Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209

Research Article Available online through

ISSN: 0974-6943 http://jprsolutions.info
Gastroprotective effect of selected antioxidants, vitamins and
minerals in ethanol induced ulcer model in rats
Shah Darshan Vinod1*, Nitin Mahurkar2,A.Srinivasa Rao3.
   1
                 Asst.prof, Dept. of Pharmacology, HSBPVT’S GOI, College of pharmacy, Kashti, Ahmednagar, Maharashtra, India.
                                                  2
HKE’s, MTR, Institute of Pharmaceutical sciences, Gulbarga, Karnataka, India.
                                             3Bhaskar Pharmacy College, Moinabad, Hyderabad, Telangana, India.
Received on:19-01-2017; Revised on: 14-02-2017; Accepted on: 18-03-2017

ABSTRACT
Aim:The investigation was aimed to explore the critical role of few selected antioxidants, vitamins and minerals on gastroprotection by
using ethanol induced ulcer model in rats. Further they help to find out its safety in GI disorders when compared with other reference
standard drug, and to recommend a safe therapy in managing gastric disorders based on preclinical studies. Materials and Methods: Male
Wistar rats weighing between 200-250 g. were divided into 9 groups of 6 animals each (n=6). The groups were treated respectively as follows
Group I normal control, and Group II disease control, received normal saline, Group III was treated with standard  drug omeprazole, Group
IV to IX received test substances respectively, antioxidants (Vitamin E, Cystine) vitamins (Thiamin, Niacinamide) minerals (Iron, Zinc)
administered for 7 days. Various parameters like, the volume and pH of gastric juice, total acidity, ulcer index, percentage protection,
biochemical parameters like mucin content, pepsin activity and antioxidant enzymes like, super oxide dismutase, catalase, reduced glutathione,
myeloperoxidase, and malondialdehyde were estimated. Histopathology of stomach epithelium was observed. Results: Significant reduction
(p<0.05) in ulcer index, total acidity, and increase in pH were observed in ulcer induced rats pretreated with test substances. Mucin content
in all rats pretreated with test substances was increased, and pepsin activity was decreased significantly (p<0.05) when compared with
disease control treated rats. Test substances treated rats showed significant restoration i.e., increased the level of super oxide dismutase,
catalase, reduced glutathione and significantly reduced (p<0.05) the  lipid peroxidation  and  decreased  the levels of  MPO and MDA.
Histopathological observations  on gastric mucosa  also confirmed the gastroprotective  activity of test  substances. Conclusions: It  is
concluded that, the all test groups Vitamin E, L- Cystine, Thiamin, Niacinamide, Iron, Zinc acts as an antiulcer drugs which may be attributed
to its antisecretory, cytoprotective and antioxidant activities.

KEY WORDS:  Gastroprotection, Omeprazole, Lipid peroxides, antioxidants, minerals, vitamins.

1. INTRODUCTION:
Gastric and PUD are common problems that afflict the population. In
India, many people suffer from gastric disorders ranging from gastritis
to ulcerations. Chronic alcohol consumption, smoking, stress, usage
of non-steroidal anti-inflammatory drugs and H. pylori infection[1,2]
have  been  shown  as  the  causes  of  gastric  ulcer  characterized  by
inflammation and mucosal bleeding in long-term untreated patients.
Excess acid secretion and reduced biosynthesis of prostaglandin E2
are important in gastric ulcer formation[3]. It has been suggested that
reactive oxygen species (ROS), primarily super-oxide anions, hydroxyl
radicals, and lipid peroxides, are the harmful species known to cause
the gastric ulcer development[4]. To scavenge ROS, gastric cell have
several enzymatic and non-enzymatic antioxidants including catalase
(CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx),
endogenous glutathione (GSH) and sulfhydryl groups (NPSH), but
excessive generation of ROS enhance lipid peroxidation and depletes
these antioxidants enzymes[5-7]. Ethanol is known as a cause of gastric
damage by altering protective factors, including decreasing mucus
production and blood circulation within the mucosa[8]. In addition,
the gastric damage caused by ethanol may be due to the generation
of reactive species, decreased cell proliferation, and an exacerbated
inflammatory response[9-11]. The damaging effects of ethanol have
been exploited in developing the ethanol model of peptic ulcers. The
model is independent of gastric acid secretion and resembles acute
peptic ulcers in humans. As a model, ethanol induced ulcer model is
useful for studying the efficacy of potential drugs or testing agents
that have cytoprotective and/or antioxidant activities[12].

*Corresponding author. The conventional drugs used in the treatment of gastric ulcer include

Shah Darshan Vinod histamine (H2) receptor antagonists, proton pump inhibitors, antacids
Department of Pharmacology,
and anticholinergics. However, most of these drugs have undesirable
HSBPVT’s GOI, College of Pharmacy,
side  effects  and  drug  interactions[13].  Although  few  drugs  like
Kashti, Pune University, Maharashtra,
sucralfate and prostaglandin analogs[14] are being used as antiulcer
India / Research Scholar JNTUH Telangana, India.
substances, they may also have the risk of drug interactions, adverse
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
effects  and  increased  incidence  of  relapse  during  ulcer  therapy. Following this, a few  drops of phenolphthalein was  added to  the
solution. Titration was done using 0.01 M solutions until the color of
Controlling the formation of reactive species and secretion of gastric
the test solution changed to light pink, indicating pH 7.0. The volume
acid are essential for the treatment of these pathologies. of sodium hydroxide (NaOH) needed for titration was used in the
calculation to derive the hydrogen ion concentration. The total acidity
Therefore, this investigation was planned to understand the effects is expressed as m equiv /L using the following formula:
of antioxidants, vitamins and minerals on gastroprotection by using
ethanol induced ulcer model in rats. n × 0.01 × 40 × 1000
Where,
n = volume of NaOH quantified
2. MATERIALS AND METHODS
40 is the molecular weight of  NaOH 0.01 is normality of NaOH and
1000 is the factor represented in liter.
2.1. Animals
Male Wistar rats weighing between 200 to 250 g were purchased 2.2.3. Determination of Ulcer Score [21]
from National institute of Biosciences Pune (NIB). The animals were Using the method described by Dekanski et al., the severity of the
acclimatized for seven days and housed under standard conditions mucosal lesions can also be assessed, and the ulcer index is scored
of temperature (230C to 290C) and relative humidity (50-70%) with a as follows:
12:12 light-dark cycle. The animals were fed with standard pellet diet 80 = no damage,
(NIB Pune.) and water ad libitum. Approval of our Institutional Animal 1 = blood at the lumen,
Ethics Committee (IAEC) of H.S.B.P.V.T.’s College of pharmacy, 2 = pinpoint erosions,
Kashti (CPCSEA: 1697/PO/a/13/CPCSEA) was taken for conducting 3 = one to five small erosions <2 mm,
the experiment. 4 = more than five small erosions <2 mm,
5 = one to three large erosions >2 mm,
2.2. Ethanol induced ulcer model[15] 6 = more than three large erosions >2 mm.
Gastric  ulcer  in male  Wistar  rats  was  induced  by  orogastric
intubation  of  absolute  Ethanol  (5  ml/kg)[16] and  rats  weighing The ulcer index and percentage protection given by the following
between 200 to 250 g were divided into 9 groups of 6 animals each. equation:

Group I    :   Normal Control, Normal saline treated 0.2 ml/ rat Ulcer index (UI) = Total ulcer score/no. of animals ulcerated

Group II    :  Disease Control, Normal saline treated 0.2 ml/ rat
Group III   :  Standard drug treated   Omeprazole 20mg/kg
Group IV   :  Vitamin E 45 mg/kg in 2% gum acacia orally.
Group V L :  Cystine 54 mg/kg in 2% gum acacia orally.
Group VI   :  Thiamin 1.05mg/kg in 2% gum acacia orally.
Group VII  :  Niacinamide 1.4 mg/kg in 2% gum acacia orally.
Group VIII :  Zinc 1mg/kg in 2% gum acacia orally.
Group IX   :   Iron 1 mg/kg in 2% gum acacia orally.
The substances were administered daily for 7 days. On 7th day after
12 h. of fasting, all groups (except Group I), of rats were gavaged
with absolute ethanol (5 ml/kg) in order to induce gastric ulcers[17]
after 5 hour, the rats were sacrificed. The stomachs were immediately
excised and rapidly immersed in 10 % buffered formalin solution.
2.2.1 Determination of Volume and pH of gastric juice.[18]
The  animals  were  sacrificed,  stomach was  dissected  out  and  the
gastric juice collected was centrifuged for 5 min at 2000 rpm, and the
volume of the supernatant was expressed as ml and pH was measured
using pH meter.
2.2.2 Determination of Total acidity of Gastric juice.[19,20]
The supernatant of gastric juice was  taken and  diluted 10 times.
                                           UI of Control – UI of Pretreated
Percentage Protection = .........................................................X 100
UI of Control
2.2.4. Determination of Mucin Content [19]
The glandular portion was excised and opened down along the lesser
curvature of animals from both models. The reverted stomach was
soaked for 2 h in 0.1% alcian blue (0.16M sucrose buffered with
0.05M sodium acetate). The uncomplexed dye was removed by two
successive washes of 15 and 45 min in 0.25M sucrose solution. The
dye complexes with mucus were diluted by immersion in 10 ml of
0.5M magnesium chloride for 2 h. The resulting blue solution was
shaken briefly with equal volume of diethyl ether and the optical
density of aqueous phase was measured at 605 nm. The mucin content
of the sample was determined from the standard curve obtained with
different concentrations of mucin.
2.2.5. Determination of Pepsin Activity [22]
Pepsin activity was determined by the Anson-Mirsky revised method
using bovine hemoglobin as a substrate. One gram of hemoglobin
was added to 10 ml of 0.3 mol/L HClsolution, and then the solution

Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209

 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
was diluted to 50 ml as the hemoglobin substrate. Gastric juice was Calculations
diluted 50-fold with 0.04 mol/L HCl solution to produce the sample Absorbance reading of control - A
solution. The hemoglobin substrate and 0.5 ml of the sample solution Absorbance reading of sample - B
were stored at 37 0C. The sample solution was added to 2 ml of the Units of SOD/3 ml of assay mixture = [(A-B) / (A×50)] ×100
hemoglobin substrate, and the solution was mixed. Then, the solution Unit×10 = Units /ml of sample solution.
was incubated at 37 0C for digestion. After 10 min, the solution was
added to 5 ml of 5% trichloroacetic acid and mixed. The sample
2.2.6.2. Catalase (CAT)[24].
solution was added to 5% trichloroacetic acid, and then hemoglobin
Catalase activity was measured by the method of Aebi. 0.1 ml of
solution  was  added  as  a  blank.  After  30  min,  the  solution  was
gastric  juice  was  added  to  cuvette  containing  1.9  ml  of  50  mM
centrifuged,  and  1  ml  of  supernatant  was  added  to  tube.  The
phosphate buffer (pH 7.0). Reaction was started by the addition of
supernatant was added to 5 ml of 0.5 mol/L sodium hydroxide and
1.0ml of freshly prepared 30 mM H2O2. The rate of decomposition of
phenol reagent. Color optical density was determined using a tyrosine
H2O2 was  measured  spectrophotometrically  from  changes  in
standard at 640 nm after 60 min. Acidity and pepsin activity were absorbance at 240 nm. Activity of catalase was expressed as units/
expressed as mEq/L and tyrosine μg/ml/min, respectively. mg protein. A unit is defined as the velocity constant per second.
Pepsin activity was calculated using following formula.
Re ag e n ts Samp le Bl an k

Pepsin activity= (AÿB) × 50 × 7.5/0.5 × 1/10= (AÿB) × 75, Phosphate  buffer solution 1.9  ml 2..9 ml

Supernatant 0.1  ml 0.1  ml
Where, A is the concentration of tyrosine in the sample, and B is the H 2O 2 1  ml -
concentration of tyrosine in the blank.
The reaction occurs immediately after the addition of H2O2. Solutions
2.2.6. Estimation of Antioxidant enzymes are mixed well, and the first absorbance (A1) is read after 15 seconds
(t1)  and  the  second  absorbance  (A2)  after  30  seconds  (t2).The
2.2.6.1.Serum Superoxide Dismutase (SOD)[23] absorbance is read at wave length 240 nm.
Superoxide dismutase was assayed in gastric juice by the method
devised  by  Marklund  S,  Marklund  G  modified  by  Nandi  and Calculation
Chatterjee.  K = Vt/Vs*2.3/ Δ t* log (A1/A2)*60
Where,
Principle K= Rate constant of the reaction.
 t= (t2 – t1) =15 seconds.
Pyrogallol  auto  oxidises  rapidly  in  aqueous  or  alkaline  medium
A1= absorbance after 15 seconds.
solution and this has been employed for the estimation of superoxide A2= absorbance after 30 seconds.
dismutase.  SOD  inhibits  the  auto  oxidation  of  pyrogallol.  This Vt = total volume (3 ml).
principle was employed in a rapid and convenient method for the Vs = volume of the sample (0.1ml).
determination of the enzyme concentration.
2.2.6.3. Lipid Peroxidation (LPO)[25].
Procedure The level of thiobarbituric acid  reactive substance (TBARS) and
a) For Control malondialdehyde  (MDA)  production  was  measured  in  stomach
To 2.9 ml of Tris buffer, 0.1 ml of pyrogallol solution was added mixed homogenate by the  modified method as  described  by Draper  and
and reading was taken at 420 nm, exactly after 1.5 min and 3.5 min. Hadley [18]. The gastric juice (50 5ØßL) was deproteinized by adding
The absorbance per two minutes was recorded and the concentration 1mL of 14% trichloroacetic acid and 1mL of 0.6% thiobarbituric acid.
The mixture was heated in a water bath for 30 min to complete the
of pyrogallol was adjusted (by diluting the pyrogallol solution) so
reaction, and then cooled on ice for 5 min. After centrifugation at
that the rate of change of absorbance per minute was approximately
2000 g for 10 min, the absorbance of the colored product (TBARS)
0.020 – 0.023 nm.
was  measured  at  535  nm  with  a  UV  spectrophotometer. The
concentration of TBARS was calculated using the molar extinction
b) For Sample
coefficient  of malondialdehyde  (1.56 ×  105 mol/L/cm) using  the
To 2.8 ml of Tris buffer, 0.1 ml of gastric juice sample was added,
formula,
mixed and started the reaction by adding 0.1 ml of adjusted pyrogallol A = CL,
solution (as per control). It was read at 420 nm exactly after 1.5 min  where A = absorbance,  = molar coefficient, C = concentration, and
and 3.5 min and absorbance per 2 minutes was recorded. L = path length.
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
2.2.6.4. Reduced Glutathione(GSH)[26] by increased levels of Malondialdehyde, a marker of increased lipid
Stomach homogenate was mixed with equal volume of ice cold 5 % peroxidation. The harmful effects of  ethanol thus manifest either
TCA and the precipitated proteins were removed by centrifugation. through direct generation of reactive metabolites that include free
The supernatant was added to equal volumes of 0.5 M Tris-HCl, pH radical species that react with most of the cell components, therefore
9.0  containing  20mM  DTNB  to  yield  yellow  chromophore  of
changing their structures, and functions, or by contributing to other
thionitrobenzoic acid, which was measured at 412 nm. GSH was used
mechanisms that finally support oxidative damage21. Accordingly, it
as a reference standard. The activity of GPx was expressed as nM of
was observed  that absolute ethanol  administration to  rats caused
GSH oxidized/min/ml.
blood in the lumen, small & large erosions. However, pretreatment
2.2.6.5. Myeloperoxidase activity (MPO)[27] with test substances reduced severity of ethanol induced ulcer and
Myeloperoxidase  (MPO)  activity  in  the  duodenal  mucosa  was oozing of blood into lumen of the stomach.  (Fig:1 A - I).
measured according to the method of Bradley et al.14. Pre-weighed Fig: 1 Images of Stomachs of rats after ethanol induced ulcer.
tissue was homogenized (1:10 wt/vol) in 0.5% hexadecyltrimethyl
ammonium bromide in 50 mMpotassium phosphate buffer (pH 6.0)
before sonication in an ice bath for 20 sec. Three freeze/thaw cycles
were performed  followed by  sonication (20 sec  in ice  bath).  The
samples were centrifuged at 17000 g (5 min, 4°C) and myeloperoxidase
in the supernatant was assayed by mixing 0.1 ml of supernatant and
2.9 ml of 50 mMpotassium phosphate buffer (pH 6.0) containing A) Normal control B) Diseasecontrol C) Standard treated
0.167  g/L  o-dianisidinedihydrochloride  and  0.0005%  hydrogen
peroxide. The change in absorbance at 460 nm was measured for 4
min using an UV spectrophotometer.

2.2.7. Histopathological evaluation [27]

The  stomachs  were  immersed  in  10  %  formalin  solution  for
histopathological examination. These  were  examined  for D)Vitamin E treated E)Cysteine treated F) Niacinamide treated
histopathological changes such as congestion, hemorrhage, necrosis,
inflammation, infiltration, erosion and ulcers.

2.2.8. Statistical analysis

The values expressed as mean ± SEM from six animals. The results
were  subjected  to  statistical  analysis  by  using  one  way ANOVA
followed by Tuckey’s test to verify the significant difference if any
among the groups.
3. RESULTS AND DISCUSSION
Peptic ulcer is recurrent and common now days that are full of stress
and anxiety. It is thought to result from an imbalance between the
aggressive (acid, pepsin, bile &H. pylori) and the defensive (gastric
mucus & bicarbonate secretion, prostaglandins, nitric oxide, innate
resistance of mucosal cells) factors[28].  Among the various causes of
gastric ulceration lesions are caused by stress, alcohol, H. pylori &
due to use of NSAIDs that have been shown to be mediated largely
through generation of reactive oxygen species (ROS), especially the
hydroxyl radical.    Absolute Ethanol (5 ml/kg) causes gastric damage
by  altering  protective  mechanism,  including  decreasing  mucus
production and blood circulation within the mucosa. Ethanol also
triggers imbalances in cellular antioxidant processes. For example, it
causes the release of superoxide anion and hydroperoxy free radicals,
and hence, increased oxidative stress in the tissues, was evidenced
G) Thiamin treated H) Iron treated I) Zinc treated
In ulcerated rats, which are pretreated with antioxidants (Vitamin E,
Cystine) vitamins (Vitamin B1, Niacinamide) minerals (Zinc, Iron)
there  was  nearly  similarity  in  the  volume  of  gastric  juice  when
compared with disease control (ethanol treated) & standard drug
(omeprazole) treated rats (Table 1).
The pH of gastric juice collected at the time of sacrifice  was less
3.12±0.11 in disease control (ethanol treated) rats, standard drug
(omeprazole) treated rats shows maximum pH 6.34±0.03 and there
was significant increase in pH in pretreated rats when compared with
disease control. Cystine, Vitamin B1 and Iron treated rat’s shows
maximum pH than Vitamin E, Niacinamide and Zinc treated rats
respectively (Table 1).
Total  acidity  is  highest  in  disease  control  (ethanol  treated)  rats
124.41±3.81 and minimum in standard drug (Omeprazole) treated rats
58.99±0.95 in pretreated test groups total acidity is lower than disease

Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209

 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
Table:1. Effect of test substance on various gastric parameters in ethanol induced ulcer in rats.
Gr oup Tre atme nt Do se pH Vo l u m e Total Acidity Ulcer Index % Protection
No ( ml ) (mEq/L)

1 Normal  control 0.2 ml/  rat  4.51 ±0.08 3.25±0.10 89.10 ±1.29 0 NA
2 Disease  control 0.2 ml/  rat 3.12±0.1 1* 3.11±0.18 124 .41±3.81* 1 NA
3 Omeprazole  treated 20 mg/kg 6.34±0.03 # 3.28±0.13 58.99±0.95 # 0.3±0.06 # 70 ±6.83
4 Vit.  E  treated 45 mg/kg 4.25±0.10 3.21±0.09 96.18±3.55 # 0.83±0.06 16.66 ±6.08
5 Cystein  treated 1.05  mg/kg 4.33±0.09 3.28±0.13 100.85 ±4.38 0.80±0.09 19.44 ±9.04
6 Niacinamide  treated 1.4 mg/kg 4.35±0.07 3.18±0.09 98.91±3.40 # 0.69±0.12 30.55±12.48
7 Vit.  B1  treated 54 mg/kg 5.07±0.20 # 3.11±0.06 81.97±5.55 # 0.55±0.09 # 44.44 ±9.29
8 Zinc  treated 1  mg/kg 4.28±0.12 3.2±0.13 99.63±3.99 # 0.83±0.04 16.66 ±4.30
9 Iron  treated 1  mg/kg 5.06±0.07 # 3.43±0.14 82.95±1.63 # 0.38±0.18 # 61.11±18.08

Data was expressed as mean ± S.E.M. (n= 6) by one way ANOVA followed by Tuckey’s test.
* indicates significant difference in data as compared to normal control group (p<0.05)
# indicates significant difference in data as compared to disease control group (p<0.05)
control rats. Vitamin E, Vitamin B1 and Iron treated rat’s shows less mucosal  ulceration  has  been  reported30.In  the  present  study,  the
total  acidity  than  Cystine,  Niacinamide  and  Zinc  treated  rats increased pepsin activity with decrease in mucin secretion in the
respectively (Table 1). disease  treated rats indicated altered hydrophobicity and reduced
protective ability of  the  mucosal membrane against hemorrhagic
Ulcer index of  disease control (ethanol treated) rats is 1 which is erosions, thus resulting in tissue damage. Besides antioxidant action
lower in standard drug (Omeprazole) treated rats 0.3±0.06 which were that protects the  mucus layer and arrest ulcer  progression, drugs
nearly significant in Iron treated rats 0.38±0.18 vitamin treated groups that increase the synthesis and secretion of gastric mucus showed
shows significant ulcer index than mineral & antioxidant treated gastric ulcer healing.
groups (Table 1).
Accordingly, it was found that mucin content in all rats pretreated
70 % Protection was observed in standard drug (omeprazole) treated with test groups were increased and pepsin activity were decreased
rats, which were nearly significant in Iron treated rats 61.11, Vitamin significantly (p<0.05) when compared with disease control treated
B1 shows 44.44 % protection which is higher than Vitamin E, Cystine, rats. This suggests that gastroprotective effect and role of enhancing
Niacinamide and Zinc treated rats respectively (Table 1). Therefore, mucosal resistance to acid and inhibition of pepsin activity may be
in  case  of  acid secretory  parameters  test  substances  reproducible sufficient to heal the ulcers.  In case of Biochemical parameters (Mucin
results  where  Cystine, Vitamin  B1  and  Iron  treated  rats showed and pepsin levels) test substances Vitamin E, Niacinamide and Iron
significant results than Vitamin E, Niacinamide and Zinc treated rats treated rat’s shows significant results than Cystine, Vitamin B1 and
respectively (Table 1). Zinc treated rats respectively (Table 2).
Table: 2 Effect of test substance on biochemical parameters in
The importance of mucus secretion as a response to gastric mucosal ethanol induced ulcer in rats.
trauma has long been recognized.  Mucosal barriers are  the most
Gr oup Treatment Mucin (µg alcin blue/g Pepsin (μmoles
significant  factors for gastric protection. Mucus also  protects  the No of glandular tissue Tyrosine / ml)
mucosa and sub-mucosa from inflammatory reaction, and higher the
1 Normal  control 638.58±10.07 11.07 ±1.04
mucin content lower is the free acidity. In the stomach, the integrity 2 Disease  control 417.30±12.65* 23 .65±0.9 4*
of the mucus layer is continuously being challenged by the corrosive 3 Omeprazole  treated 553.27±8.42 # 7.42±0.10#
action  of  acid  and  pepsin,  and  often  by  bile  salts present  in  the 4 Vit.  E  treated 492.40±18.56 # 20.85 ±0.87
5 Cystein  treated 470.68±6.10 # 20.65 ±2.11
refluxed duodenal contents[18]. 6 Niacinamide  treated 473.56±11.32 # 19.31 ±1.61
7 Vit.  B1  treated 465.23±15.86 # 20.96 ±2.61
8 Zinc  treated 488.28±22.78 # 18.55±0.56#
Recent evidence has shown that pepsin may have a role in the etiology 9 Iron  treated 507.32±13.81 # 15.35±1.27#
of gastric ulceration and cancer[29]. This suggests that inhibitors of
acid secretion may prevent  ulceration not only  by the removal of Data was expressed as mean ± S.E.M. (n= 6) by one way ANOVA followed
acid, but also  by  inactivation of pepsin  following the subsequent by Tuckey’s test.
* indicates significant difference in data as compared to normal control
rise  in  gastric pH.  Therefore,  acid  secretion  may  not  have  to  be group (p<0.05)
suppressed to prevent the development of gastric ulcers, since the # indicates significant difference in data as compared to disease control
inhibition of pepsin activity alone may be sufficient to heal the ulcers, group (p<0.05)
and the side effects of suppressing acid secretion can be avoided. Ethanol decreases the CAT, GSH and  SOD levels resulting in an
Proteolytic  activity  of  pepsin  as  the primary  aggressor in  gastric accumulation  of  free  radicals  causing  deleterious  effects  in  the
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
Table: 3. Effect of test substance on antioxidant enzyme levels in ethanol induced ulcer in rats.
Gr oup Tre atme nt SO D (U/ml) C a t al a s e MDA M ye lo pe r o xidase G S H
No (U/ml) (nM/ml) (U/g tissue) (nM GSH
o x idiz e d/m in/m l)

1 Normal  control 1.44±0.10 5.07±0.41 1.01±0.02 5.76±0.05 255.75 ±4.40

2 Disease  control 0.63±0.0 5* 1.22±0.0 5* 2.6±0 .0 8* 7.48±0.0 7* 115 .61±4.59*
3 Omeprazole  treated 1.15±0.04 # 3.23±0.06 # 0.85±0.02 # 5.28±0.08 # 221.47±8.37 #
4 Vit.  E  treated 1.03±0.03 # 2.70±0.36 0.95±0.06 # 5.84±0.18 212.62±9.91 #
5 Cystein  treated 1.08±0.03 # 2.15±0.23 0.88±0.02 # 6.07±0.194 226.89±8.07 #
6 Niacinamide  treated 1.05±0.01 # 2.15±0.29 0.79±0.05 # 6.09±0.30 232.34±5.75 #
7 Vit.  B1  treated 1.00±0.02 # 2.38±0.28 0.84±0.03 # 6.00±0.26 218.56±15.25 #
8 Zinc  treated 1.06±0.01 # 2.51±0.44 0.91±0.03 # 6.08±0.26 223.39±11.34 #
9 Iron  treated 1.02±0.02 2.81±0.24 0.95±0.00 5.86±0.15 217.10±11.00

SOD- superoxide dismutase; CAT- catalase; MDA- malonaldehyde; GSH- reduced glutathione
Data was expressed as mean ± S.E.M. (n= 6) by one way ANOVA followed by Tuckey’s test.
* indicates significant difference in data as compared to normal control group (p<0.05)
# indicates significant difference in data as compared to disease control group (p<0.05)

integrity and function of the membrane. Absolute ethanol promoted Superoxide dismutase (SOD) plays an important role in providing
the depletion of the non-protein sulfhydryl groups and the decrease gastroprotection partially by preventing oxidative damage. CAT is a
of the CAT activity in the gastric mucosa. The release of superoxide highly  reactive  enzyme  that  reacts  with  H2O2 to  form  water  and
anion and hydroperoxy free radicals during metabolism of ethanol as molecular oxygen30. Gastric wall has high concentration of GSH that
oxygen derived free radicals has been found to be involved in the provides protection against oxidative damage induced by necrotizing
mechanism of acute and chronic ulceration in the gastric mucosa[31]. agents,  such as ethanol, acetic acid, carcinogens and NSAIDs as
Fig: 2. Histopathology of Stomach of Ethanol induced ulcer.

a)                                                     b)                                                                      c)

d)                                                                    e)                                                              f)

  g)                                                                    h)                                                              i)
a) Normal control, b) Disease control, c) Standard drug (Omeprazole) treated, d) Cysteine treated, e) Iron treated , f) Niacinamide treated, g) Vitamin E treated, h) Vitamin
B1 treated, i) Zinc treated.
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
well as by ischemia reperfusion. The depletion of GSH in gastric
tissue is associated with the increased risk of gastric injury32. GSH
and related enzymes in tissues particularly glutathione peroxidase
have  been  proposed  as  potential  chemopreventive  agents  due  to
their antioxidant and detoxification properties[33].
MPO  activity  is  closely  associated  with  neutrophil  dependent
inflammatory response in experimental ulcer. MPO and other tissue
damaging substances are released from the cells to gastric lumen
during  ulcerogenesis.  MPO  mediates  LPO  and  increased  MPO
activity has been reported in diclofenac sodium induced ulcer[34]. In
all the ulcer models investigated the MPO activity was found to be
increased concomitantly with the gastric lesion.Malondialdehyde is
the  end  product  of  lipid  peroxidation  and  is  a  measure  of  lipid
peroxidation level. Lipid peroxidation is an important reason for cell
membrane damage.
Rats treated with disease control group shows decrease in the levels
of SOD, CAT and GSH and increase the levels of MPO and MDA
when  compared  with  normal  control  treated  rats.  However  test
substances treated rats showed significant restoration i.e., increased
the level of SOD, CAT and GSH and significantly reduce the lipid
peroxidation  and  decreased  the  levels  of  MPO  and  MDA  when
compared  with  disease  control  group  suggesting  that,  all  test
substances  treated  rats  decreased  the  risk  of  gastric  injury  and
ulceration in the gastric mucosa. In  case  of antioxidant enzymes
(SOD, CAT, GSH, MPO and MDA) test substances Cystine, Vitamin
B1 and Iron treated rat’s shows significant results than Vitamin E,
Niacinamide and Zinc treated rats respectively (Table 3).
The observations by the histological examination of stomach excised
from the experimental rats were presented in (Fig:2 a-i). Arrow indicates
the size of cell; disease control, All test substances treated group
shows  cell  hyperplasia  (increased  cell  mass)  and  congestion
(unstained white space within cell) compared to normal control group,
disease control group shows perforation which can be identified by
the  redness  in  figure  and  absence  of  cell,  cell  hyperplasia  and
congestion represents damage to stomach wall.
4. CONCLUSION
The study was taken up to explore the critical role of few selected
antioxidants, vitamins and minerals on gastroprotection by using
ethanol induced ulcer model in rats which concludes that all test
groups antioxidants (Vitamin E and L- Cystine), vitamins (Thiamin
and Niacinamide) & minerals (Iron and Zinc) can be used as adjuncts
in antiulcer drug  formulations  which act  as  cytoprotective
mechanisms. The antiulcer activity of all test groups may be attributed
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017
to its antisecretory and antioxidant activities. The ulcer preventing
action of the test substances might probably by restoring the gastric
mucin  content,  depleting  pepsin  content  and  by  reducing  lipid
peroxidation & oxidative damage. The effect of antioxidants, vitamins
and  minerals  are  effective  in  treating  peptic  ulcer  disease  when
compared to standard omeprazole. Cystine, Vitamin B1 and Iron is
more significant than Vitamin E, Niacinamide and Zinc respectively.
Antioxidants, Minerals and Vitamins are widely used as ingredients
in dietary supplements and prevent various diseases. Therefore, it
helps in  reducing  toxicities  and  providing  safe  therapy,  helps  in
smooth management of disease as well in repairing & rejuvenating
the cells.
It  is  a  viable  project  and  results  can  be  immediately  applied  to
therapeutic management because antioxidants, minerals and vitamins
are already used in clinical practice.
ACKNOWLEDGEMENT
The  authors  gratefully  acknowledge  the  encouragement  of
Management,  Principal  and  Saff  of  HSBPVT’s  GOI  College  of
Pharmacy, Kashti, Pune University, Maharashtra, India.
REFERENCES
1. Vonkeman HE, Klok RM, Postma MJ, Brouwers JR, van de
Laar MA. Direct medical costs of serious gastrointestinal
ulcers among users of NSAIDs. Drugs Aging 2007; 24: 681–
90.
2. Ineu RP, Pereira ME, Aschner M, Nogeueira CW, Zeni G,
Rocha JB. Diphenyldiselenide reverses gastric lesions in
rats: involvement of oxidative stress. Food ChemToxicol
2008; 46: 3023–9.
3. Tripathi KD. Essentials of Medical Pharmacology. 6th edition.
New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publisher (P) Ltd; 2008.
4. Smith GS, Mercer DW, Cross JM, Barreto JC, Miller TA.
Gastric injury induced by ethanol and ischemia-reperfusion
in the rat. Dig Dis Sci 1996; 41: 1157–64.
5. Cadirci E, Suleyman H, Aksoy H, Halici Z, Ozgen U, Koc A,
et al. Effects of Onosma armeniacum root extract on ethanol-
induced oxidative stress in stomach tissue of rats. ChemBiol
Interact 2007; 170: 40–8.
6. Mota CS, Freitas RB, Athayde ML, Boligon AA, Augusti P,
Somacal S, et al. Effect of Vernoniacognata on oxidative
damage induced by ethanol in rats. Hum ExpToxicol 2011;
30: 675–84.
7. Liu Y, Tian X, Gou L, Fu X, Li S, Lan N, et al. Protective
effect of L-citrulline against ethanol-induced gastric ulcer
in rats. Environ ToxicolPharmacol 2012; 34: 280–7.
201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
8. Ineu RP, Pereira ME, Aschner M, Nogeueira CW, Zeni G,
Rocha  JB. Diphenyldiselenide reverses gastric lesions in
rats: involvement of oxidative stress. Food ChemToxicol
2008; 46: 3023–9.
9. Choi E, Hwang H, Kim I, Nam T. Protective effects of a
polysaccharide  from  Hizikiafusiformis  against  ethanol
toxicity in rats. Food ChemToxicol 2009; 47: 134–9.
10. Kaharaman A, Erkasap N, Köken T, Serteser M, Aktepe F,
Erkasap S. The antioxidative and antihistaminic properties
of  quercetin in ethanol-  induced gastric lesions. Toxicol
2003; 183: 133–42.
11. Amaral GP, de Carvalho NR, Barcelos RP, Dobrachinski F,
PortellaRde  L,  da  Silva  MH,  et  al.  Protective  action  of
ethanolic extract of Rosmarinusofficinalis L. in gastric ulcer
prevention induced by ethanol in rats. Food ChemToxicol
2013; 55: 48–55.
12. Calam J, Baron JH. ABC of the upper gastrointestinal tract:
patho-physiology of duodenal and gastric ulcer and gastric
cancer. Br Med J 2001; 323: 980–2.
13. Bandyopadhyay,  Debashis,  Chattopadhyay,  Aindrila.
Reactive  Oxygen  Species-Induced  Gastric  Ulceration
Protection by Melatonin. Current Medicinal Chemistry. 2006;
13 (10): 1187-1202.
14. Kelly  Samara de  Lira mora, Guilherme  Eduardo
NunesDias,MeriEmili Ferreira Pinto,AndersonLuizFerreira,
Alba Regina Monteiro Souza Brito,Clelia Akiko Hiruma Lima
and  et.al. Flavonoids  with  gastroprotective  activity,
Molecules. 2009; 14: 979-1012.
15. Ahmed KA, Al-radahe S, Ahmed KA, Salama S, Abdulla
MA. Anti-ulcer activity of Swietenia mahagoni leaf extract
in ethanol-induced gastric mucosal damage in rats Anti-
ulcer activity of Swietenia mahagoni leaf extract in ethanol-
induced gastric mucosal damage in rats. Journal of Medicinal
Plants Research 2012; 6(12): 2266-2275.
16. De Pasquale R, German MP, Keita A, Sanogo R, Iauk L.
Antiulcer activity of Pteleopsissuberosa. J. Ethnopharmacol
1995; 47: 55-58.
17. Hollander D, Tarnawski A, Krause WJ, Gergely H. Protective
effect of sucralfate against alcohol-induced gastric mucosal
injury in the rat. Macroscopic, histologic, ultrastructural,
and functional time sequence analysis. Gastroenterology
1985; 88: 366-374.
18. Munis S, Narmadha K, Geetha A, Saranya P, Women B,
Chennai N, et al. Gastroprotective effect of swertia chirayita
. Pharmacologyonline 2010; 355: 332–55.
Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017
19. Suralkar  A,  Gund  KA.  Gastroprotective  effect  of  abrus
precatorius  on  ethanol-induced  and  aspirin  +  pylorus
ligation-induced peptic ulcer in rats. Asian J Pharm Clin
Res. 2014; 7(1): 57–62.
20. Suzuki Y, Hayashi M, Yamagami I Antiulcer effect of 4’-(2-
carboxyetyl) phenyl trans-4-aminom ethyl
cyclohexanecarboxylate  hydrochloride  (cetraxate)  on
various experimental gastric ulcers in rats. Japan Journal of
Pharmacology 1976; 471-480.
21. Adinortey MB, Ansah C, Galyuon I, Nyarko A.  In Vivo
Models  Used  for Evaluation  of  Potential  Antigastro
duodenal Ulcer Agents. Hindawi Publ Corp Ulcers. 2013;
1–12.
22. Kaori I, Masako H, Suichi K, Suichi E. Effect of carnosine
on the gastric secretion in rats. Trace Nutr Res. 2005; 22:
121–4.
23. Yogesh G, Deepmala D, Surwase S, Urjita Z. Study of the
Serum Superoxide Dismutase Levels in Smoking and Non-
Smoking  Patients  with  COPD.  International  Journal  of
Recent Trends in science and Technology.  2013; 5(3): 121–
6.
24. Abei H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984; 105(C):
121-6
25. Onoja SO, Omeh YN, Ezeja MI, Chukwu MN. Evaluation of
the in vitro and in vivo antioxidant potentials of aframomum
melegueta methanolic seed extract. J Trop Med. 2014; 1-6.
26. Saranya P, Geetha A. Antiulcer activity of Andrographis
paniculata ( Burm . f .) Wall . against cysteamine- induced
duodenal ulcer in rats. Indian J Exp Biol. 2011; 49: 525–33.
27. Deshpande S, Shah GB and Parmar NS. Antiulcer activity of
a aqueous extracts of Basellarubrain albino rats. J. Natural
Remedies.2003; 3(2): 212-214.
28. Jaiswala S, Raoa C, Sharma B Gastroprotective effect of
standardized leaf extract from Argyreias peciosaon experimental
gastric ulcers in rats. Journal of Ethnopharmacology 2011; 137:
341– 344.
29. Plebani  M. Pepsinogens  in health and  disease.  Crit  Rev
Clin Lab Sci. 1993; 30:273–328.
30. Saranya P, Geetha A. A biochemical study on the gastroprotective
effect of hydroalcoholic extract of Andrographis paniculata in
rats. Indian J Pharmacol. 2011; 43(4):  402–408.
31. Kore J., Bramhakule P., Rachhadiya M Evaluation of antiulcer
activity of protocatechuic acid ethylester in rats. Int. J. of
Pharm. & Life Sci. 2011;  909-915.
201-209
 Shah Darshan Vinod / Journal of Pharmacy Research 2017,11(3),201-209
32. Robert A, Eberle D, Kaplowitz N. Role of glutathione in aspirin-induced  gastric  damage  in humans:  Gastro
gastric mucosal cytoprotection. Am J PhysiolGastrointest protection by vitamin C. Aliment PharmacolTher. 2001; 15:
Liver Physiol. 1984; 247: 296–304. 677–87.
33. Pohle  T,  Brzozowski  T,  Becker  JC,  Vander  Voort  IR, 34. Matsui H, Murata Y, Kobayashi F, Shiba R, Momo K, Kondo
Markmann A, Konturek SJ, et al. Oxygen metabolities in Y, Nakahara A, et al. Diclofenac- induced gastric mucosal
flurescence in rats. Dig DigSci 2001; 46: 338-344.

Source of support: Nil; Conflict of interest: None Declared

Journal of Pharmacy Research Vol.11 Issue 3 March 2017 201-209