIONARIO

1) ¿Qué es un bacteriófago?

Los bacteriófagos son parásitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de las
bacterias, haciendo uso de algunas o todas sus maquinarias biosintéticas (p. ej., los virus que
infectan bacterias). Existen muchas similaridades entre los bacteriófagos y los virus de células
animales. Así, los bacteriófagos pueden ser visualizados como sistemas modelo de los virus de
células animales. Además es necesario el conocimiento previo del ciclo de vida del
bacteriófago para entender uno de los mecanismos por los cuales los genes bacterianos
pueden transferirse de una bacteria a otra.

1.1 COMPOSICIÓN

Aunque diferentes bacteriófagos pueden contener diferentes materiales todos ellos

contienen ácido nucleico y proteína.

Dependiendo del fago, el ácido nucleico puede ser ya DNA o ya RNA pero no ambos y puede
existir en varias formas. Los ácidos nucleicos de los fagos a menudo contienen bases raras o
modificadas. Estas bases modificadas protegen a los ácidos nucleicos del fago de las
endonucleasas que cortan los ácidos nucleicos del huésped durante la infección. El tamaño de
los ácidos nucleicos varía dependiendo del fago. Los fagos más simples solo tienen suficiente
ácido nucleico para codificar un promedio de 3-5 productos génicos, mientras que los fagos
más complejos, pueden codificar para más de 100 productos génicos.

El número de proteínas de diferentes clases y la cantidad de cada una de ellas en la partícula

del fago variará dependiendo de la clase de fago que se trate. El fago más simple posee varias
copias de solo una o dos diferentes proteínas, mientras que los más complejos podrían poseer
muchos tipos de proteínas diferentes. La función de las proteínas durante la infección es
proteger al ácido nucleico de las nucleasas de su medio ambiente.

1.2 ESTRUCTURA

Los bacteriófagos vienen en

muchas diferentes formas y
tamaños. Las características
básicas estructurales de los
bacteriófagos muestran al fago
denominado T4.

 Tamaño - T4 está entre los fagos

más grandes, tiene
aproximadamente 200 nm de

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largo y 80-100 nm de ancho. Otros fagos son más pequeños. La mayoría de los fagos están
entre un rango de 24-200 nm de longitud.

 Cabeza o Cápside – Los fagos clásicos poseen una estructura a manera de cabeza y pueden
variar de tamaño y forma. Algunos son icosaédricos (20 caras) otros son filamentosos. La
cabeza o cápside está compuesta de muchas copias de una o más proteínas diferentes. Al
interior de la cabeza se encuentra el ácido nucleico. La cabeza actúa como una cubierta
protectora para el ácido nucleico.

 Cola – Muchos, aunque no todos los fagos muestran una cola unida a la cabeza del fago. La
cola es un tubo hueco a través del cual el ácido nucleico pasa durante la infección. El tamaño
de la cola puede variar y algunos fagos ni siquiera la tienen. En los fagos más complejos como
T4, la cola se rodea de una cortina contráctil durante la infección de la bacteria. Al extremo
de la cola los fagos más complejos como T4 presentan una placa en la base y una o más fibras
unidas a ella. Esta placa de base y las fibras de la cola están involucradas en la unión de los
fagos a la célula bacteriana. No todos los fagos tienen placas de base ni fibras de la cola, En
tales casos existen otras estructuras que se ven asociadas en la unión de partícula del fago a
la bacteria.

2) ¿Cuál es el ciclo vital del bacteriófago?

Cuando una bacteria no infectada es expuesta a un fabo libre se produce la infección si la

célula es sensible. El fago es adsorbido sobre la superficie celular y el ácido nucleico del mismo
penetra en las células, abandonando el exterior a su cubierta protéico.

Normalmente el ácido nucleico viral se reproduce rápidamente intercelularmente

formándose muchas réplicas, que se maduran por adquisición de nuevas cubiertas proteicas
y provocan lisis de la bacteria (Fago vegetativo o virulento). Sin embargo, en ocasiones el ácido
nucleico viral se reproduce sincrónicamente con el cromosoma de la bacteria y no causa lisis
de la bacteria (Fago moderado o profago).

Se llama Bacteria lisogénica a la que contiene un profago. El ciclo de replicación de un

bacteriófago T4 se puede dividir esquemáticamente en distintas etapas, las que son comunes
a otros virus bacterianos y eucarióticos:

 Adsorción
 Inyección del material genético viral
 Replicación del material genético viral
 Síntesis de las envolturas proteicas
 Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura
 Lisis y liberación de las partículas viral

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2.1 Adsorción:

El virus se fija o adsorbe a componentes de la superficie celular que actúan como

receptores específicos. La zona de adsorción del virus es complementaria al receptor
celular, por lo tanto un determinado virus sólo puede infectar un número limitado de
cepas celulares que contengan a un determinado receptor. La naturaleza de la zona de
adsorción varía con el tipo de fago. En el T4 se localiza en el extremo de la cola, en donde
se encuentran la placa basal, las espículas y las fibras de la cola.

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Esquema de los principales

eventos en la adsorción del
bacteriófago T4 a la pared
celular de la bacteria E. coli.(a)
el fago libre muestra las fibras y
las espículas de la cola.
(b)Adhesión de las fibras de la
cola. (c) El fago se acerca a la
pared celular y las espículas
entran en contacto con la pared
celular.

2.2 Inyección del material genético viral: Después de la adsorción, se produce un cambio
configuracional en las proteínas de la placa basal, alguna de las cuales tienen actividad
enzimática y producen un poro en la membrana citoplasmática de la célula. La vaina del
fago se contrae y el material genético viral ingresa en la célula, mientras que la envoltura
proteica queda en el exterior.

Esquema del mecanismo de

penetración del material
genético del fago T4 o T2 a
través de la pared celular de la
bacteria. (a) Las espículas del
fago entran en contacto con la
pared celular y la vaina se
encuentra extendida. (b) La
vaina de la cola se contrae y el
material genético del fago
penetra la pared celular; la
lisozima presente en el fago
digiere la porción de pared
celular localizada
directamente bajo la partícula
viral.
2.3 Replicación del material genético viral: El material genético viral que ingresa en una
célula contiene bases modificadas que evitan la degradación por nucleasas bacterianas.
Esta modificación consiste en la glicosilación y/o metilación de algunas determinadas
bases. En el caso del fago T4 se glucosila la base 5'-hidroximetilcitosina. Para lograr una
efectiva replicación del genoma viral se deben sintetizar algunas proteínas ni bien el
material genético ingresa en la célula. Esta proteína temprana reparan el poro de la
membrana citoplasmática por donde ingresó el genoma viral, degradan el DNA bacteriano
lo que proporciona una fuente de precursores, evita la síntesis de RNA y proteínas
bacterianas, y proporciona ribosomas para la síntesis de proteínas del fago. Además

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algunas de estas proteínas tempranas participan en la síntesis de las bases inusuales. La

forma de replicación del genoma viral es dependiente del tipo de material genético (si es
RNA o DNA, si es simple o doble cadena). En el caso del fago T4, las moléculas replicadas
se aparean en los extremos y formando una molécula de DNA más larga denominada
concatámero. Después una enzima corta esta larga molécula lineal en moléculas más
pequeñas de igual longitud. Las moléculas de DNA del T4 tienen se caracterizan por estar
permutadas circularmente (el DNA del T4 es lineal) de esta forma todas las moléculas de
DNA resultantes contienen genes completos y funcionales. La enzima del T4 que corta al
concatámero produce moléculas de DNA de tamaños similares pero no reconoce sitios
específicos sobre la molécula, en cambio la enzima del T7 reconoce sitios específicos
sobre el DNA.
2.4 Síntesis de las envolturas proteicas: Las proteínas de la envoltura (cápside, vaina, fibras,
etc.) son proteínas tardías que se sintetizan después de iniciada la replicación del material
genético. La síntesis de cada componente proteico se realiza separadamente. En el caso
del fago T4, el material genético es encapsidado antes del ensamble del resto de los
componentes.
2.5 Ensamble: Todas las proteínas de la envoltura se ensamblan para formar una partícula
viral madura capaz de infectar a otra célula cuando sea liberada.
2.6 Lisis celular y liberación de las partículas virales: La lisis celular se debe a la síntesis de
proteínas tardías codificadas en el genoma del fago. En el fago T4, estas proteínas son
enzimas que lesionan la membrana citoplasmática y la pared celular.

3) ¿Cuál es la función del cloroformo y el cloruro de calcio en la placa Petri?

 CLOROFORMO: Una de las formas más usadas para la conservación de los lisados fágicos
es en presencia de cloroformo, ya que este sirve para impedir la contaminación
microbiana de los lisados fágicos; pero se sabe que algunos bacteriófagos son sensibles a
este reactivo.

Los resultados revelaron que el bacteriófago es resistente al cloroformo ya que no mostró

modificación en su capacidad de infección y viabilidad después de la exposición a este
agente. Sí actúa contra bacterias contaminantes del concentrado fágico por lo cual es
recomendable agregar cloroformo a los Usados fágicos a fin de evitar contaminación
bacteriana.

 CLORURO DE CALCIO: La estabilidad del bacteriófago depende de muchos factores del

medio ambiente, algunos de los cuales actúan diferente sobre la diversidad de estos.

Para mantener estables a los bacteriófagos, en su propio lisado, deben contener siempre
electrolitos apropiados y estar libres de agentes específicos de inactivación (sustancias
receptoras) derivado del lisado de bacterias; estos electrolitos son generalmente
soluciones neutras, como cloruro de calcio al 1.5% o buffer preparado con agua destilada-

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glass que contenga conteniendo 0.1 M de cloruro de sodio y 0.001 M de cloruro de

magnesio.

4) Definir que es la calva o placa

La calva o placa son zonas circulares claras estas regiones no contienen bacterias o solamente
tienen unas pocas. (Es el resultado del virus sobre la bacteria: virus sobre la escherichia coli)
En la mayoría de los casos se desarrolla una placa por cada fago que estuviera presente en la
suspensión.
La placa es el resultado de una infección iniciada por un solo virión. Ese virión infectó una sola
célula hospedadora, que produjo más viriones; dichos viriones infectaron las células de los
alrededores y así sucesivamente. La epidemia continúa hasta que la bacteria deja de crecer,
impidiendo la multiplicación de los fagos. Cuando todas las células de la región que rodeaba
el sitio original de la infección han sido destruidas, se produce una placa de lisis.
A partir del número de placas que se desarrollen sobre el medio de cultivo podremos
determinar cuántos fagos existían en la muestra de agua sembrada, de la misma manera que
se calcula el resultado en el recuento de células viables en placa. A este método se le
denomina recuento en placa.
Los viriones son responsables de la formación de una placa, pero también lo es la célula
infectada por el virus. Ambos están siempre presentes en cualquier cultivo infectado con
bacteriófagos. Los viriones y las células infectadas se denominan, conjuntamente, unidades
formadoras de placas (UFP).
Cada calva corresponde a la infección por un único virus por lo cual contando y realizando
cálculos se puede llegar a conocer la carga vírica de la suspensión inicial en UFP/ml (unidades
formadoras de placa por mililitro)
Para determinar el número de bacteriófagos de una muestra, se añade una gota del cultivo de
la bacteria hospedadora a la muestra del virus (o una dilución apropiada). A continuación se
extiende la mezcla, o se vierte sobre agar en sobrefusión, en la superficie de un medio
solidificado con agar. Después de un período de incubación apropiado -desde pocas horas
hasta un día- la superficie de la placa de Petri aparecerá cubierta con un crecimiento
confluente de la bacteria hospedadora.

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PRÁCTICA N°2

LECTURA DE LAS PLACAS CON BACTERIÓFAGO

INOCULACIÓN DE HUEVOS EMBRIONADOS

 EXPERIMENTO O1: VÍA ALANTOIDEA

▪ PROCEDIMIENTO

1.- Iluminar con el ovoscopio el embrión y marcar

la cámara de aire y marcar un punto en la cima.

2.- Aproximadamente 5 mm. Por debajo de la

cámara de aire localice una zona libre de vasos y
del lado opuesto al embrión marcar el punto de
inoculación.

3.- Perforar los puntos

marcados e inocular 0.1 mL, de
colorante con una aguja del 27
corta.

4.- La inoculación se puede

realizar también a través de la
cámara de aire con una aguja
del 22 larga.

5.- Limpiar la mitad superior de la cáscara de

huevo con alcohol.

6.- Cortar la cáscara, retirar la membrana

coriolantoidea que cubre la cavidad alantoidea.

7.- Con una lengua estéril empujar el contenido

del huevo hacia abajo separándolo de la cascara
(el líquido alantoideo se deposita en ese
espacio)

8.- Retirar el líquido alantoideo.

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▪ RESULTADOS

Observación del virus

del herpes 2

 EXPERIMENTO O2: VÍA AMNIOTICA

 PROCEDIMIENTO

1.- Iluminar con el ovoscopio el embrión y

marcar la cámara de aire y marcar un
punto en la cima.

2.-Marcar el punto de inoculación

exactamente donde se ve el
embrión (localizar las manchas
oculares).

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3.- Iluminar el embrión se

inocula con la aguja del 22,
0.1 mL del colorante

▪ RESULTADOS

Observación del virus

del herpes 2

▪ CUESTIONARIO

1) ¿Cuáles son los virus que afectan el saco vitelino y la cavidad alantoidea?

Entre los lugares de inoculación tenemos:

 Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y la cantidad de
inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus
variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de Beyer (Pseudorrabia);
herpes simple, poxvirus, que provocan focos o pústulas fácilmente visibles.

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 Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la cantidad de inoculo es de

0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo alantoideo tenemos: peste,
New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental
Venezuela, parotiditis; influenza aviar, adenovirus. Ventaja: simplicidad de la inoculación
y toma de muestra
 Cavidad Amniótica: Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de
0.1 – 0.2 ml. Los virus usados generalmente son las de influenza.
 Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo
es de 0.2 – 1 ml. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de
enfermedades venéreas, neumonía, rickettsias y herpes simple.

2) ¿Cuál es el efecto citopatológico?

El efecto citopatológico puede ser diverso:

 No. 1. Parálisis de alas y patas
 No. 2. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de las 2 patas.
 No. 3. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de 1 pata.
 No. 4. Falta de desarrollo trófico y motor.
 No. 5. Pollo de aspecto normal.
 Pollo dentro del huevo con atrofia del hemisferio cerebral izquierdo (sin desarrollo y sin
vitalidad).

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