SECRETARIA DE EDUCACIÓN PÚBLICA

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA

TECNICAS DE FERMENTACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE

AZUCARES TOTALES, CONCENTRACIÓN DE ETANOL Y
CONCENTRACIÓN CELULAR.
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA – BIOQUÍMICA

CARRERA:
INGENIERÍA QUÍMICA

MATERÍA:
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

PRESENTADO POR:
PACHECO FERRAEZ PAMELA GUADALUPE E14081521
PERERA PUIGCERVER MARÍA JOSE E14081650
SALAS ROBLES DIANA LAURA E14081774

FACILITADOR:
DRA.SARA LUZ NAHUAT DZIB

MÉRIDA, YUCATÁN, MÉXICO

18 de agosto de 2019
INTRODUCCIÓN

La fermentación es un proceso de tipo catabólico, es decir, de transformación de moléculas

complejas, en moléculas simples, dentro del metabolismo. Así la fermentación es un proceso
catabólico de oxidación que tiene lugar de forma incompleta, siendo además un proceso
totalmente anaeróbico (sin presencia de oxígeno), dando como producto final un compuesto
de tipo orgánico, el cual caracteriza por lo general, a los distintos tipos de fermentaciones
existentes, pudiendo así realizar una clasificación y una diferenciación.

Las fuentes con alto contenido de azúcares son materias primas que poseen un alto contenido
de azúcares simples y fermentables, como la glucasa, la fructosa, la galactosa y la sacarosa.
Las mas importantes incluyen caña de azucar, frutas, melazas, tuberculos y azucar de
remolacha. La ventaja de utilizar este tipo de fuentes consiste en que no es necesario realizar
tratamientos previos para obtener los azucares fermentables, ya que estos se encuentran
presentes.

Actualmente la fuente con alto contenido de azúcares más empleada son las melazas, jarabes
oscuros y de una alta viscosidad, las cuales son un subproducto resultante del proceso de
refinación del azúcar. Inicialmente, el termino melaza se refería especificamente al efluente
final obtenido luego del procesamiento de los jugos de la caña de azucar o de la remolacha
para obtener sacarosa (azúcar común), a partir de evaporación, cristalización y centrifugación
sucesivas; ahora, se reconoce como melaza a cualquier producto liquido que contenga más
de 43% de azucares.

En este reporte se trabajo con melaza para la aplicación de distitntas tecnicas de fermentación
para determinar los azúcares totales, concentración de etanol y la concentración celular, en
un lapso de 6 días se realizaron tomas de muestras en distintos tiempos de 2 horas y 8 horas
a continuación se presentan los metodos aplicados y los resultados correspondientes.
OBJETIVOS:

 Conocer las diferentes tecnicas para la fermentación de alcohol.

 Determinar los azucares totales
 Determinar concentración de etanol obtenida
 Determinar la concentración celular de la fermentación.
DETERMINACIÓN DE ETANOL

La determinación de etanol se realizo mediante una modificación del metodo de shefttel &
koselka -hine (gradwoh 1943; lovine & selva, 1979).

Para destilar las muestras se empleo un equipo de destilación simple.

La tecnica de analisis se dividio en dos etapas:

1ª Etapa: tratamiento de la muestra.

Se mezclaron 10 ml de muestra(mosto fermentado) con 10 ml de agua destilada (en el matraz

de destilación, se calento ligeramente a ebullicion y destilado se recolecto hasta un volumen
de 10 ml. Los primeros 5 ml de destilado se colectaron en una probeta y los siguientes 5 ml
en otra. Esto con el propocito de obtener la mayor concentracion de etanol en los primeros 5
ml y un residuo minimo en los ultimos 5 ml del destilado. Si las muestras tienen un intervalo
de concentración y el resultado obtenido debe estar dentro del mismo, si la concentración del
etanol es alta se diluye la muestra hasta lograr que la lectura este dentro de la curva patrón,
debiendo considerar el efecto de la dilución de la muestra para el calculo de la concentración
de etanol.

Cada una de las muestras se analizó para cuantificar el etanol total.

2ª Etapa: Cuantificación del ETANOL.

Se tomaron 5 ml de las muestras preparadas y se les adicionaron 2 ml de reactivo (4.262%

w/v de dicromato de potasio en ácido sulfurico al 5% v/v); se agitaron, se dejaron reposar 10
minutos y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 580 nm.

Para calcular la concentración de etanol en la muestra, se construyo una curva patrón,

obteniendo la ecuación por ajuste de los datos experimentales, utilizando el método de los
minimos cuadrados.
Figura 3. Diagrama de flujo para la determinación de etanol

Para la curva patón de etanol.

Para el cálculo de la concentración de alcohol (Etanol) se sigue el siguiente procedimiento:

X= concentración de alcohol (Etanol ml/l)

Y= Absorbancia de la muestra

A= Factor de corrección de ml/ml a (ml/l)

B= Factor de corrección por dilución de la muestra

X=((A)(B)(Y+0.0161852882))/4.583409 (ml/l)
RESULTADOS

3 L – 800 g de Melaza

NH4SO4 5g/L – 15 g/ 3L

Inoculo seco

20𝑔
12 g de levadura en 600 𝑚𝑙 (Se esteriliza con calor húmedo) bajar T hasta 45°C y agregar la

levadura

40 ml y agregar a sol y mantener en agitación por 15 min, posterior tomar

1ra muestra y después cada 2 horas

Muestra Hora Absorbancia

[X]

1 5:40 am

2 7:40 am Pasó tiempo y formó CO2

3 9:55 am (40 min) 20 min (Burbujas
CO2)
4 11:40 am

5 1:40 pm

6 3:40 pm

7 5:40 pm

8 7:40 pm

9 9:40 pm

10 11:40 pm

40 ml en suspensión levadura

Esterilizar Calor humdo a 2 atm y 121°C por 15 min

 35 𝑔 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑧𝑎
+ 2𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑛𝑖𝑜 (𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒)
400 𝑚𝑙

Medir la absorbancia de las tres primeras muestras

Para el blanco

Diluir 30 ml 3.5 g y en 10 ml diluir 0.2 g de Sulfatos y poner 3.5 ml del volumen de operación

𝐶𝑒𝑙
1.
𝐿

1. Y= 0.268X + .1479 celulas

Sutituir

(𝑎𝑏𝑠) − .1479
[𝑥] =
0.0208
𝑔
1. 𝐿

2. Y= 0.8579X + .1479 celulas

(𝑎𝑏𝑠) − .1479
[𝑥] =
0.8579

(Esta ultima es la que se usará)

Curva de crecimiento (Tanto para Cel/L como para g/L

[X]

T M1, 0 x

T M2, 2 x

Dividir las muestras 1000 veces 10 μl/ 1ml

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

Figura 5. Graduación de la cámara de neubaer

La cámara de neubaer se encuentra dividida como lo muestra la figura 5. Existen 2 métodos

el primero consiste en cuantificar el numero de células totales presentes en cada uno de los
25 cuadros (a). cada conteo se realiza por duplicado. El segundo método es el conteo rápido,
que consiste en la cuantificación de las células presentes en los cuadros que se encuentran
sombreados en (a).Teniendo el resultado del conteo, cualquiera que haya sido se procede a
sacar la media.

Para la determinación de la concentración de las muestras es necesario multiplicarse el

resultado del conteo por dos factores, el primero, el número de veces que se encuentra diluida
la muestra, y ese resultado a su vez se multiplica por el factor de la cámara dándonos la
concentración en células/mililitro. El factor de la cámara se determina como se indica en las
figuras, que depende de su área y altura especificadas, en este caso es F=10,000.
 RESULTADOS

Curva estándar de [x]

1g de llevadura

100 ml de H20 Sol. Salina 0.85% de NaCl

Tween neutraliza la sal (separa la reacción) 80

P.O.

[X] 10g/L

Longitud de onda: 600 nm

Soluciones Isotonicas (salinas) evita que las células exploten C. de solidos en la solución

Con la cámara de Neubauer se contará el número de células

0.1 mm3

1 cel x factor de dilusion x 100 x10000 cm3 (cámara)

Lonngitud de onda: 600 nm abs 0.98 sol.

0.98

20% 40% 60% 80% [X]

#Cel= conteox5x10000 x dilusipon

#Cel= conteo x 104 x dilusión

Soln (4ml)+1ml sol salina = 5ml

80% 4 ml + 1ml

60% 3 ml + 2ml
Duplicado
40% 2ml + 3 ml

20% 1 ml + 4 ml

Regresión Y= mx+b

3.195 x 1010 # cel -> Alfredo

[x] Concentración celular
12𝑔 0.040𝐿 5𝑔
= →
0.600𝐿 0.400𝐿 3𝐿

20𝑔 2𝑔 3.66𝑔 5.66𝑔

= + =
𝐿 𝐿 𝐿 𝐿

1𝑚𝑙
→ 𝐷. 𝑂 = 𝑂. 4
10𝑚𝑙
DETERMINACIÓN DE AZUCARES TOTALES.

Cuantificación de los azúcares totales en la melaza.

Se determinan por método de fenol-acido sulfúrico recomendado por dubois y col. (1956).

Procedimiento:

Se tomaron alícuotas de la muestra de 1.0 ml. Y se llevaron a tubos de ensaye de 20 x 150

mm se les adiciono 1.0 ml de fenol al w/v 5%, se homogeneizaron, se les añadió 5.0 ml de
acido sulfúrico (H2SO4) concentrado y se dejaron reposar durante 10 minutos. Después de
este tiempo, se homogeneizo el contenido de cada tubo y se mantuvieron en un baño de agua
helada por 15 minutos. Junto con las muestras, se preparo un blanco usando agua destilada.
Se leyeron las absorbancias de las muestras a una longitud de onda de 490 nm en un
espectrofotómetro. Los resultados se interpolaron en una curva patrón de glucosa.

Preparación de la curva patrón.

Se preparo una solución de glucosa con una concentración de 100 g/ml de esta solución se
tomaron por duplicado alícuotas de 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 y 1.0 ml. Se vertieron
en tubos de ensaye de 20 x 150 mm, se les adiciono agua destilada hasta alcanzar un volumen
de 1ml; a cada tubo en estas concentraciones obtenidas se le añadió 1 ml de fenol al 5% y 5
ml de H2SO4 procediendo como se indica la técnica para cada muestra. De esta manera se
obtuvo la grafica, poniendo en el eje de las abscisas las concentraciones, y en el eje de las
ordenadas el valor promedio de las absorbencias leídas para la concentración.

Curva patrón de azucares totales

Para el calculo de la concentración de los azucares totales se procede como sigue:

X= concentración de azucares totales (g/l)

Y= Absorbancia de la muestra

A=Factor de corrección de g/ml a (g/l)

B= Factor de corrección por dilución de la muestra.

X=((A)(B)(Y+0.24))/0.010786844 (g/l)
RESULTADOS

Concentración de
Glucosa 100 mg/ml H2O D.O
glucosa

0.1 .4 20 .18 .05

0.2 .3 40 + 2.5 ml .27 .31

H2SO4
0.3 .2 60 .51 .48
+0.5 Fenol
0.4 .1 80 .71 .61

0.5 0 100 .83 .84

Blanco .18 0

ZNR= Zona no recomendada

Y= 0.0091 x -0.0645

R2= 0.9769

Dilusión

1. 6ml en 100 ml
2. 5ml en 50 ml
3. 3 ml en 100 ml
 MELAZA
D.O.1 D.O.2

0.26 0.29 Prom 0.275

𝑚𝑔
𝑥 = 37.25 𝑚𝑙 usando la ecuación de azucares

100
(100)(10) (
(37.25) ( 3 )) = 5.870 𝑚𝑔
2.115 𝑚𝑙

5870 mg/ 100 ml =58.7° Brix

Calcularemos a 60° Brix

Melaza

70% Azucares

6% residuos aprox

Activación 2° Brix

Propagación 5° Brix

Fermentación 16° Brix

Inocular 400 ml

Tomar 5 ml de muestra

40 ml -> 600 ml

12𝑔 𝐴2
= 20𝑔 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑧𝑎𝑒𝑛 600 𝑚𝑙
0.6

*Por equipo
20𝑔
= 35𝑔 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑧𝑎 𝑒𝑛 400 𝑚𝑙
0.6

Esto se va a usar

35.1 g de Melaza

400 ml Agua

Sulfato

1000 ml – 5g

400 ml – 2g

Para mayor distribución 1 L

 Azucares totales en la muestra
a 490 nm

50 μl en 10 ml

Fenol 0.5 ml esperar 10 min

 H2SO4 2.5 ml esperar 15 min

Para células tomar 2.5 ml de muestra a forar a 10 ml y tomar la celda y dar lectura a 600 nm

Blanco = agua

Miércoles 10 de octubre

12 𝑔 40 𝑚𝑙
-> 400 𝑚𝑙
600 𝑚𝑙

20 g/L 2g/L

2.5 ml demuestra + 7.5 ml H2O -> 10 ml 5g/L

2g – L

0.4 g – 0.25 L – 0.2 L

250 ml – 0.5 g

2.5 ml – 7.5 ml

2 ml – 6 ml

200

2 ml - 8ml -> .4 g/L

 Muestra Absorbancia

M6 0.55 0.50 0.48 0.53

M7 0.58 0.65 0.62 0.72

M8 0.33 0.34

M9 0.39 0.38

M10 0.52 9.40

M11

M12

M1

M2

M3

M4

M5

10.5 g – 1L

0.5 – 0.04 L

9.60 ml + 0.4 ml

9.60 ml + 0.04 ml ->

9.6 ml + 0.4 muestra ml

 (𝑡1 (22ℎ𝑟𝑠)) µ𝑔
= 50𝑥106 ( 3 )
(𝑡0 50 𝑔/𝐿) 10 𝑚𝑙

Tomar 1 ml muestra / 10 ml H2O -> 0.5 ml / 50 ml (en matraz aforado)

[X0] 2g/L 2.5 ml -> 10 ml

Y x/s  0.5 g cel/g azuc 25 g  12 g/L

M12

1ml muestra + 10 ml H2O (afora)

Se toma 1 ml y se afora a 50 ml (Si reaccionó)

Se toma 1 ml y se afora a 100 ml (Suponiendo que no reaccionó)

0.5 muestra (100 ml o 50 ml) + 0.5 Fenol + 2.5 ml (Acido)

Blanco: 0.5 H2O + 0.5 Fenol + 2.5 Acido

Azucares Totales

M12 error 0.40 – 0.18 (Abs 50 ml) 0.36 – 0.43 (Abs 100 ml)

10 de octubre de 2018

T0: Tomado a las 6:40 am

800g melaza

15g sulfato de amonio

Aforó a 3L con agua = Llevar a 3L con H2O

300 ml inoculo

Agitar

Esperar 10 min

Agitar

Esperar 10 min

Agitaar

Esperar 10 min y tomar 10 ml muestra

 800 g 15 g 3000ml

8g 0.15 g 30 ml

4g 0.075 g 15 min

12 𝑔 40 𝑚𝑙
-> 400 𝑚𝑙
600 𝑚𝑙

Sig medición 12:40 pm

M12

1.

1 ml + 1 ml agua

Se toma 1 ml y se afora a 50 ml (Si reaccionó)

Se toma 1 ml y se afora a 100 ml (Suponiendo que no reaccionó)

2.

0.5 muestra + 0.5 fenol + 2.5 acido

Agita 10 min (homogeniza)

Baño 10 min
Y=0.0091x – 0.064

0.18 + 0.064
= 𝑥
0.0091

X=26.8131 ml - 50 ml

X= 46.5934 mg/ml – 100 ml

13406.55 µg/ml

46593.4 µg/ml

50 ml (Si consumió)

100 ml (Si no se consumió)

 800𝑔 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎
=
3000𝑔 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜

21.5° Brix t0

Comprobando azúcar y agua 5gr + 20 ml de agua

5 𝑚𝑙
= 25% R 22.5°Brix
25𝑚𝑙

Se agrega 10 ml de agua esperando que de 10 – 12 ° Brix

R= 12°Brix

Significa que esta bien el

Se agrego 20 ml de agua esperando que de 6 – 8 °Brix

R= 11.6°Brix

160
= 0.16
1000
Mosto 16 °Brix

160𝑔 160𝑔 0.16𝑔

= =
𝑙 1000𝑚𝑙 𝑚𝑙

1g = 1x106 µg

Es decir 0.16 x106 µg/ml

160,000 µg/ml -> 3 ml /100 ml

48 x104 µg/ml

Lo aforaremos a 100

Teniendo un volumen final de 4800 µg/ml

Se tomara 1 ml y se afora a 100 ml obteniendo 48 µg/ml

Para ahorrar agua agarraremos la mitad

1) 3ml/100 ml será 1.5 ml en 50 ml

2) 1ml/100 ml será 0.5 ml en 50 ml

Mediremos t0 y t3 para notar el cambio

Como la concentración de aucar no disminuyó se le agregan 5g de levadura al reactor. Matraz

25 ml -> .75 ml Muestra 75 µl aforado a 25 min, se toma 1 ml

Blanco: Agua, Acido, sulfato de amonio

2.5 ml de acido sulfúrico -> Baño maria -> agitar (Leer por duplicado)

(Leer con esa concentración)

.5ml + .5 sulfato -> agitar ->10 min reposar

Muestra 7 1:05 am

Rendimiento

𝑝 𝑔[𝑝]
𝑌= = 0.51
𝑠 𝑔[𝑠]

C6H12O6 -> 2 2C2H6O

92
180 = 180 = 0.51

La lavadura debe tener entre 5 – 7 %

150𝑚𝑙 300𝑔
→ 𝑆𝑒 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑟 [𝑆 ]
0.51 400𝑔 0

180𝑔 600𝑔
≈
3𝐿 𝐿
 60𝑔 60𝑥106 µ𝑔 1𝑚𝑙 600µ𝑔 1𝑚𝑙 60µ𝑔
= → = = =
𝐿 103 𝑚𝑙 102 𝑚𝑙 𝑚𝑙 10𝑚𝑙 100

T4,t5,t6,t7

Ec. [5]
𝑎𝑏𝑠 + 0.064
𝐹
0.0091

50 50
𝐹=( )( )
1.5 0.5

Se harán diluciones T4,t5,t6

50 50
𝐹=( )( )
1.5 0.5

Tomar 1.5 ml y aforar a 50, después tomar 0.5 y aforar a 50 ml

Y para t7 la disolución será F=1000

60𝑔 60𝑥106 µ𝑔
=
𝐿 103 𝑚𝑙
Por tener un matraz volumerico

En t4,t5,t6 se toman 0.75 y diluye en 25 ml, de ahí se toma 0.25 y diluye en 25ml

25 25
𝐹=( )( )
0.75 0.25

En la dilusión t7 tomar 750 µl aforar a 25 ml y tomar 0.25 ml y aforar a 25 ml F(1000)

Absobancias

Muestra 1 2

M4

M5

M6

M7
Se modífio a 5.6 g/l por que se agrego 5 g de lavadura mas por lo tanto se diluyó mas
(352µl/10ml) ->dato

Celulas 600 nm

Muestra 1 2

M4

M5

M6

M7

0.75𝑚𝑙 0.25𝑚𝑙
( )( )
25𝑚𝑙 25𝑚𝑙

Para el de células se tomó un 1ml y se aforó a 100 ml y después se tomé un 1 ml y aforar a

10 ml (F100)

Sam Gerson Sam Gerson

T0(1) 0.74 0.35 0.11 0.25
T0(2) 0.67 0.42 0.08 0.21
T1(1) 0.78 0.19 0.07 0.11
T1(2) 0.79 0.14 0.06 0.16
T2(1) 0.32 0.11 0.04 0.14
T2(2) 0.35 0.1 0.02 0.14
T3(1) 0.68 0.23 0.05 0.07
T3(2) 0.68 0.29 0.03 0.1

21.42% Eficiencia de destilado

Y=0.0091x—0.064

0.71 + 0.064
𝑋
0.0091

X4=85.05 (1000/3) = 283500 µg/ml

X5=92.74 (1000/3) = 309133.33 µg/ml

X4=42.19 (1000/3) = 140,633 µg/ml

X4=81.75 (1000/3) = 27752 µg/ml

0.75𝑚𝑙 1 1 10000
( )( )( ) = 𝐹 =
25𝑚𝑙 10 10 3

Inoculo

17g 20g/600 ml

17𝑔 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎
( )
20𝑔 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑧𝑎

0.75𝑚𝑙 . 25 3 3(100)
( )( ) = ( )=𝐹=
25𝑚𝑙 2.5 1000 16

0.75𝑚𝑙 . 25 3
( )( ) = ( )
25𝑚𝑙 2.5 1000

A= 9.0957

B=

5𝑔+5𝑔
2g/L inoculo+( ) 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 3.33
3

X4=3.80 = 71.25 g/L

X5=0.4514=8.4637g/L

X4=0.2947=5.5256 g/L

X4=1.7873=33.511g/L
CONCLUSIONES

-En la obtención de azucares se pudo obtener una eficiencia de 21.42% en el destilado

- Se identificó la importancia de emplear levaduras especializadas en la fermentación

alcoholica, que no solo generan mejores rendimientos sino que permiten un mejor control de
las condiciones del proceso y las caracteristicas finales del producto.

- se identifico la importancia de incluir en el proceso fermentativo una activación de levadura,

previa a la inoculación. Dado que fue posible optimizar los tiempos de proceso, junto con el
rendimiento y la productividad del mismo.

- se mostro que con la activación previa se logro controlar el desarrollo de las células frente
a la generación de subproductos y la respuesta general de los parametros evaluados.
BIBLIOGRAFÍA

(http://aunartech.aunar.edu.co/images/revista/pdf/junio-2013/008.produccion-de-etanol.pdf,
2013)