Universidad Autónóma de Queretaró

Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto

Reporte de Practica #2:

Técnicas de siembra de microorganismos

Laboratorio de Biodiversidad de los

Microorganismos

Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo

Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz
Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
11 de septiembre del 2013
 INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son seres vivos que solo pueden visualizarse con el
microscopio; se encuentran en todos lados: en el suelo, agua, superficies corporales,
alimentos e incluso en el aire. La mayoría son unicelulares sin embargo también
existen microorganismos multicelulares como algunas algas u hongos, cabe
mencionar que también los virus forman parte de los microorganismos en el campo
de estudio de la microbiología aunque no son considerados seres vivos.

Muchos microorganismos no son perjudiciales y juegan un papel muy

importante en la biosfera, dicho papel va desde fijar el nitrógeno para poder ser
absorbido por las plantas hasta descomponer materia orgánica y transformarla para
su reabsorción en la naturaleza; algunos microorganismos son patógenos, por esta y
muchas razones más, su estudio es de gran importancia.

La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un

suministro adecuado de nutrientes y un ambiente favorable para su crecimiento. Un
medio de cultivo es una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir
el crecimiento de microorganismos, en condiciones favorables de pH y temperatura.
Existen 3 tipos de medios de cultivo según sus cualidades físicas: líquidos,
semisólidos y sólidos. Un medio liquido carece de un agente solidificante y se
denomina caldo de cultivo; si a un caldo se le adiciona un agente solidificante como
agar, se forma un medio semisólido o sólido. Para esta práctica sólo se utilizaron
medios sólidos de agar, por lo que no nos adentraremos en los medios de cultivo
líquidos o semilíquidos.

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra

(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de promover intencionalmente el
desarrollo de éste, en medios de cultivo y condiciones favorables de laboratorio
controladas.

La población de microorganismos desarrollada en un medio de cultivo se

denomina cultivo, cuando el cultivo contiene una sola especie de microorganismo se
denomina cultivo puro o axénico; cuando contiene más de una especie se denomina
cultivo mixto: en un cultivo mixto viven muchas y diferentes especies de
microorganismos en forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en
el laboratorio, y para su obtención se deben tomar precauciones especiales como
asegurarse de trabajar en un ambiente de asepsia ya sea en una campana de flujo
laminar o cerca de la flama de un mechero (los microorganismos se encuentran en
todas partes y pueden contaminar nuestra muestra si no se trabaja con precisión).

Existen varios métodos de siembra de microorganismos, para nuestra practica

utilizamos el método de siembra por estría en placa y el método de extensión en
placa. El método por estría es el más fácil y el más utilizado para obtener cultivos
axénicos, para ello con un asa se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido, conforme se
van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la
superficie del medio menos microorganismos los cuales quedan separados e
inmovilizados; después se flamea el asa, se toca en la región donde se han
realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica en la
superficie sin sembrar; repitiendo este proceso se logra aislar células individuales, a
continuación las placas se incuban permitiendo que las células aisladas
experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. A
continuación se muestra una imagen de la forma en la que hicimos nuestro estriado
para esta práctica:

En el método por extensión en placa, las células microbianas se diluyen en

forma seriada antes de su siembra, las muestras diluidas se siembran directamente
en la superficie de la placa de agar y se extienden con ayuda de un asa de Drigalsky
de cristal estéril, para esterilizarlas se sumergen en alcohol y se flamean antes de
tener contacto con la muestra diluida.

A partir de colonias separadas suficientemente, es posible obtener un cultivo

puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El éxito
del aislamiento, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra.
Cabe mencionar que una vez realizado el cultivo se puede analizar la morfología de
las colonias obtenidas:
 OBJETIVO
Identificar y aprender los métodos para cultivar microorganismos y la
importancia de éstos para su aislamiento e identificación.

Cepas activadas de E. coli,
Salmonella, S. aureus,
Pseudomonas aeruginosa
Placas de Agar soya
Tripticaseína (AST)
Placas de Agar Eosina Azul
de Metileno (EMB)
Placas de Agar Sangre (AS)
Placas de Agar Verde
Brillante (AVB)
Placas de Agar Baird Parker
(ABP)
Placas de Agar
Pseudomonas F (AP)
MATERIALES
Tubos c/diluyente de Asa calibrada
peptona (DP) c/5 mL c/u
Varillas de vidrio estériles Incubadora de 35°
Asas calibradas y rectas Alcohol 70%
Micropipeta de 1 y 0.1 mL 3 asas de Drigalsky
Hisopos estériles con 3 tubos de ensayo
aplicador de madera con tapón de rosca.
Puntas p/micropipeta de 1 1 mechero bunsen
mL y de 0.1 mL estériles
Baño maría

METODOLOGÍA
Pasos para sembrar microorganismos por el método de siembra por estría en caja de Petri.

1. Prender el mechero bunsen

2. Destapar la caja de Petri cerca del mechero Fisher
3. Flamear el asa hasta que se ponga al rojo vivo, dejar enfriar, tomar muestra
con la punta del asa
4. Ya con la muestra, estriar aproximadamente ¼ de la superficie total del agar;
las estrías deben ser varias y muy juntas.
5. Flamear el asa nuevamente
6. Jalar 2 estrías de la primera parte y proceder con el estriado a un lado esta
vez ya sin tocar las primeras estrías, las estrías deben ser menos y estar
más separadas que la primera vez.
7. Proceder con el estriado de la siguiente parte sin flamear el asa. Las estrías
deben ser menos y estar más separadas que la segunda vez.
8. Estriar la última parte del agar tener en cuenta que deben estar más
separadas y ser menos en cantidad a la tercera vez. El agar debe verse de
la siguiente manera:
 9. Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios (nombre del
microorganismo, nombre del medio, dilución de la muestra (si la hay),
nombre del grupo y fecha), voltear y proceder a incubar por 48 horas.
10. Hacer este procedimiento para el agar soya tripticasa y agar pseudomonas
con agua de tortuga, para el agar verde brillante utilizar la muestra de tierra,
y para el agar eosina azul de metileno utilizar muestra de heces fecales.

Pasos para sembrar microorganismos usando el método por extensión en caja de Petri.

1. Tomar la muestra nasal o bucofaríngea con ayuda de un hisopo estéril y

diluir en un tubo de ensayo con tapón de rosca. Agitar.
2. Prender el mechero bunsen
3. Poner las asas de Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol
4. Calibrar una micropipeta para tomar 100µL de muestra
5. Abrir la caja de puntas para micropipetas cerca del mechero, tomar una
punta y proceder a tomar 100µL de la muestra ya diluida
6. Abrir la caja de Petri cerca del mechero
7. Poner los 100 µL encima del agar y volver a tapar la caja de Petri.
8. Flamear el asa de Drigalsky
9. Abrir la caja de Petri nuevamente y extender la muestra en toda la superficie
del agar con el asa de Drigalsky hasta que seque.
10. Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios, voltear y proceder a
incubar por 48hr.
11. Hacer este procedimiento con el Agar Sangre y con el Agar Baird – Parker
utilizar la misma muestra nasal o bucofaríngea para los dos.

Cabe mencionar que existen otros métodos para la siembra por estrías, aquí hay
otro ejemplo de estrías:
 Diagrama de flujo para la siembra de microorganismos por
método de estrías y por el método por extensión en caja de Petri.

Inicio
No Método por
extensión
Tomar las muestras a sembrar en en placa
los medios de cultivo de la práctica
anterior; diluir según sea el caso
Si

Poner las asas de

Prender el mechero Drigalsky en un vaso de
bunsen precipitado con alcohol

Calibrar micropipeta
a 100µL
Método No
por
estrías
Abrir la caja de puntas para
micropipetas cerca del
Si mechero y tomar una

Destapar caja de Petri cerca

del mechero Tomar 100µL de
muestra previamente
diluida y agitada
Jalar 2 estrías de
Flamear el asa
la primera parte

Vaciar la muestra
en la caja de Petri
Tomar muestra
Estriar el resto de la
superficie teniendo en
cuenta que cada vez las
Estriar la cuarta parte estrías deben ser menos Flamear el asa de
de la superficie y más separadas Drigalsky y extender la
aproximadamente muestra en la superficie del
agar hasta que seque
Tapar la caja de Petri, escribir los datos,
Fin voltear y proceder a incubar por 48 hr.
 RESULTADOS

Referencia

MEDIO DE CEPA DE # DE
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
CULTIVO REFERENCIA COLONIAS

AST – Agar soya

Salmonella 1 Crema traslucido Regular Plana >1mm – 3mm
tripticasa
1. Rosa cremoso
VB – Agar verde traslucido 1. Regular 1. Plana 1. >1mm – 3mm
Salmonella 2
brillante 2. Amarillo cremoso 2. Irregular 2. Elevada 2. 1mm – 2mm
opaco
EMB – Agar
Morado cremoso
eosina azul de Escherichia Coli 1 Regular Plano convexa 1mm – 2mm
opaco
metileno
Staphylococcus
AS – Agar sangre 1 Blanco opaco Puntiforme Convexa >1mm – 2mm
Aureus

AP – Agar
Pseudomonas 1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 5mm
pseudomonas

ABP – Agar Baird Staphylococcus

1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm – 1mm
Parker Aureus

Muestra 1 – Rebeca

MEDIO DE ORIGEN DE LA # DE
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
CULTIVO MUESTRA COLONIAS

AST – Agar soya 1. Blanco opaco 1. Irregular 1. Plana 1. >1mm – 16mm

Agua de tortuga 2
tripticasa 2. Crema traslucido 2. Regular 2. Elevada 2. 1mm – 5mm
1. Amarillo verdoso
VB – Agar verde 1. Regular 1. Plana 1. >1mm – 2mm
Agua de tortuga 2 traslucido
brillante 2. Regular 2. Plano convexa 2. >1mm
2. rojo traslucido
EMB – Agar
Heces fecales de
eosina azul de 1 Rosa opaco Circular Convexa >1mm – 2mm
animal
metileno

AS – Agar sangre Nariz 1 Blanco opaco Circular Plana >1mm – 4mm

AP – Agar
Tierra 1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 3mm
pseudomonas

ABP – Agar Baird

Nariz 1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm
Parker
Muestra 2 – Marina

MEDIO DE ORIGEN DE LA # DE
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
CULTIVO MUESTRA COLONIAS
1. Plana
1. Crema opaca 1. Irregular 2. Plano convexa 1. 5mm
AST – Agar soya 2. Crema opaca 2. Irregular 3. Convexa 2. 7mm
Agua de tortuga 4
tripticasa 3. Crema opaca 3. Regular 4. Convexa, 3. 4mm
4. Crema traslucida 4. Regular rugosa en el 4. 1mm
centro
1. Amarillo opaco
2. Naranja 1. Regular 1. Convexa 1. 2mm
VB – Agar verde
Agua de tortuga 3 traslucido 2. Regular 2. Plana 2. 1mm
brillante
3. Amarillo 3. Regular 3. Plana 3. 1.5mm
traslucido
EMB – Agar
Heces fecales de
eosina azul de 1 Rosa opaco Regular Convexa >1mm
animal
metileno
1. Cremosa
1. Irregular 1. Convexa 1. >1mm
AS – Agar sangre Garganta 2 traslucida
2. Regular 2. Convexa 2. 1mm
2. Crema opaca
1. Opaca verdosa 1. Regular 1. Convexa 1. 3mm
AP – Agar
Tierra 3 2. Crema traslucida 2. Irregular 2. Plana 2. 3mm
pseudomonas
3. Verde opaca 3. Regular 3. Convexa 3. 4mm
ABP – Agar Baird
Garganta 1 Gris oscuro Regular Convexa >1mm
Parker

Muestra 3 – Juana

MEDIO DE ORIGEN DE LA # DE
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
CULTIVO MUESTRA COLONIAS

AST – Agar soya 1. Crema 1. Circular 1. Plana 1. 9mm

Agua de tortuga 2
tripticasa 2. Amarillo opaco 2. Circular 2. Plana 2. 4mm
1. Amarillo 1. Regular 1. Plana
VB – Agar verde
Agua de tortuga 3 2. Rojo 2. Regular 2. Plana 1mm
brillante
3. Anaranjado 3. Circular 3. Plana
EMB – Agar
Heces fecales de
eosina azul de 1 Negro Circular Plana 2mm
animal
metileno

AS – Agar sangre Garganta 1 Amarillo cremoso Circular Plana 1mm

AP – Agar
Tierra 1 Crema Circular Plana > 1mm
pseudomonas

ABP – Agar Baird 1. Negro 1. Circular 1. Plano convexa

Garganta 2 1mm
Parker 2. Gris 2. Fusiforme 2. Plano convexa
1. Separar los medios de 2. Con un hisopo estéril tomar 3. Agitar el tubo de ensayo
cultivo a utilizar una muestra nasal y para desprender los
sumergir en un tubo de microorganismos del hisopo
ensayo con disolución

4. Poner las asas de 5. Calibrar la micropipeta a 6. Tomar 100µL de la muestra

Drigalsky en un vaso de 100µL; abrir la caja de diluida
precipitado con alcohol puntas para micropipeta
cerca del mechero y tomar
una
7. Vaciar la muestra a la caja 8. Flamear el asa de Drigalsky 9. Extender la muestra en la
de Petri caja Petri con ayuda del asa
de Drigalsky hasta que
seque. Tapar y voltear

10. Flamear el asa calibrada 11. Tomar muestra 12. Abrir caja de Petri y estriar
para siembra en estrías de la forma como fue
explicado
13. Tapar, voltear e incubar por 14. Observar la morfología de 15. Describir las morfologías
48 hr. las colonias obtenidas diferentes y reportar
resultados

DISCUSION DE RESULTADOS
La siembra en cajas Petri nos permite cultivar microorganismos gracias a que contiene los
nutrientes necesarios para su desarrollo. El crecimiento de los microorganismos se manifiesta de
formas diferentes dependiendo de la técnica utilizada para su siembra y del tipo de medio en el que
se realizó dicha siembra, de esta forma es posible obtener características morfológicas distintas
cuando se realizan siembras de una misma muestra en diferentes medios de cultivo o viceversa,
esto queda mejor explicado en los resultados que obtuvimos en la morfología colonial de nuestro
agar verde brillante en el cual se observó que algunas colonias tenían un color amarillo verdoso y
otras eran rojas, esto se debe a que dicho agar tiene colorantes que nos permiten diferenciar las
bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de lactosa; las formas observadas
fueron variadas (regular, puntiforme, circular e irregular) y en cuanto a elevaciones tuvimos planas,
elevadas, planoconvexas y convexas.
 CONCLUSIÓN
El desarrollo de colonias formadas a partir de los métodos realizados por estrías y por
extensión en placa difieren en forma, borde, elevación, superficie y estructura interna, lo cual es
notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio en el cual dichas
colonias se desarrollaron así como por el mismo medio de cultivo, por eso inclusive en nuestras
cepas de referencia la salmonella se visualizó con algunas diferencias morfológicas cuando se
cultivó en agar soya tripticasa y en agar verde brillante. En general aprendimos a sembrar
microorganismos por dos métodos diferentes obteniendo resultados satisfactorios.

También aprendimos a describir la morfología de las colonias que obtuvimos así como
compararlas con las cepas de referencia que se nos proporcionó; tuvimos un poco de dificultad para
la siembra por estrías en el agar eosina azul de metileno debido a que el agar estaba muy suave sin
embargo aun así pudimos realizar 2 de 3 siembras satisfactoriamente.

BIBLIOGRAFÍA
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial
Pearson
Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana