Identicación del promotor PLH−77 en

Paenibacillus Polymixa
Cedeño Adonis
Mejía Karen
Portilla Diego
13 de junio de 2019

1
Índice
1. Antecedentes 4
1.1. Promotor, o región promotora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2. Partes de un promotor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.1. Promotor mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2. Promotor distal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.3. Promotor proximal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3. Tipos de promotores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4. Importancia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2. Introducción 6
2.1. Tipos de promotores en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2. Promotores constitutivos en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.1. De origen viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.2. Propios de la planta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3. Promotores inducibles en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1. Por temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.2. Por luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.4. Promotores sintéticos o quiméricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.5. Diferencias entre promotores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.6. Identicación de un promotor en el genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.6.1. Métodos bioinformáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.6.2. Métodos que usan la genómica funcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.7. Bases de datos de promotores y factores de transcripción existentes en plantas . . . . . . 9

3. Desarrollo 10
3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.1.1. ¾Porqué el gen es importante? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.1.2. ¾Porqué analizar el promotor del gen asignado? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2. Metodología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2.1. Protocólos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2.2. Material biológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

4. Conclusiones 12
5. Recomendaciones 12
6. Anexos 13
6.1. Figuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
6.2. Tablas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2
Índice de guras
1. Promotor mínimo y secuencias reguladoras (motifs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. Tipos de promotores según patrones AT-CG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3. Promotor distal y basal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4. Promotores según especicidad y función en humanos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Índice de cuadros
1. Diferencias entre promotores de distintos dominios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2. Bases de datos de promotores y factores de transcripción existentes en plantas . . . . . . 14

3
1. Antecedentes
1.1. Promotor, o región promotora
Toda secuencia de DNA que inicia y regula la expresión de un gen [Ranganathan et al., 2019], se
considera un promotor . Marcan el sitio de transcripción, que puede reconocerse por una RNA polimerasa,
y son capaces de unirse a una variedad de proteínas reguladoras o factores de transcripción. Se encuentra
en 1 de las 2 hebras de DNA y tienen una longitud de 100-1000 pb.
Un gen será transcrito si tiene la combinación correcta de factores de transcripción unidos al promotor.
La metilación juega un rol esencial en la regulación genética, al bloquear los promotores que podrian
activar los factores de transcripción. En su identicación pueden usarse diversas técnicas como la regresión
por predicción de estructuras 3D, etc.

1.2. Partes de un promotor.

La regulación genética es un proceso combinatorio que abarca el uso de varios elementos reguladores.
Entre ellos destacan los factores de transcripción, promotores, amplicadores (enhancers) y aisladores
(silencers). De ellos, los promotores son los más sencillos de identicar [Kesarwani et al., 2018] gracias a
la "simpleza"de su estructura: Un promotor mínimo o basal, uno distal y uno proximal.

1.2.1. Promotor mínimo

Es la secuencia mínima de DNA que puede iniciar la transcripción[Butler and Kadonaga, 2002] in
vivo. Es capaz de asegurar la unión a RNAp, tiene direccionalidad 3'-5', tiene 50 − 100bp por unidad
de reconocimieto [DeGuglielmo and Fernandez, 2016] alrededor de los TSS y actúa como sitio de unión
del factor de transcripción [Kesarwani et al., 2018] y, por tanto, puede identicarse zonas con secuencias
especiales. (Figura 1)
Las secuencias reguladoras son secuencias de DNA con una fuerte tendencia de unión hacia los ele-
mentos reguladores (Factores, enhancers, silencers). Algunas secuencias reguladoras generales son (Figura
1):

Caja tata Fue el primer promotor en identicarse[Butler and Kadonaga, 2002]. Es una región de
enlace a proteínas que siempre presenta una repetición de las bases TATAAA. Suele presentarse
encima de la región que inicia la transcripción.

Islas CpG Región de enlace con ≈ 500pb que presenta bases C y G unidas por un enlace fosfato.
Formalmente, se necesita un porcentaje de bases CpG mayor al 50 % para reconocerlo como tal
[Butler and Kadonaga, 2002]. Cuando desean evitar la unión de un factor, presentan metilaciones.
Este hecho evidencia la relación entre la metilación y la regulación de la expresión.

BRE (TFIIB recognition element) Se ubica encima (3' a 5') de la caja TATA y se usa para unir
al TFIIB.

Iniciador Inr Comprende el sitio de inicio de la transcripción. La presencia de la caja TATA carece
de relación para la presencia del iniciador. Se une a TFIIB, TAF II 150 y TAF II 250 como factores
principales.

DPE (Downstream promoter element) Secuencia reguladora identicada en Drosophila sp. Reco-
noce a TFIIB y, junto a Inr, regula su unión al gen.

Existen muchas otras secuencias reguladoras, incluso entre especies y subespecies. El genoma eucarió-
tico podría exhibir más de 10 clases genéricas y distintas de promotores génicos respecto a su composición
[Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, 2012]. En ellas, cada una tiene patrones especícos que aumentan la
diversidad de los promotores. La base de datos PlantPromPB, que guarda la información genética de
varias especies de arroz y Arabidopsis sp., contiene más de 8301 promotores con cerca de 31 259 secuen-
cias reguladoras de secuencias diferentes [Amitha and Srinivasan, 2017]. Por tanto, es imposible crear un
listado de los tipos de promotores según su estructura.
Aún así, [Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, 2012] proponen un modelo matemático, basado en el índice
de coincidencia de las bases dentro del promotor, para clasicar sus secuencias (Figura 2).

4
1.2.2. Promotor distal
Es el conjunto de secuencias que se encuentran encima (upstream) del TSS. Tienden a contener
secuencias reguladoras esenciales.(Figura 3)

1.2.3. Promotor proximal

Es el conjunto de secuencias que se encuentran debajo (downstream) del TSS. Las secuencias que
contienen suelen tener menos inuencia sobre la regulación de la transcripci'on. (Figura 3)

1.3. Tipos de promotores.

Se preere una clasicación por funcionalidad, antes que por la presencia de cierto patrón en las
bases. Así, según [DeGuglielmo and Fernandez, 2016], se reducen los tipos de promotores a:

1. Constitutivos: Se encuentran ubicados en la mayoría en los tejidos del organismo. Estos promo-
tores promueven altos niveles de expresión transgénica, los cuales han sido utilizados en plantas
mono y dicotiledóneas. Siendo las dicotiledóneas las más beneciadas por que poseen un mayor
nivel de expresión.

2. Inducibles: Estos se pueden activar bajo condiciones experimentales controladas. Además, per-
miten un control espacial y temporal más preciso de la expresión transgénica y permiten analizar
la expresión de nuevos genes, sin causar alteraciones en el desarrollo del organismo.

3. Sintéticos: Presentan una organización en número y ubicación, produciendo cierta distancia, la

cual afecta la interacción con factores de transcripción. y determina la fuerza, así como las carac-
terísticas espaciales y temporales de la expresión genética.

4. Especícos a tejidos (estadio-especícos): Se encuentran principalmente en los tejidos, permi-

te mejorar la expresión de cualidades o características vegetales de interés agronómico, farmacéutico
y/o comercial, tener un mejor control temporal y conocer las rutas metabólicas de un órgano o
tejido particular para la identicación de nuevos promotores y genes blanco.

Sin embargo esta clasicacón está incompleta, pues aún existen tejidos, órganos e incluso sistemas
que dependen de la regulación por promotores especícos (Figura 4).
[Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, 2012] propone una clasicación por repetición de patrones AT-CG
que crea cerca de 10 clases de promotores (Figura 2).

1.4. Importancia.
La transcripción es un paso fundamental en la expresión de genes [Wingender et al., 2018]. El estudio
de los promotores permite aclarar el complicado y ampliamente interrelacionado mecanismo de transcrip-
ción en eucariotas [Butler and Kadonaga, 2002]. [Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, 2012] declara que el
control homeostático de los productos génicos es regulado por los promotores, a través de su integración
en las respectivas rutas metabólicas.
El potencial que ofrece la identicación de promotores recae en su inuencia y control sobre el
metabolismo de las plantas. Pueden mejorarse para aumentar la esperanza de vida, la reproducción
o la generación de medicinas y nutracéuticos. La importancia de los promotores radica, también, en la
velocidad que se da una expresión genética en organismos genéticamente modicados. También presentan
benecios como el control del nivel de expresión de un gen.
Además, al manipular los promotores se puede controlar, regular y elucidar la expresión de un gen de
interés [Ranganathan et al., 2019, DeGuglielmo and Fernandez, 2016]. Así, su análisis e identicación es
esencial para entender las redes reguladoras transcripcionales[Ranganathan et al., 2019] y la cascada de
señales reguladores, que generalmente se describen en términos de la región reguladora basal. Este tipo
de labor es muy común sobre promotores de semillas en ingeniería genética.
Actualmente los promotores se identican, e incluso se modican, con un análisis cage (Cap Analysis
of Gene Expression ) sobre diferentes tejidos para marcar los sitios de inicio de la transcripción (TSS's) y
cuanticar la secuencia del promotor, su uso y la expresión diferencial del gen[Ranganathan et al., 2019,
Kaushik et al., 2018].

5
2. Introducción
Conforme el avance tecnológico se preveen grandes cambios sociales, industriales, e interrelacionales.
El desarrollo biotecnológico también se ha beneciado por dicho avance gracias al desarrollo de sistemas
útiles en la optimización en la modicación génica en organismos. La expresión genética también se
ve afectada, la cual se ve regulada por promotores. Estos son regiones cercanas al ácido ribonucleico
mensajero, los cuales, como se mencionó anteriormente, regulan la transcripción. Sin más, se dice que un
promotor es una secuencia de ADN localizada en la región codicante de un gen.
La estructura de un promotor varía, ya que puede contener secuencias de ADN que actúan como
sitios de unión que pueden activar o inhibir una transcripción. Estos, constan un núcleo del promotor
y regiones de regulación. En donde el núcleo interactúa con la maquinaria de transcripción que pueden
iniciar la transcripción en algunos promotores y las regiones reguladoras se unen a proteínas y a los sitios
de iniciación de transcripción, además, que regulan la actividad del núcleo del promotor.
La importancia de los promotores, radica en la velocidad que se da una expresión genética en organis-
mos genéticamente modicados. También presentan benecios como el control del nivel de expresión de
un gen. Actualmente, el estudio se enfoca en buscar promotores vegetales, tales que, dirijan altos niveles
de expresión transgénica, permitan introducir múltiples transgenes y evitar el riesgo de silenciamiento
genético.

2.1. Tipos de promotores en plantas

Al manipular el material genético de plantas se puede usar distintos tipos de promotores, que se
distinguen por su función y especicidad, como:

Constitutivos: Regulan la expresión en casi todos los tejidos. Su regulación es bastante indiferente a
factores endógenos. Su inuencia es tal, que se mantienen promotores constitutivos incluso entre
especies y reinos [Amitha and Srinivasan, 2017]. El promotor modelo por defecto es CaMV35S, que
se aisló e identicó de un virus infector de coliores en 1987.
Especícos a órganos-tejídos: Su expresión es común en cierto tipo de tejidos pero no está condi-
cionada, así que puede darse en tejidos insospechados.
Especícos a semillas-frutas: Cuando una semilla germina, la expresión de ciertas proteínas es
altísima. Por tanto, estos promotores son especialmente útiles en ingeniería genética. El promotor
del gen β -faseolina del fréjol francés es uno de los más investigados [Amitha and Srinivasan, 2017].
Especícos a tubérculos: Se han identicado en papas, yucas y ocas (yams-ñame). Entre ellos des-
tacan los promotores de las familias de genes B33 y PAT21.
Especícos a las anteras-pólen: Se usan en el control de la esterilidad, especialmente en plantas
transgénicas y en cruces masivos. A9 es un representante de los promotores en Arabidopsis thaliana
sp.
Especícos a raíces: Son esenciales en el desarrollo de técnicas que optimizan la absorción de
agua y nutrientes. Incluso podrían usarse en la expresión de genes para la defensa a patógenos
[Amitha and Srinivasan, 2017], o la resistencia a estrés e insecticidas. TobRB7, de tabaco, es utili-
zado en el desarrollo de plantas transgénicas.
Especícos a hojas: En este caso, los promotores se consideran especícos a tejidos verdes con cloróla.
Los productos génicos que regulan son usados en la respuesta adaptativa ante la luz. El gen DBX1
es uno de los más nuevos, descubierto en plantas de arroz.
Especícos a células y organelos: Los promotores especícos a células con funciones concretas como
los estomas, tricomas, radículas o células acompañantes, son difíciles de asociar. Por ejemplo, el
promotor del sistema citocromo-P450 en tabaco regula también la expresión de tricomas en la
misma planta.
Inducibles: Se encargan de la expresión de un gen como respuesta a un estímulo externo (físico,
químico o ambiental). También brindan regulación. Sus aplicaciones son, de un amplio abaníco de
posibilidades, muy prometedoras. Promotores inducidos por heridas son los objetivos de estudios
que tratan de manejar el sistema regulador de estrés biótico. Otros promotores son: Inducidos por
ácido salicílico (SA), metiljasmonatos (MJ), ácido jasmómico (AJ) o (ABA). El promotor más

6
 común es Rd29A en Arabidopsis thaliana spp. Existen algunos promotores inducibles articiales
[Amitha and Srinivasan, 2017].

Sintéticos: Son creados con promotores mínimos, distales y proximales especícos. Es decir, a menudo
se basan en promotores naturales pero se eliminan secuencias innecesarias (no especícas) o se
introducen nuevas secuencias que potencian la expresión de un gen. En genética, se usan para
escapar del fenómeno de silenciamiento por inducido por homología [Amitha and Srinivasan, 2017].

Muchos de los promotores aquí citados dieren, por su presencia, entre monocotiledóneas y dicotile-
dóneas.

2.2. Promotores constitutivos en plantas

Se encuentran ubicados en la mayoría en los tejidos del organismo. Estos promotores promueven altos
niveles de expresión transgénica, los cuales han sido utilizados en plantas mono y dicotiledóneas para
encontrar y seleccionar células o plantas modicadas genéticamente. Siendo las dicotiledóneas las más
beneciadas carecen de secuencias presentes en el extremo 5' es por eso que poseen un mayor nivel de
expresión, ya que en las monocotiledóneas su efectividad se da a largo plazo y según estudios este tipo
de plantas si tienen presente dichas secuencias.
Los promotores fueron aislados de patógenos vegetales, como virus mosaico de la yuca, virus rayado
de banana, y el virus de mosaico de la colior que últimamente es usado en sistemas transgénicos.
Los promotores más conocidos son:

2.2.1. De origen viral

1. MSgt-P (Mirabilis mosaic virus)

2. pBdEf1α (Brachipodium distachon)

3. CaMV35 (Caulower mosaic virus)

2.2.2. Propios de la planta

1. APX (arroz)

2. PvUbil (césped)

3. OsNCED3 (arroz)

2.3. Promotores inducibles en plantas

2.3.1. Por temperatura
1. NtHSP3A (Tabaco-Calor)

2. NtHSP3B (Tabaco-Calor)

3. Ppbec1 (Durazno-Frío)

2.3.2. Por luz

1. Os02g40240 (arroz)

2. Lea3 (arroz)

3. Uge1 (arroz)

2.4. Promotores sintéticos o quiméricos

1. Fsgt-PFlt (viral, se introduce en tabaco, petunia, tomate, y espinaca)

2. PFlt-UAS-2X (viral, se introduce en tabaco, petunia, tomate, y espinaca)

3. pCL (Combina respuesta a bajas temperaturas con el complejo de respuesta a la sacarosa)

7
2.5. Diferencias entre promotores
La principal diferencia entre DNA procariótico y eucariótico es la cantidad de DNA codicante.
Mientras que el DNA procariota (bacterias) tiene de 6 %14 % de material no codicante, el 98 % del
DNA eucariótico tiene esta cualidad. Por tanto, la proporción de promotores en procariotas es más alta.
Además, los promotores eucarióticos poseen secuencias de tamaño y forma variable, e incluso pueden
seleccionar diferentes exones del mismo gen para producir isoformas [Kaushik et al., 2018]. Las diferencias
son varias. La tabla 1 enuncia las más generales.

2.6. Identicación de un promotor en el genoma

El acelerado desarrollo de la genómica funcional contribuye a la constante identicación, análisis y
secuenciación de promotores. [Amitha and Srinivasan, 2017] señala una tabla con 66 de los promotores
constitutivos identicados entre 2007 y 2014.
Generalmente, se distinguen 2 categorizaciones para los m'etodos que logran la identicación de
promotores: Métodos bioinformáticos y métodos genómico-funcionales.

2.6.1. Métodos bioinformáticos

La predicción de un promotor, desde una secuencia, es uno de los atajos que popularizaron a la
bioinformática. Antes, se buscaba la identicación de promotores en genes o en proteinas codicadas.
Actualmente, se realiza en el genoma completo, pues se sabe que la transcripción ocurre en todo el
genoma. Los modelos in silico se han popularizado inmensamente[Amitha and Srinivasan, 2017].
Varios programas para la predicción de promotores (PPP's) se han desarrollado. Estos se basan en
algoritmos que reconocen promotores de novo en muestras por comparación en bases de datos. Estas bases
pueden contener datos reales o datos validados durante experimentos con footprinting, herramientas de
ajuste y paquetes estadísticos.
Se puede predecir un promotor desde la secuencia del genoma como de datos de expresión (e.g.
proteínas) pero la identicación es insuciente para predecir los productos de la transcripción porque
un gen que se expresa por la regulacion de 1 promotor origina proteínas diferentes si se regula con otro
promotor.
Computacionalmente, la búsqueda en el genoma es diferente a la busqueda en un gen. En el genoma
predomina la funcionalidad sobre la estructuralidad siendo más desaante. Todo método in silico puede
dividirse en 2 tipos[Amitha and Srinivasan, 2017]: por alineación y por enumeración. Sin embargo al
usar ambos métodos, priorizando la búsqueda de novo sobre la comparación en bases de datos, se ha
logrado la mejor eciencia conocida[Gordon et al., 2003] como BLAST.
La optimización de diferentes algoritmos ha empleado modelos probabilisticos [Li et al., 2016] como
el modelo de maximizacion de la espera. Los métodos enumerativos tienen especial enfásis en el uso
de estadísticos. El uso de la distribución normal y de p-valores ha sido de mucha utilidad al identicar
promotores por la coexpresió o por la coregulación sobre rutas logenéticas. Estos métodos son de los m
'as populares porque pueden manejar el genoma completo.

2.6.2. Métodos que usan la genómica funcional

La información que usan los métodos bioinformáticos sobre la huella logenética (phylogenetic foot-
printing) y las secuencias, distancias, orientación de las secuencias reguladoras (motifs) y las coexpresio-
nes y coregulaciones que sufren, los vuelven rápidos pero no fehacientes. Entonces, debe usase métodos
funcionales simultaneamente.
El método tradicional es la clonación del DNA adjunto desde una libreria, usando la secuencia trans-
crita para comparar. Si la secuencia que clonaste era un promotor, debes obtener genes similares al 99.9 %
o rangos similares. Cuando esta tarea es laboriosa, o demanda muchos recursos, se aplican métodos para
el análisis de la expresión [Amitha and Srinivasan, 2017] como:

Supresión de la hibridación sustractiva ( SSH).

Análisis serial de la expresión génica ( SAGE).

Secuenciamiento masivo marcado en paralelo ( MPSS).

Microarrays (Microarreglos). [Yoshiharu et al., 2011]

8
 Técnicas de ensayo por reconocimiento diferencial.

Secuenciamiento del transcriptoma tisular.

Tras identicar los productos transcritos, los promotores pueden clonarse y caracterizarse. Aun así,
estos métodos consumen muchos recurso y requieren de un alto control de técnicas de laboratorio.
Sin considerar que dicilmente pueden detectar genes con poca expresión, o de detectar un promo-
tor de una familia de promotores con funciones parecidas. La validación de los resultados es una ta-
rea verdaderamente titánica. UN método común consiste en agregar un gen que agrega un marca-
dor, que pueda seleccionarse, a la trampa de T-DNA para convertirla en una trampa de promotores
[DeGuglielmo and Fernandez, 2016, Amitha and Srinivasan, 2017]

2.7. Bases de datos de promotores y factores de transcripción existentes en

plantas
Dado que cada organismo presenta mutaciones en su DNA, deben analizarse poblaciones enteras para
obtener una muestra representativa de un gen de interés. Almacenar 1 base en forma de 1 letra, como
código en un archivo, necesita de 8 bits. Con - 3000 millones de pares de bases (3x109 ) se necesitan cerca
de 183.105 Gb por individuo. Actualmente, se usan estrategias que reducen esta cifra a los 750 Mb. Aún
así, almacenar el DNA de diferentes subespecies es una tarea compleja. El manejo es un tema aparte.
Nace así la necesidad de mantener esta información organizada con bases de datos. Algunos ejem-
plos se muestran en la tabla 2.
Actualmente, se usan scripts para automatizar la búsqueda de promotores desde bases de datos.
Un buen ejemplo es TRED [Ranganathan et al., 2019] que emplea el programa para busqueda Firs-
tEF combinado con información del mRNA/EST para la comparación del mRNA entre especies o
cruzas[Wingender et al., 2018].
Las bases de datos pueden ser primarias, si almacenan datos provenientes de la extracción o de la
investigación a priori, o secundarias, si almacenan datos que resultan de las bases primarias. Tambié,
pueden clasicarse en 3 grupos según su contenido:

Bases que almacenan miRNA y genes.

Bases que almacenan las relaciones entre TF's y genes.

Bases que almacenan las relaciones entre TF's y miRNA.

9
3. Desarrollo
3.1. Introducción
Paenibacillus polymixa es un organismo micorízico capaz de generar metabolitos secundarios y esti-
mular el crecimiento vegetal [Li et al., 2019]. Sin embargo, el sistema de expresión génico de la bacteria
aún se está desarrollando. Se crea una trampa de promotores basado en marcado por uorescencia e
identicación por un gen con resistencia al cloranfenicol en polymixa SC2-M1. Se identica al promotor
PLH−77 del gen PPSC2_RS56665. Se evalúa su secuencia y se cuantica su efectividad como promotor.
Para vericar la existencia del promotor, este gen es utilizado para expresar la enzima xilosa isomerasa
en polymixa SC2-M1 y se extrae. La cantidad de xilosa consumida por los extractos se incrementa hacia
una media de 2.5 [g/L] durante una fermentación. Se conrma que el promotor PLH−77 regula la expresión
en P. polymixa SC2-M1.

3.1.1. ¾Porqué el gen es importante?

Paenibacillus polymixa presenta cualidades que lo hacen candidato para el uso en producción agrícola
y bioconversión industrial [Li et al., 2019]. Las cualidades más destacadas son:
Aumenta la resistencia a patógenos, directa o indirectamente.
Ayuda a la adquisicón de recurso de la planta.
Inhibe patógenos vegetales.
Puede liberar fósforo y potasio desde el suelo.
Degrada biomasa, · · ·
y más.
Este gen, en especial, se encarga de la expresión de xilosa isomerasa (XI). Esta enzima cataliza la
conversión de D-Xilosa a D-Xilulosa, pero también puede convertir glucosa en fructosa. Por ello, es
utilizada en la industria alimenticia para la producción de jarabe de fructosa desde 1953. También puede
usarse para obtener etanol (y biocombustibles) desde xilano, degradar almidón para obtener dextrinas y
maltosas e incluso su sacaricación [Li et al., 2019].

3.1.2. ¾Porqué analizar el promotor del gen asignado?

Las redes de regulación génica en P. polymixa son desconocidas. Se han hecho varios avances en los
últimos años pero aún queda mucho por hacer. Así, si se estudia este promotor, se potencia y optimiza
la manipulación del sistema de expresión. Finalmente, la manipulación de este promotor permitirá la
creación de biofábricas dedicadas a la creación de XI con resultados optimizables.

3.2. Metodología
3.2.1. Protocólos
Construcción de la trampa: Se clonaron fragmentos de una proteína uorescente (gfp) desde un
plásmido. El gen resistente a cloranfenicol (cm) se combina con un terminador y se somete a
clonación. Ambos fragmentos se unieron por OE-PCR y se insertaron al plásmido pHY300PLK (p)
entre el gen Bgl II y EcoR I para obtener el plasmido pgc.
Se insertan fragmentos del promotor P43 entre el gen Bgl II y el gen Sal I en pgc dando lugar a
p43gc. Se inserta en el cromosoma de P. polymixa SC2-M1 usando una endonucleasa de restricción
Sau3 A I entre el gen Bgl II y el gen BamH I para obtener el plásmido p-promotor-gc. Se usa un
plásmido diseñado como p-XilA-gc por una empresa externa para comparar la producción de XI.
La amplicación y subclonamiento de los plásmidos se logra con el uso de Escherichia coli DH5α.
Aquí se detallaron los procesos para la obtención de secuencias y para la comple-
mentación in vivo

Cultivos: Se us el medio Luria-Bertani (LB) con ampicilina 100 [µg/mL], tetraciclina 30 [µg/mL] o
cloranfenicol 15 [µg/mL] para el cultivo de E. coli.
P. polymixa se cultivan en LB medio (Difco) con el antibiótico apropiado. Se usan recipientes
triangulares.

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Medición del crecimiento: Se usa un biofotómetro para medir la densidad óptica del cultivo.

Preparación de fragmentos puros: Las colonias de P. polymixa se inoculan por 48h y se recolectan
por centrifugación a 5000 rpm. El kit (Omega biotek) se usa para separar el DNA bacteriano. Se
usa la enzima de restricción Sau3 AI y se recogen los fragmentos con el kit para extracción en gel
(Omega biotek).

Medición de la uorescencia:Los cultivos se preincuban por 24h y se transeren a otro medio

incubador al 10 % LB por 12h. Las muestran se lavan y se diluyen en buer salino PBS para el
análisis. Se usó un espectrouorómetro a 476 y 520 nm. Se obtiene una medida de concentración
uorescente al dividir la uorescencia para la densidad del cultivo.

Análisis de metabolitos: La concentración de xilosa, xilitol, acetato, lactato y etanol se determinan

por ltrado del sobrenadante en cultivo y HPLC. La concentración a 600 C se comparo con una fase
móvil de H2 SO4 5 mM.

3.2.2. Material biológico

1. P. polymixa SC2-M1

2. E. coli DH5α

3. B. subtilis 168

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4. Conclusiones
Un promotor es parte de un sistema regulador de la expresión-transcripción. Su presencia es vital
para que se creen proteínas y, por tanto, se desempeñen funciones vitales.

Los promotores contienen regiones que ayudan en la regulación con procesos especícos. Su clasi-
cación por contenido de nucleótidos es imposible (Figura 4).

Los procesos de manipulación genética, como la creación de transgénicos, dependen del uso y
modicación de promotores para su correcto funcionamiento.

Bacterias y virus pueden ser utilizados para el manejo de promotores, al igual que con genes
completos. Las precauciones propias a cada organismo deben investgarse y acatarse por separado.

Aunque todos los organismos presentan promotores, la identicación es un proceso costoso, difícil
y demandante. No todos los promotores son útiles en la industria.

Se usan varios organismos, técnicas, y teorías matemáticas durante la identicación de un promotor.

El proceso podría facilitarse si se realizan predicciones in silico

5. Recomendaciones
Los métodos bioinformáticos son opciones ”debajocosto” y alta productividad para la identicación,
por predicción, de promotores. Sin embargo, son limitados. Es mejor complemetarlos con métodos
que aplican principios de la genómica funcional.

Los organismos eucariotas son mucho más difíciles de manipular. La variabilidad genética, las
mutaciones, la presencia de exones y la homologación son procesos que aumentan aún más la
dicultad del proceso. Lo mejor es trabajar con procariotas conocidos, como E. coli y sus variantes.

La creación de fábricas manufactureras que se integren a una economía circular es posible, pero re-
quiere de mucha investigación. Esa investigacción existe hoy en día, así que este mercado productor
debería entrar en auge.

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6. Anexos
6.1. Figuras

Figura 1: Promotor mínimo y secuencias reguladoras (motifs)

Figura 2: Tipos de promotores según patrones AT-CG

Figura 3: Promotor distal y basal

6.2. Tablas

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 Figura 4: Promotores según especicidad y función en humanos.

Cuadro 1: Diferencias entre promotores de distintos dominios

Mamífero Planta Levadura Bacteria
Inducibles X X X X
Especicos a gen homólogo X X
Activación exógena o endógena X X X
Bajas frecuencias de expresión X X
Alto número de transformantes X X
Silenciamiento a largo plazo X X

Cuadro 2: Bases de datos de promotores y factores de transcripción existentes en plantas

Base Solo plantas TF's Prom Descripción
AlignACE No No Si Algoritmos para secuencias reguladoras
AGRIS Si Si Si Promotores y TF's para Arabidopsis sp.
AthaMap Si Si No Mapas genómicos de los factoers de transcripción
AtProbe Si Si Si Guarda Tf's y Secuencias génicas de Arabidopsis sp.
CpG promoter No Si No Mapea promotores a través del CpG
. Core promoter No Si No Predice TSS
DBTSS No Si Si Almacena TSS
DATf Si Si Si La base de datos de Arabidopsis thaliana sp.
First EF No Si Si Predice promotores y exones terminales 5'
JASPAR No Si Si El motor de análisis por defecto
MEME No Si Si Predicción de promotores por alineamiento
McPromoter3 No Si Si Predice TSS con métodos estadísticos
MotifExplorer No No Si Visualiza secuencias reguladoras y promotores
PLACE Si Si Si Aloja secuencias reguladoras y variaciones
PlantCARE Si Si No
PlantPAN 2.0 Si Si Si Contiene TF's y secuencias de 76 especies.
PlantProm DB Si Si Si Contiene promotores de especies domésticas
PlantPromoter DB Si Si Si Contiene promotores quiméricos
ProGA No No Si Reconocimiento de promotores eucarióticos
PromoterInspector No No Si Busca oligómeros especícos
PromoSer No No Si Servicio de extracción de promotores
TFsitescan No Si Si Análisis de la secuencia de promotores

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Referencias
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