RESUMEN
En la práctica de laboratorio se realizaron diferentes métodos de extracción para la cuantificación
de proteínas por el método de Bradford. Metodos de extracción tales como la Extracción con Tris-
HCL y SDS, Extracción con sonicación y NaCl 1 M y Extracción alcalina fueron los que se
llevaron a cabo, dando como resultado la cantidad de proteína presente en la muestra según
correspondiera, se tendrá en cuanta los errores sistemáticos y aleatorios a la hora de discutir los
resultados de la práctica; también se realizó un análisis comparativo con los diferentes métodos de
extracción para una mejor realización de la práctica.
OBJETIVOS
Determinar el contenido de proteínas en una muestra de harina de trigo utilizando el método de
Bradford bajo tres métodos de extracción diferentes.
INTRODUCCION
PALABRAS CLAVES
MARCO TEORICO
La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos
más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los
límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que
se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las
proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones secundarias por oxidación,
proteólisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de técnicas de disrupción celular, que se usan
a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) métodos físicos mecánicos: agitación con
abrasivos, homogeneización a alta presión o extrusión por presión; b) métodos físicos no
mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación descongelación, sonicación o secado; c) métodos
químicos: tratamiento con álcali, solventes, detergentes, ácidos o sustancias caotrópicas. Luego de
la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separación y purificación de los componentes celulares.
Como primera medida, puede realizarse una centrifugación diferencial para obtener fracciones
subcelulares o para aislar organelas específicas. En este caso, las proteínas asociadas a membrana
quedarán en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugación) y las
solubles en el sobrenadante. En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan
las proteínas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamaño o carga,
proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias
en la solubilidad de las proteínas. Existen diversos factores que afectan esta solubilidad; en
particular, la composición en aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es en general
más soluble que una rica en aminoácidos hidrofóbicos); la estructura tridimensional (las proteínas
fibrosas son en general menos solubles que las globulares) y el entorno de la propia proteína.
Respecto a las condiciones del entorno de las proteínas, los principales factores que pueden afectar
su solubilidad son la temperatura; la constante dieléctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza
iónica.
La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una
fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una
sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteínaH2O porque quita la
capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de
las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las
proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas
particulares a partir de mezclas complejas.
La extracción asistida por ultrasonido (EAU) se puede aplicar a fuentes alimenticias para diversas
aplicaciones, incluida la modificación de micronutrientes vegetales para mejorar la
biodisponibilidad, la extracción simultánea y el encapsulamiento, desactivar la sonoquímica radical
para evitar la degradación de bioactivos y aumentar la bioactividad de fenoles y carotenoides
mediante hidroxilación dirigida [8]. El efecto degradativo de la sonoquímica radical, que es el
aspecto más relevante en términos de mejora de la biodisponibilidad de proteínas de algas, no es
producido por las ondas de ultrasonido, sino por la formación, crecimiento e implosión de burbujas
formadas por lo que se conoce como cavitación acústica [9]. La violenta implosión de estas
burbujas crea regiones microscópicas de presión y temperatura extremas, lo que resulta en la
excitación química del líquido sonicado y su contenido, lo que facilita la descomposición de las
partículas y la degradación del compuesto objetivo [10]. Las principales ventajas de los Emiratos
Árabes Unidos son su rápido tiempo de procesamiento, las propiedades no térmicas y el bajo
consumo de solventes, lo que da como resultado un producto final de mayor pureza con un menor
procesamiento posterior requerido [11].
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Se hizo la determinación del contenido de proteína de una muestra de harina de trigo (ARINA
CAPRI). Se utilizaran tres métodos de extracción.
Se pesaron 4,99 g de harina y se mezcló con la solución de NaCl 1M. La suspensión se agito
durante 30 minutos y posteriormente se aplicó sonicación por 20 min. Los extractos se
centrifugaron por 15 min y los sobrenadantes se almacenaron a – 20 ⁰C. El volumen total de la
extracción fue de 50 mL se obtuvieron 6 mL y estos se aforaron en un balón de 25 mL de esta
solución se obtuvo 1 mL que se llevó a un balón de 25 mL, de la disolución se extrajo 0,5 ml junto
con 5 mL de Bradford y se llevaron para su posterior análisis.
Extracción alcalina
Método estándar
REFERENCIAS
(1) Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity. Nature 256, 495–497
(2) Chial, H. J., Thompson, H. B., and Splittgerber, A. G. (1993) A spectral study of the charge forms
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(3) Compton, S. J. and Jones, C. G. (1985) Mechanism of dye response and interference in the
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(4) Congdon, R. W., Muth, G. W., and Splittgerber, A. G. (1993) The binding interaction of
Coomassie Blue with proteins. Analyt. Biochem. 213, 407–413.
(5) Friendenauer, S. and Berlet, H. H. (1989) Sensitivity and variability of the Bradford protein
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(7) Nicholas J. Kruger, The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition, Edited by: J. M. Walker ©
Humana Press Inc., Totowa, NJ. The Bradford Method for Protein Quantitation Nicholas J.
Kruger
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