Universidad de Colima

Facultad de Ciencias Químicas

Químico Farmacéutico Biólogo

Análisis del artículo.: Diosmetin inhibits tumor
development and block tumor angiogenesis in skin
cáncer
Autores.: Jawun Choi Dae-Hyo Lee, Sang-Youel Park,
Jae-Won Seol

Dr. Sanchez Pastor Enrique Alejandro

Por.: Gonzalez Gonzalez Joel
Grado y grupo: 2º B

26 de Junio del 2019, Coquimatlán, Colima.

Diosmetin inhibits tumor development and block tumor
angiogenesis in skin cáncer
Jawun Choi Dae-Hyo Lee, Sang-Youel Park, Jae-Won Seol

Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Chonbuk, Iksan, Jeollabuk-do 54596, República de Corea

Diosmetina es un flavonoide natural que se obtiene de las frutas cítricas y algunas

hierbas medicinales. Estudios previos han informado de la actividad anticancerígena de
diosmetina en algunos tipos de tumores. Sin embargo, todavía no está claro si
diosmetina ejerce efectos anti-cáncer, particularmente los efectos anti-angiogénicos, en
el cáncer de piel.

En este estudio, hemos utilizado células de melanoma B16F10 (cutánea de ratón) y

células endoteliales de la vena umbilical humana para investigar el efecto inhibidor de
diosmetina sobre la proliferación celular, la migración y la formación de tubos in vitro.
Se realizaron ensayos de anillos de aorta de rata para determinar el efecto de
diosmetina en angiogenesis e vivo. Además, se utilizó un modelo de melanoma de
ratón B16F10 para observar el efecto de diosmetina sobre el crecimiento tumoral, la
angiogénesis y la metástasis en vivo. Nuestros resultados mostraron que diosmetina
no sólo suprime la proliferación de células tumorales y la migración, también apoptosis
celular también inducida por vía de la caspasa en células B16F10.

Ensayos de anillos de aorta de rata mostraron que diosmetina atenuó la angiogeniesis.

Además, el modelo de melanoma de ratón mostró que diosmetina retrasó
significativamente el crecimiento del tumor mediante la inhibición de los vasos del tumor
que brotan y expansión durante la progresión tumoral. Notablemente, diosmetina indujo
la normalización de la vasculatura del tumor a través de la regulación Down- de
angiopoyetina-2 y la mejora de la cobertura de pericitos, que conduce a la supresión de
la formación de metástasis en los pulmones y ganglios linfáticos. En conclusión,
nuestros resultados demuestran que diosmetina suprime la progresión tumoral y la
metástasis mediante la inducción de la muerte de las células tumorales y la inhibición
de la angiogénesis tumoral, así como normalización de la vasculatura del tumor
defectuoso.
El melanoma maligno es la forma más letal de cáncer de piel, AC- contando
aproximadamente el 90% de las muertes causadas por esta enfermedad En las últimas
décadas, la incidencia del melanoma ha aumentado de manera constante. En todo el
mundo, había alrededor de 55.000 muertes en 2012 Y de acuerdo con la Agencia
Internacional para la Investigación del Cáncer, en 2030, una estimación acoplado se
espera que 351,396 nuevos casos y 87,725 muertes que se produzca.

La agresividad de melanoma se asocia con su alto potencial metastásico. Si es

reconocido durante las primeras etapas, el melanoma puede ser eliminado mediante la
extirpación quirúrgica. Sin embargo, una vez que se hace metástasis, es mayor la
dificultad para tratar y tiene mal pronóstico.

La quimioterapia es la opción de tratamiento más comúnmente elegido para la gestión

de melanoma que se ha diseminado. En general, sin embargo, las quimioterapias
actuales para tratar el melanoma tienen una baja eficacia y causan efectos adversos
graves. Por lo tanto, se requiere urgentemente el desarrollo de fármacos anti-cáncer
que son a la vez eficaz y seguro.

Diosmetina, la parte aglicona de la diosmina glucósidos flavonoides, es abundante en

los cítricos, el orégano y también se obtiene de algunos

hierbas medicinales, tales como Rosa agrestis Savi (Rosaceae) y hierochuntica

anastatica L. Varias actividades terapéuticas de diosmetina, tales como antibacteriano,
anti-inflamatorio, y propiedades antioxidantes, se han comunicado.

También se ha demostrado que diosmetina tiene un efecto anti-proliferativo potente en

algunas células tumorales, incluyendo células de cáncer de mama, las células cinoma
car- cuello uterino inyectados en ratones.

La angiogénesis, la formación de nueva vasculatura a través de la brotación y la

extensión de los vasos pre-existentes, ocurre en varias condiciones patológicas,
incluyendo varios tumores sólidos malignos. En la progresión tumoral, la angiogénesis
inducida por tumor suministra nutrientes y oxígeno y elimina metabolitos, resultando en
el crecimiento del tumor más. Por otra parte, la vasculatura del tumor es una de las
rutas a la propagación de las células tumorales a los órganos distantes. Por lo tanto,
las inhibiciones de la angiogénesis inducida por el tumor se ha convertido en una
estrategia prometedora para la terapia del cáncer.

Materiales y métodos

2.1. Ratones

Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación (CBNU

2018024) del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de
Chonbuk. 6 ratones libres de patógenos específicos C57BL / fueron adquiridos de
Samtako Bio Korea Co., Ltd. (Osan, Corea). Todos los ratones fueron alimentados
con el acceso a una dieta estándar (dieta PMI de Laboratorio, Richmond, IN,
EE.UU.) y agua.

Modelo de tumor y diosmetina tratos

Células de melanoma B16F10 se obtuvieron de la línea celular de Corea Bank (Seúl,

Corea). Para generar la implantación modelo de melanoma, suspensiones de células
B16F10 (1 × 10 6 células en 100 l) se inyectaron subcutáneamente en el flanco dorsal
de ratones de siete semanas y los ratones se dividieron en dos grupos: sin
tratamiento (n = 16) y diosmetina tratados (n = 16). El volumen del tumor y la tasa de
crecimiento del tumor se midieron utilizando métodos previamente reportados. Días
indicados después, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los
tejidos se recogieron para nuevos análisis. Diosmetina (1,0 mg / kg dos veces al día,
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se inyectó por vía intraperitoneal durante dos
semanas a partir de siete días después de la implantación del tumor. Como control,
se inyectaron cantidades iguales de PBS de la misma manera.

Cultivo de células y reactivos

HUVECs y su medio de crecimiento (EGM-2 MV BulletKit ™) fueron adquiridos de

Lonza Group Ltd. (Basilea, Suiza). Las células se utilizaron en el paso 4-5 en todos
los experimentos. B16F10 células se cultivaron en medio de Eagle suplementado
con 10% de suero bovino fetal (Atlas Biológicos, Para Collins, CO, EE.UU.), 100 U /
ml de penicilina y 100 mg de estreptomicina (Sigma Aldrich). Todas las células se
incubaron a 37 ° C con 5% de CO2.

Diosmetina se disolvió en sulfóxido de dimetilo para obtener una 10 mg / ml (para in

vitro uso) o 1 mg / ml (para en vivo uso) solución madre, que después se diluyó con
autoclave PBS antes de su uso.

2.6. Ensayos de proliferación celular

La proliferación celular se determinó mediante un (4,5-dimetiltiazol-2-il) 3- bromuro

de 2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo. B16F10 células se sembraron en placas de 24
pocillos (1 x 10 5 células / pocillo) durante la noche y se trataron con o sin diosmetina.
Después de 24 h, el medio se eliminó cuidadosamente y se añadieron 300 microlitros
de solución de MTT (0,5 mg MTT / ml de medio) a cada pocillo, y las placas se
incubaron durante 2 h a 37 ° C. A continuación, el medio se reemplazó con 500
microlitros de sulfóxido de dimetilo, y las placas se agitaron durante 10 min.
Entonces, 200 microlitros de la muestra se transfirieron a una microplaca de 96
pocillos. Los resultados se cuantificaron midiendo la absorbancia a 570 nm con un
lector de microplacas.

2.7. Lactato deshidrogenasa (LDH) ensayos de liberación

Los niveles de LDH liberada de las células dañadas en el medio de cultivo se

midieron utilizando un kit de detección de citotoxicidad de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Brevemente, las células B16F10 se sembraron en
placas de 24 pocillos (1 x 10 5 células / pocillo) noche a la mañana y se trataron con
o sin diosmetina durante 24 h. Después del tratamiento, se recogió medio de cultivo
y se centrifugó a 250 x sol durante 10 minutos para eliminar los restos. El
sobrenadante se recogió y se incubó con la mezcla de reacción LDH a TA durante
30 minutos en condiciones de oscuridad. nivel de LDH liberado se determinó a 490
nm en lector de microplacas.
En los ensayos de migración vitro

Células B16F10 y HUVECs se cultivaron en placas de 6 pocillos. monocapa de

células confluentes se rascaban manualmente usando una punta de pipeta de 1000
microlitros estéril y se lavaron suavemente con PBS. Se añadió medio fresco que
contenía suero bovino fetal al 2% a los pocillos con diferentes concentraciones de
diosmetina. A la hora indicada después del tratamiento, las imágenes fueron foto-
grafican utilizando un microscopio.

2.10. En los ensayos de formación de tubos in vitro

Para el ensayo de formación de tubos ECs, factor de crecimiento reducido Matrigel

™. Se descongeló durante la noche a 4 ° C. El Matrigel se deja solidificar en una
placa de cultivo de 24 pocillos a 37 ° C durante 30 min. HUVECs fueron
cosechadas y se sembró a una densidad de 1 × 10 5 células / pocillo en medios
de crecimiento con o sin diosmetina. Las células se incubaron a continuación a 37
° C durante otras 18 h. la formación del tubo fue observado por la toma de
fotografías con el microscopio. Los ensayos de formación de tubo se cuantificaron
mediante el recuento del número de túbulos a partir de tres campos diferentes para
cada condición.

2.11. Ensayos de anillos de aorta de rata

Por ex-vivo estudio de la angiogénesis, se utilizó el ensayo de anillo brevemente,

la aorta torácica de una rata recién sacrificada. Se eliminó de una manera estéril
y se enjuagó en PBS enfriado en hielo. A continuación, se corta en trozos de 1 mm
de largo utilizando cuchilla

Western Blot

A la hora indicada, B16F10 células se homogeneizaron en tampón de lisis enfriado en

hielo que contenía un cóctel inhibidor de proteasa. Cada proteína se separó con SDS-
PAGE y se transfirió a membranas de trocellulose ni-. Después del bloqueo con leche
desnatada al 5%, las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios
en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C: anti-caspasa-3 (conejo), anti-poli (ADP-
ribosa) polimerasa (PARP) (conejo; ambos de Cell Signaling Technology, Inc., Beverly,
MA, EE.UU.), y anti-β-actina (ratón mono- clonal; Sigma-Aldrich). Las membranas se
incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h a TA.

Resultados
3.1. Diosmetina retrasa el crecimiento del tumor mediante la inhibición de la
angiogénesis inducida por tumor

Para investigar el efecto de diosmetina sobre el crecimiento tumoral, que genera un

modelo de melanoma de ratón mediante inyección subcutánea de células B16F10 en
ratones C57BL / 6. Una semana después de la implantación, los ratones se dividieron
al azar en dos grupos: un grupo se trató con diosmetina, el otro recibió ningún
tratamiento y se utilizó como control. Imágenes representativas mostraron diosmetina
crecimiento tumoral notablemente suprimida en ratones (Figura 1). 14 días después
del tratamiento, los ratones diosmetina tratados mostraron una reducción del 50% en
el crecimiento tumoral en comparación con ratones no tratados ( Figura 1 b), y se
observó la inhibición más significativa cinco días después del tratamiento ( Figura 1).

. Diosmetina inhibe la migración de ECs, la formación de tubos y microvasos

brotación

Para estudiar más a fondo el efecto inhibidor de diosmetina sobre la angiogénesis,

se realizaron ensayos de migración celular, ensayos de formación de tubo ECs en
Matrigel, y ex vivo ensayos de anillo aorta. En los ensayos de migración, se encontró
que diosmetina suprimió significativamente la migración de ECs de una manera
dosis-y dependiente del tiempo. Las células de control comenzaron a migrar hacia el
área objetivo, y casi completamente llenos después de 24 h. Sin embargo, 12 h
después de la cero, ECs tratados con 10 o 20 mg / ml diosmetina Had mi- se
expandieron menos que las células de control (35,0% y 22,9% vs. 61,9%), y la
disminución de la movilidad de la ECs tratados fue más evidente 24 h después de la
cero (células tratadas migraron 41,1% y 25,0%, las células de control migraron
90,4%) ( Figura 2 a, b). Además, in vitro ensayos de formación de tubo mostraron
que diosmetina interrumpido casi por completo la formación de túbulos de HUVEC (
Figura 2 discos compactos). Para determinar el efecto potencial de diosmetina en
microvasos que brotan ex vivo, hemos realizado ensayos de anillos aórticos de rata.
Hemos encontrado que las microvasos diosmetina inhibido que brotan de los anillos
aórticos, y reducción de la duración del brote en más de un 50% en comparación con
las de control ( Figura 2 e, f). Estos resultados indicaron que diosmetina tiene un
efecto angiogénico anti- contra la germinación y la formación de nuevos vasos.

La orientación reguladores de la apoptosis ha sido considerada una estrategia

prometedora para los diferentes tipos de cáncer, incluyendo melanoma. Estudios
anteriores han demostrado que diosmetina induce apoptosis de las células tumorales
por activació. En nuestro estudio, hemos confirimado que diosmetina provocó la
muerte de las células tumorales vía apoptosis. Diosmetina inhibió significativamente
la proliferación de células B16F10 y la migración de una manera dependiente de la
dosis. Diosmetina aumentó tanto la activación de la caspasa-3, caspasa un ejecutor
de la apoptosis, y la de su Down- PARP sustrato corriente de una manera
dependiente de la dosis. Los ensayos de inmunotinción confirmaron este resultado,
que muestra que el tratamiento diosmetina resultó en el aumento de expresión de
escindido con la caspasa-3 en los tejidos de melanoma en vivo

En conclusión, nuestros datos demuestran que diosmetina ejerce una actividad

anti-cáncer potente induciendo la regresión vascular, la normalización, y la
apoptosis celular, dando como resultado el retraso del crecimiento tumoral y la
inhibición de la formación de metástasis. Notablemente, porque diosmetina induce
normalización de la vasculatura del tumor, nuestros resultados sugieren
fuertemente que diosmetina es un adyuvante prometedor como fármaco de
tratamiento de combinación para mejorar la eficacia de la quimioterapia
convencional.
Anexos

Figura 1. Los efectos anticancerígenos de diosmetina

mediante la inhibición de la angiogénesis tumoral en
vivo.

(A) Las imágenes que muestran el desarrollo de tumores siete días después del tratamiento. Las
imágenes ampliadas demarcan masas tumorales de melanoma. Cada grupo: n = 10. (B, C)
Comparación de la tasa de crecimiento del volumen del tumor y el tumor. (D, E) Las imágenes
y la cuantificación de la densidad de vasos sangre siete días después del tratamiento en las
regiones peri- e intratumorales. (F, G) Imágenes y cuantificación de numero de vasos tumorales
con un tamaño> 100 m 14 días después del tratamiento en las regiones peri- y intratumorales.
Fig. 3. Diosmetina induce la normalización de los vasos del tumor y suprime la
metástasis espontánea a los pulmones y los LN inguinales. (B, A) Imágenes y
cuantificación de Ang-2 + área en las regiones peri y intratumoral. (C, D) Imágenes y
cuantificación de cobertura de la célula mural en los vasos del tumor. (E) imágenes que
muestran metástasis espontánea en los pulmones y secciones de pulmón teñidas H &
E son vistos regiones metastásicos bajo un aumento mayor (paneles inferiores). Las
flechas indican las colonias metastásicas. 100 × magnificación. (F, G) Imágenes y
cuantificación de citoqueratina + metástasis tumoral en los ganglios linfáticos
inguinales. Las líneas de puntos indican el margen de ganglio linfático inguinal.
Fig. 6. Diagrama esquemático del efecto anti-cáncer de diosmetina-tratamiento durante
la progresión tumoral.

Articulo tomado de la revista: Biomedicina y farmacoterapia 117 (2019) 10909

Biomedicina y Farmacoterapia Revista Página de inicio:
www.sevier.com/locate/biopha